CN107586721B

CN107586721B - 一种具有抗氧化活性的二苯甲酮类化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN107586721B
Application number: CN201610533271.2A
Authority: CN
Inventors: 王斌贵; 李洪雷; 孟令红; 李晓明
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2036-07-07
Also published as: CN107586721A

Abstract

本发明涉及微生物代谢产物技术领域，具体的说是一种具有抗氧化活性的二苯甲酮类化合物及其制备方法和应用。踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：(CGMCC 12224)。由踝节菌属真菌Talaromyces islandicus经发酵制备获得式I或式Ⅱ所示的化合物。该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：(CGMCC 12224)。经实验表明此类化合物具有较好的抗氧化活性，可应用于制备与抗氧化作用相关的药物、食品或化妆品添加剂等。

Description

一种具有抗氧化活性的二苯甲酮类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物代谢产物技术领域，具体的说是一种具有抗氧化活性的二苯甲酮类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

氧自由基是需氧生物细胞进行正常代谢时的副产物，机体每天摄入的氧气中有1％左右产生氧自由基。正常情况下人体氧自由基的产生和清除处于平衡状态，当平衡被打破时，人体内过量的氧自由基会导致生物膜过氧化、DNA和蛋白质损伤以及酶失活，导致人体衰老和肿瘤等多种疾病。目前市场上已有的抗氧化剂具有毒副作用大或不稳定等特点。因此，需要发展更多高效、低毒且稳定的天然抗氧化剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性的二苯甲酮类化合物及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种踝节菌属真菌，踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：(CGMCC 12224)。

一种二苯甲酮类化合物，二苯甲酮类化合物为式I或式Ⅱ所示的化合物

一种二苯甲酮类化合物的制备方法：

1)将踝节菌属真菌Talaromyces islandicus经发酵培养，发酵培养产物即为粗提物

所述踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：(CGMCC 12224)；

2)将步骤1)中的发酵产物粗提物进行减压硅胶柱层析，采用的洗脱液依次是梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至5:1(v/v)的氯仿-甲醇；

3)将步骤2)中以石油醚-乙酸乙酯2:1(v/v)梯度洗脱下的组分进一步以10:90至90:10(v/v)甲醇-水作为洗脱液进行反相硅胶柱层析；

收集甲醇-水40：60(v/v)洗脱得到的组分，先以梯度为100:1至30:1(v/v)的氯仿-甲醇作为洗脱液进行硅胶柱层析纯化，再用甲醇凝胶柱层析(以甲醇作为洗脱液)纯化，即得式I所示目标化合物1；

收集甲醇-水50：50(v/v)洗脱得到的组分，先以梯度为20:1至5:1(v/v)的石油醚-丙酮作为洗脱液进行硅胶柱层析纯化，再用甲醇凝胶柱层析(以甲醇作为洗脱液)纯化，即得式Ⅱ所示目标化合物2。

所述将踝节菌属真菌Talaromyces islandicus于大米固体培养基中发酵培养，发酵培养物用乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液进行浓缩，获得发酵产物。

所述培养条件为温度25℃，自然光照，培养时间30天。

一种二苯甲酮类化合物的应用，所述式I所示的化合物在制备与抗氧化作用相关的药物、与抗氧化作用相关食品或化妆品添加剂。

所述与抗氧化作用相关为以抗氧化作为主要功效的药物、食品或化妆品添加剂等。

本发明采用半数抑制浓度(IC₅₀)法测试化合物1和2对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)和ABTS(2,2'-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))两种自由基的清除活性，试验证明，化合物1和2对DPPH和ABTS两种自由基均具有较强的清除活性(表1)。

本发明所具有的优点：

本发明从采自青岛汇泉湾冈村凹顶藻中分离获得一株踝节菌属真菌Talaromycesislandicus，该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：(CGMCC 12224)，对其进行发酵培养、化学成分分离、结构鉴定与生物活性研究，发现了两个结构新颖的二苯甲酮类化合物，具有很好的抗氧化活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及抗氧化活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的抗氧化作用的药物或化妆品。

本发明涉及的化合物1和2可通过微生物发酵培养然后从发酵物中分离纯化获得。具体是以从采自青岛汇泉湾冈村凹顶藻中分离获得的一株内生真菌踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)，可以通过人工发酵培养经分离纯化获得化合物1和2。经实验表明化合物1和2对DPPH和ABTS两种自由基均具有较强的清除活性，分别优于阳性对照，其IC₅₀如表I所示。因此，化合物1和2可应用于制备与抗氧化作用相关的药物、食品或化妆品添加剂等。

表I抗氧化活性(IC50μg/ml)

化合物	1	2	BHT	抗坏血酸
					DPPH	1.33	6.92	16.27
ABTS	0.58	2.35		3.01

具体实施方式

以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。

在如下的实施例中所指的化合物1和2的化学结构分别是(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中的碳原子的标位)：

实施例1

踝节菌属真菌Talaromyces islandicus，该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：(CGMCC 12224)。该菌株在PDA平板上初期为青绿色菌丝体，后期菌丝体表面长出橘红色孢子。

实施例2

化合物1和2的发酵生产及分离精制：

1)发酵生产

生产菌的发酵培养：

菌种培养：踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)菌种以琼脂－麦芽膏培养基(琼脂－麦芽膏培养基为麦芽膏15g/L，琼脂20g/L，纯海水1000mL，pH 7.4-7.8)，4℃保存。取踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)接种到PDA平板上，在28℃培养箱中培养4天；

而后从上述平板上取大小为4cm²的菌丝体放入已灭菌盛有大米固体培养基(固体培养基为大米70g/瓶，蛋白胨0.3g/瓶，玉米浆0.1g/瓶，水100mL，pH 6.5)的容量为1000mL的锥形瓶中，静置室温培养30天，待用。

2)浸膏的获得

将上述于大米固体培养基中发酵培养获得固体发酵产物用乙酸乙酯超声提取3次，合并每次经乙酸乙酯超声提取的乙酸乙酯提取液，而后将合并的乙酸乙酯提取液经减压蒸馏得粗浸膏。

3)化合物的分离精制

将上述粗浸膏(80g)进行减压硅胶柱(200-300目)层析，并依次用梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至5:1(v/v)氯仿-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，洗脱流速均为200ml/min。

收集以石油醚-乙酸乙酯2:1(v/v)梯度洗脱下的组分进一步以10:90至90:10(v/v)甲醇-水作为洗脱液进行反相硅胶柱层析，流速1.5ml/min；

收集甲醇-水40：60(v/v)洗脱得到的组分，先以梯度为100:1至30:1(v/v)的氯仿-甲醇作为洗脱液进行硅胶柱层析纯化(流速3ml/min)，收集氯仿-甲醇70:1(v/v)洗脱得到的组分，再以甲醇作为洗脱液，流速为0.2ml/min进行甲醇凝胶柱层析纯化，即得式I所示目标化合物1(5.3mg)；

收集甲醇-水50：50(v/v)洗脱得到的组分，，经硅胶柱层析纯化，以20:1至5:1(v/v)的石油醚-丙酮洗脱(流速3ml/min)，收集石油醚-丙酮8:1(v/v)洗脱得到的组分，再用甲醇凝胶柱层析纯化后(以甲醇作为洗脱液，流速为0.2ml/min)，即得纯化式Ⅱ所示目标化合物2(120.0mg)。

其结构鉴定为如(I)所示，

该化合物具有以下理化和波谱特性：

化合物1，黄色透明胶状固体；UV(CH₃OH)λ_max(logε)203(4.25),209(4.33),226(4.42),266(4.26),383(3.82)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表Ⅱ；ESI质谱m/z 275[M+H]⁺,高分辨ESI质谱m/z 275.0912[M+H]⁺，C₁₅H₁₅O₅ ⁺计算值为275.0914。

化合物2，黄色片状结晶，熔点173-176℃；UV(CH₃OH)λ_max(logε)203(4.56),208(4.58),221(4.75),268(4.56),376(4.16)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表Ⅱ；ESI质谱m/z261[M+H]⁺,高分辨ESI质谱m/z 261.0755[M+H]⁺，C₁₅H₁₃O₅ ⁺计算值为261.0757。

表Ⅱ化合物1和2的核磁共振氢谱和碳谱(500MHz，1in CDCl₃and 2in DMSO-d₆)数据

a)本表信号归属基于DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC及HMBC图谱解析结果，碳信号的多重度利用DEPT方法确定

实施例3：用半数抑制浓度(IC₅₀)法检测式I所示化合物1和式Ⅱ所示化合物2对DPPH和ABTS两种自由基的清除活性

(Ⅰ)对DPPH自由基的清除活性：

DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在波长为517nm附近处有最大光吸收。加入抗氧化剂后，一部分自由基被清除，在517nm波长下吸光度变小，即抗氧化剂清除自由基能力越强，吸光度越小，借此来评价该物质的自由基清除活性。由于DPPH自由基结构简单，反应容易控制，受实验室环境影响较小，已广泛应用于化合物抗氧化活性评价。实验步骤如下：

1)准确称取0.5～1.0mg上述实施例制备获得化合物1和2，以此作为样品。将样品和阳性对照药BHT分别用甲醇溶液梯度稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL；

2)吸取100μL样品溶液加入到96孔板中，每个样品浓度做3个平行；

3)吸取100μL阳性对照药BHT溶液加入到96孔板中，每个样品浓度做3个平行。

4)同时向各浓度的样品中加入100μL DPPH(用甲醇配制，溶液浓度为0.16mmol/L)，混合均匀后室温暗处放置30分钟，在517nm处测定吸光度A_sample；

5)另吸取100μL各浓度的样品溶液，分别加入100μL甲醇溶液，在517nm处测定吸光度A_sampleblank；

6)吸取200μL甲醇溶液于517nm处测定吸光度A_blank；

7)100μL DPPH中加入100μL溶剂于517nm处测定吸光度A_control。

清除率％＝100－(A_sample－A_sampleblank)×100/(A_control－A_blank)

计算各浓度的抑制率后，利用软件计算IC₅₀值。

(Ⅱ)对ABTS自由基的清除活性：

ABTS是一种稳定的自由基，在734nm处有最大吸光值。ABTS自由基单独存在时非常稳定，当同时有抗氧化剂和氢供体存在时，这种自由基混合物的吸光值下降，其下降程度与该抗氧化物质的抗氧化能力相关，从而通过吸光值的下降程度反映抗氧化能力。实验步骤如下：

1)准确称取0.5～1.0mg上述实施例制备获得化合物1和2，以此作为样品。将样品和阳性对照药抗坏血酸梯度稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL；

2)配制ABTS反应液(7mmol/L ABTS，2.45mmol/L(NH₄)₂S₂O₈)于室温黑暗中静置12-16h后，用磷酸盐缓冲液(5mmol/L,pH 7.4)稀释至734nm的吸光值为0.70±0.02；

3)吸取60μL样品加入到96孔板中，每个样品浓度做3个平行；

4)吸取60μL阳性对照药抗坏血酸加入到96孔板中，每个样品浓度做3个平行；

5)向各浓度的样品中加入240mL ABTS反应液，30℃反应6min，测定734nm的吸光值，计算ABTS清除率

ABTS清除率％＝[A₀-(A_t-B)]/A₀×100％

其中，A₀为未加样的ABTS吸光度值；A_t为样品与ABTS反应后的吸光度值；B为样品空白的吸光度值。计算各浓度的抑制率后，利用软件计算IC₅₀值。

实验结果为化合物1和2分别对DPPH和ABTS两种自由基具有较强的清除活性，半数清除浓度IC₅₀优于阳性对照，如表I所示。

上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对DPPH和ABTS两种自由基具有较强的清除作用，它们可用于制备与抗氧化作用相关的药物、食品或化妆品添加剂等。

Claims

1.一种踝节菌属真菌，其特征在于：踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：CGMCC 12224。

2.一种二苯甲酮类化合物，其特征在于：二苯甲酮类化合物为式I或式Ⅱ所示的化合物

3.一种权利要求2所述的二苯甲酮类化合物的制备方法，其特征在于：

1)将踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)经发酵培养，发酵培养产物即为粗提物；

所述踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2016年3月17日，保藏号为：CGMCC 12224；

2)将步骤1)中的粗提物进行减压硅胶柱层析，采用的洗脱液依次是梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至5:1(v/v)的氯仿-甲醇；

收集甲醇-水40：60(v/v)洗脱得到的组分，先以梯度为100:1至30:1(v/v)的氯仿-甲醇作为洗脱液进行硅胶柱层析纯化，再用甲醇凝胶柱层析纯化，即得式I所示目标化合物1；

收集甲醇-水50：50(v/v)洗脱得到的组分，先以梯度为20:1至5:1(v/v)的石油醚-丙酮作为洗脱液进行硅胶柱层析纯化，再用甲醇凝胶柱层析纯化，即得式Ⅱ所示目标化合物2。

4.按权利要求3所述的二苯甲酮类化合物的制备方法，其特征在于：所述将踝节菌属真菌(Talaromyces islandicus)于大米固体培养基中发酵培养，培养后用乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液进行浓缩，获得粗提物。

5.一种按权利要求2所述的二苯甲酮类化合物的应用，其特征在于：所述式I所示的化合物在制备以抗氧化作为主要功效的药物、食品或化妆品添加剂中的应用。