CN106635820A - 一种高产茶褐素的黑曲霉菌株及其应用 - Google Patents

一种高产茶褐素的黑曲霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黑曲霉菌株及其应用，属于微生物技术领域，该菌株在发酵绿茶茶汤浓缩液时，具有高产茶褐素类物质的特点，可用于发酵制备茶褐素提取物，本发明还提供了该黑曲霉菌株在液态发酵绿茶浓缩液中的应用，能显著提高发酵液中茶褐素的产量。本发明保藏的黑曲霉可以应用于低档绿茶、粗老的茶叶及碎茶液态发酵，以制备茶褐素或直接制备高茶褐素速溶黑茶。同时，液态发酵生产工艺简单，发酵成本低，还可提高产品的安全性，适合于工业化大规模生产。

Description

一种高产茶褐素的黑曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高产茶褐素的黑曲霉菌株及应用。
背景技术
黑曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，其分生孢子头呈褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一，顶囊球形，双层小梗，多见于粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉又是重要的工业发酵微生物，在工业酶制剂、有机酸发酵方面应用广泛。可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等超过30种酶制剂。因为黑曲霉出色的蛋白质分泌能力，黑曲霉也被开发为通用的异源蛋白表达载体。黑曲霉是柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等的主要生产菌。
黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，赋予其在各种廉价的培养基上快速生长和发酵的能力，能够在极低的pH下保持旺盛的代谢活性因而不易染菌，能够适应工业发酵中粗放的物料和理化环境，这些品质使黑曲霉成为一种不可多得的工业生产宿主菌，即细胞工厂。
茶叶中的多酚类物质是茶叶中的重要活性物质，是茶叶中多种酚类化合物的总称，是茶树鲜叶的主要组成成分，其中以儿茶素为其主体成分，占多酚类物质总量的60％～80％，与茶的汤色、滋味和香气都有着密切的关系。
多酚类物质的水溶性产物主要是茶黄素、茶红素和茶褐素。茶褐素是儿茶素氧化聚合形成的一类结构十分复杂的产物的总称，在普洱茶的加工过程中80％的茶黄素和茶红素氧化、聚合，形成茶褐素，并使其含量成倍增加，从而使茶汤的收敛性和苦涩味降低。
研究表明茶褐素是黑茶中主要功能和特征性成分，其含量对黑茶品质至关重要。研究表明，茶褐素能够降低小鼠血清中血糖，胆固醇，甘油三酯含量，具有较强的清除自由基能力，具有抗氧化作用。对减肥降脂，预防高血脂症具有显著的作用。毒理学实验证明，茶褐素无毒安全。这些结果表明，茶褐素具有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的提供一种黑曲霉菌株，该菌株具有高产茶褐素的特点，可用于制备茶褐素提取物，该菌株已于2015年8月26日保藏于黑曲霉菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC)，该黑曲霉菌株的保藏号为：CGMCC No.11276，拉丁名：Aspergillus niger，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供了一种黑曲霉菌株在绿茶浓缩液液态发酵中的应用，不仅能提高绿茶浓缩液液态发酵茶褐素的产量。
本发明的黑曲霉菌株来源于室温放置1年的速溶绿茶粉中，具体分离方法为：在超净工作台中，取适量贮藏1年速溶绿茶粉溶于100mL无菌水中，置于温度37℃，转数150r/min的摇床中培养4天后，挑取培养液中的菌丝接种于PDA平板；将接种菌丝的PDA平板置于37℃恒温培养箱中培养4天，然后挑取单一的黑色孢子于查氏选择培养基中重复划线培养2-3次，进一步分离纯化，直至查氏选择培养基平板上只有单一霉菌为止。挑取该纯种的霉菌，接种至PDA平板上并置于37℃恒温培养箱中培养4天，得到本发明保藏的黑曲霉菌株。将菌种放置于4℃保存，备用。
菌落形态特征：菌落在20～30mm之间，菌落较大，地毯式蔓延生长，呈同心轮纹状，菌落正面黑色，边缘产生白色次生菌丝，反面灰黑色；在在显微镜下观察，菌丝有隔，在菌丝的壁厚而膨大成“足细胞”，产生分生孢子梗，无隔，梗顶端膨大成球状泡囊，即为分生孢子头。
同时，本发明还提供了一种高茶褐素速溶黑茶的制备方法，所述高茶褐素速溶黑茶的制备方法包括以下步骤：采用绿茶为原料，用水提取绿茶，并浓缩得到绿茶浓缩液；取保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的黑曲霉菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276，活化培养，调整黑曲霉孢子液浓度；混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，逐级扩大培养，得到2级或3级种子液并接种到绿茶浓缩液中；在温度26～37℃的条件下，有氧液态发酵6～12天，得到黑曲霉发酵液；膜过滤，干燥得到粉末状固体，即为高茶褐素速溶黑茶。
其中，所述用水提取绿茶具体条件为：温度60～95℃；料液比为1:8～1:25；提取时间20～60min。
所述绿茶浓缩液的可溶性固形物含量为2～15％。
所述活化培养的条件是：置于PDA平板培养基培养72-120h。
所述黑曲霉孢子液浓度调整为1.0～5.0×106个/mL。
所述2级或3级种子液接种到绿茶浓缩液中的接种量为2.0～12.0(v/v)％。
所述干燥得到粉末状固体优选冷冻干燥或减压干燥。
有益效果
其一，本发明解决了传统黑茶发酵过程中茶褐素含量不高，陈香味不被接受的问题。本发明制备的发酵液及速溶茶产品的茶褐素含量高，具有消除炎症，调整肠道细菌，调解血脂代谢，预防心脑血管疾病、抗癌、抗病毒等功效。具有良好的营养价值和养生保健作用。
其二，本发明从存放1年的速溶绿茶粉中分离出一种黑曲霉，并将此黑曲霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11276，此黑曲霉具有如下优势：第一：利用本保藏的黑曲霉菌种在绿茶发酵液中生长旺盛，适应液态发酵环境能力强，短时间内可以产生大量的茶褐素；第二，本发明保藏的黑曲霉发酵速度快，可快速达到发酵终点；第三，本发明分离的黑曲霉发酵绿茶提取液产色素能力明显高于其它黑曲霉，产品色泽红亮且品质明显好于其它黑曲霉发酵的产品；第四，绿茶浓缩液的发酵液中，茶褐素的总量较高。
其三，本发明保藏的黑曲霉可以应用于低档绿茶、粗老的茶叶及碎茶液态发酵，以制备茶褐素或直接制备高茶褐素含量的速溶黑茶，提高低档绿茶、粗老的茶叶及碎茶的经济价值；本发明的黑曲霉适应在发酵罐中进行的纯菌发酵，应用于绿茶提取液液态发酵，液态发酵可提高产品的安全性，生产工艺简单，发酵成本低，适合于工业化大规模生产。
附图说明：
图1为一种黑曲霉菌株菌落形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例子进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。
实施例1
一种黑曲霉菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276。
其中，本发明实施例所用的试剂均为分析纯，速溶绿茶粉由大闽食品(漳州)有限公司提供。
本发明的黑曲霉菌株来源于室温放置1年的速溶绿茶粉中，具体分离方法为：在超净工作台中，取适量贮藏1年速溶绿茶粉溶于100mL无菌水中，置于温度37℃，转数150r/min的摇床中培养4天后，挑取培养液中的菌丝接种于PDA平板；将接种菌丝的PDA平板置于37℃恒温培养箱中培养4天，然后挑取单一的黑色孢子于查氏选择培养基中重复划线培养2-3次，进一步分离纯化，直至查氏选择培养基平板上只有单一霉菌为止。挑取该纯种的霉菌，接种至PDA平板上并置于37℃恒温培养箱中培养4天，得到本发明保藏的黑曲霉菌株。将菌种放置于4℃保存，备用。
活化培养基制备：称取去皮马铃薯200g，切块，加1L水煮烂，用纱布过滤，然后在加热的条件下加入20g琼脂粉，继续加热并搅拌，待琼脂粉溶解完后，加入20g葡糖糖，搅拌均匀，冷却后再补足水分至1000mL，包扎，121℃灭菌20min，冷却后，倒入平板。
菌种活化：将保藏号为CGMCCNo.11276的黑曲霉菌株，在无菌条件下，于上述培养基制备的平板上划线，划线结束后将平板倒置于37℃的恒温培养箱中培养4天。
菌落形态：菌落在20～30mm之间,菌落较大,地毯式蔓延生长,呈同心轮纹状,菌落正面黑色,边缘产生白色次生菌丝,反面灰黑色；在在显微镜下观察,菌丝有隔,在菌丝的壁厚而膨大成“足细胞”,产生分生孢子梗,无隔,梗顶端膨大成球状泡囊,即为分生孢子头,菌落和孢子形态。菌落形态图见图1，其中，自左至右分别为菌落正面图、菌落背面图和菌落放大图。
实施例2
制备绿茶提取液：采用60～95℃水提取绿茶，其中，料液比为1:8～1:25；提取时间20～60min，过滤取滤液，得到绿茶提取液；
制备绿茶浓缩液：将绿茶提取液浓缩至可溶性固形物为2～15％，制得绿茶浓缩液。
将保藏号为CGMCCNo.11276的黑曲霉菌株，经过活化后，无菌条件下，置于绿茶浓缩液中液态发酵培养。
实施例3
一种用黑曲霉液态发酵制备含茶褐素茶汤发酵液的应用。
本实施例利用黑曲霉液态发酵方法得到茶褐素，具体方法如下：
1.制备绿茶提取液：采用60～95℃水提取绿茶，其中，料液比为1:8～1:25；提取时间20～60min，过滤取滤液，得到绿茶提取液；
2.浓缩绿茶提取液：将绿茶提取液浓缩至可溶性固形物为2～15％，制得绿茶浓缩液。
3.黑曲霉孢子液制备：取保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培养基培养72-120h，培养结束后取PDA平板培养基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并调整黑曲霉孢子浓度至1.0～5.0×106个/mL，得到黑曲霉孢子液。
4.种子液制备：混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，绿茶浓缩液：黑曲霉孢子液(v/v)＝10:1～50:1。于温度37℃，转数150r/min恒温摇床中培养48小时，获得1级种子液，用1级种子液和绿茶浓缩液混合，同样的条件培养，得到2级种子液，同理得到3级种子液。
5.接种：将2级或3级黑曲霉种子液接种到绿茶提取液中，接种量为2.0～12.0(v/v)％。
6.有氧液态发酵：控制发酵罐中绿茶发酵液温度26～37℃并通入无菌空气，发酵6～12天后停止发酵，得到黑曲霉茶汤发酵液。
发明人为测定本实施例得到的黑曲霉发茶汤酵液中的茶褐素含量，将黑曲霉发酵得到的发酵茶汤液干燥，得到黑曲霉发酵液干粉。同时，从菌种保藏中心购买了两株普通黑曲霉做对照，分别为普通黑曲霉1号和普通黑曲霉2号，发酵原料和发酵方法同本实施例，检测方法如下：茶褐素的测定方法
取1g黑曲霉发酵液干粉，用纯净水定容至100mL的容量瓶中，用移液管分别吸取25mL黑曲霉发酵溶液和25mL正丁醇放入125mL分液漏斗中，充分摇震3min，带分层后将水层(下层)放于50mL三角瓶中，取水层液2mL于25mL容量瓶中，分别加2mL饱和草酸溶液和6mL蒸馏水，再用95％乙醇定容至刻度，得溶液。空白对照的反应混合液中的水层液用蒸馏水代替，其他条件相同。用10mm比色皿在波长380nm处测吸光度。茶褐素(TB)浓度(g TB/100g茶粉)按下式计算：
m—1g茶粉中水分质量(g)；
0.72—发酵前与发酵后，茶粉与水的比例变化的校正系数；
7.06—为同等操作条件下的换算系数。
测试结果如下：
表1不同菌种发酵不同时间茶汤茶褐素的变化
由上述数据可知，本发明保藏的菌株发酵绿茶浓缩液，可以快速发酵产生茶褐素，增加发酵液的活性成分。
实施例4
一种用黑曲霉液态发酵茶浓缩液制备茶褐素的应用
本实施例利用黑曲霉液态发酵方法得到茶褐素，具体方法如下：
1.制备绿茶提取液：采用60～95℃水提取绿茶，其中，料液比为1:8～1:25；提取时间20～60min，过滤取滤液，得到绿茶提取液；
2.浓缩绿茶提取液：将绿茶提取液浓缩至可溶性固形物为2～15％，制得绿茶浓缩液。
3.黑曲霉孢子液制备：取保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培养基培养72-120h，培养结束后取PDA平板培养基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并调整黑曲霉孢子浓度至1.0～5.0×106个/mL，得到黑曲霉孢子液。
4.种子液制备：混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，绿茶浓缩液：黑曲霉孢子液(v/v)＝10:1～50:1。于温度37℃，转数150r/min恒温摇床中培养48小时，获得1级种子液，用1级种子液和绿茶浓缩液混合，同样的条件培养，得到2级种子液，同理得到3级种子液。
5.接种：将2级或3级黑曲霉种子液接种到绿茶提取液中，接种量为2.0～12.0(v/v)％。
6.有氧液态发酵：控制发酵罐中绿茶发酵液温度26～37℃并通入无菌空气，发酵6～12天后停止发酵，得到黑曲霉发酵液。
7.茶褐素的制备：将发酵后的液体过滤网去除浑浊物，离心，得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，取滤液Ⅰ，加入4倍95％食用乙醇溶液搅拌后静置3小时，离心过滤，得到滤渣Ⅱ和滤液Ⅱ，其中滤渣Ⅱ为茶褐素粗提物；再用20％(v/v)酒精水溶液溶解茶褐素粗提物，得到的溶液经浓缩和干燥工艺提纯后即得茶褐素。
实施例5
本发明的实施例均使用保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的黑曲霉菌株，其保藏号为：CGMCCNo.11276。实施例中所用的试剂均为分析纯，绿茶和速溶绿茶粉均由大闽食品(漳州)有限公司提供。
一种高茶褐素速溶黑茶及其制备方法，具体方法如下：
1.制备绿茶提取液：采用80℃水提取绿茶，其中，料液比为1:15；提取时间40min，过滤取滤液，得到绿茶提取液；
2.浓缩绿茶提取液：将绿茶提取液浓缩至可溶性固形物为8％，制得绿茶浓缩液。
3.黑曲霉孢子液制备：取保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培养基培养100h，培养结束后取PDA平板培养基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并调整黑曲霉孢子浓度至3.0×106个/mL，得到黑曲霉孢子液。
4.种子液制备：混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，绿茶浓缩液：黑曲霉孢子液(v/v)＝30:1。于温度37℃，转数150r/min恒温摇床中培养48小时，获得1级种子液，用1级种子液和绿茶浓缩液混合，同样的条件培养，得到2级种子液，同理得到3级种子液。
5.接种：将2级或3级黑曲霉种子液接种到绿茶提取液中，接种量为8.0(v/v)％。
6.有氧液态发酵：控制发酵罐中绿茶发酵液温度37℃并通入无菌空气，发酵10天后停止发酵，得到黑曲霉发酵液。
7.膜过滤：采用过滤网先去除菌丝等浑浊物，再用0.22微米除菌膜过滤，获得澄清无菌的黑曲霉发酵液。
8.干燥：将膜过滤后的黑曲霉发酵液进行干燥处理，得到粉末状固体，即为高茶褐素速溶黑茶。
测定本实施例得到的高茶褐素速溶黑茶茶褐素含量的检测方法同上：
表2不同菌种发酵不同时间茶汤茶褐素的变化
表3本实施例高茶褐素速溶黑茶含量表
茶褐素％ 游离氨基酸含量mg/g 碳水化合物含量mg/g 红度
25.31 120.38 116.57 43.6
本发明的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量高，具有消除炎症，调整肠道细菌，调解血脂代谢，预防心脑血管疾病、抗癌、抗病毒等功效。速溶茶中具有很好的养生保健作用。
实施例6
一种高茶褐素速溶黑茶及其制备方法，具体方法如下：
1.制备绿茶提取液：采用60℃水提取绿茶，其中，料液比为1:8；提取时间20min，过滤取滤液，得到绿茶提取液；
2.浓缩绿茶提取液：将绿茶提取液浓缩至可溶性固形物为15％，制得绿茶浓缩液。
3.黑曲霉孢子液制备：取保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培养基培养72h，培养结束后取PDA平板培养基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并调整黑曲霉孢子浓度至1.0×106个/mL，得到黑曲霉孢子液。
4.种子液制备：混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，绿茶浓缩液：黑曲霉孢子液(v/v)＝10:1。于温度37℃，转数150r/min恒温摇床中培养48小时，获得1级种子液，用1级种子液和绿茶浓缩液混合，同样的条件培养，得到2级种子液，同理得到3级种子液。
5.接种：将2级或3级黑曲霉种子液接种到绿茶提取液中，接种量为2.0(v/v)％。
6.有氧液态发酵：控制发酵罐中绿茶发酵液温度26℃并通入无菌空气，发酵6天后停止发酵，得到黑曲霉发酵液。
7.膜过滤：采用过滤网先去除菌丝等浑浊物，再用0.22微米除菌膜过滤，获得澄清无菌的黑曲霉发酵液。
8.冷冻干燥：将膜过滤后的黑曲霉发酵液进行冷冻干燥处理，得到粉末状固体，即为高茶褐素速溶黑茶。
经检测：本实施例得到的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量为17.3％。
实施例7
一种高茶褐素速溶黑茶及其制备方法，具体方法如下：
1.制备绿茶提取液：采用95℃水提取绿茶，其中，料液比为1:25；提取时间60min，过滤取滤液，得到绿茶提取液；
2.浓缩绿茶提取液：将绿茶提取液浓缩至可溶性固形物为2％，制得绿茶浓缩液。
3.黑曲霉孢子液制备：取保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株，保藏号为：CGMCCNo.11276。置于PDA平板培养基培养120h，培养结束后取PDA平板培养基上的黑曲霉孢子，溶解于水中并调整黑曲霉孢子浓度至5.0×106个/mL，得到黑曲霉孢子液。
4.种子液制备：混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，绿茶浓缩液：黑曲霉孢子液(v/v)＝50:1。于温度37℃，转数150r/min恒温摇床中培养48小时，获得1级种子液，用1级种子液和绿茶浓缩液混合，同样的条件培养，得到2级种子液，同理得到3级种子液。
5.接种：将2级或3级黑曲霉种子液接种到绿茶提取液中，接种量为12.0(v/v)％。
6.有氧液态发酵：控制发酵罐中绿茶发酵液温度37℃并通入无菌空气，发酵12天后停止发酵，得到黑曲霉发酵液。
7.膜过滤：采用过滤网先去除菌丝等浑浊物，再用0.22微米除菌膜过滤，获得澄清无菌的黑曲霉发酵液。
8.减压干燥：将膜过滤后的黑曲霉发酵液在20～50kpa的气压下进行减压干燥处理，得到粉末状固体，即为高茶褐素速溶黑茶。
经检测：本实施例得到的高茶褐素速溶黑茶的茶褐素含量为25.4％。

Claims (10)

1.一种高产茶褐素的黑曲霉菌株，其特征在于：所述黑曲霉菌株的保藏号为：CGMCCNo.11276。
2.一种高产茶褐素的黑曲霉菌株的新用途，其特征在于：所述黑曲霉菌株在绿茶浓缩液液态发酵中用于制备茶褐素。
3.一种高产茶褐素的黑曲霉菌株的新用途，其特征在于：所述黑曲霉菌株用于制备含茶褐素的茶汤发酵液。
4.一种高产茶褐素的黑曲霉菌株的新用途，其特征在于：所述黑曲霉菌株用于制备高茶褐素速溶黑茶。
5.一种高茶褐素速溶黑茶的制备方法，其特征在于，所述高茶褐素速溶黑茶的制备方法包括以下步骤：采用绿茶为原料，用水提取绿茶，并浓缩得到绿茶浓缩液；取保藏在国家微生物保存中心的黑曲霉菌株，保藏号为：CGMCC No.11276，活化培养，调整黑曲霉孢子液浓度；混合绿茶浓缩液与黑曲霉孢子液，逐级扩大培养，得到2级或3级种子液并接种到绿茶浓缩液中；在温度26~37℃的条件下，有氧液态发酵6~12天，得到黑曲霉发酵液；膜过滤，干燥得到粉末状固体，即为高茶褐素速溶黑茶。
6.根据权利要求5所述的高茶褐素速溶黑茶的制备方法，其特征在于：所述用水提取绿茶具体条件为：温度60~95℃；料液比为1:8~1:25；提取时间20~60min。
7.根据权利要求5所述的高茶褐素速溶黑茶的制备方法，其特征在于：所述活化培养的条件是：置于PDA平板培养基培养72-120h。
8.根据权利要求5所述的高茶褐素速溶黑茶的制备方法，其特征在于：所述黑曲霉孢子液浓度调整为1.0~5.0×106个/mL。
9.根据权利要求5所述的高茶褐素速溶黑茶的制备方法，其特征在于：所述2级或3级种子液接种到绿茶浓缩液中的接种量为2.0~12.0(v/v)%。
10.根据权利要求5所述的高茶褐素速溶黑茶的制备方法，其特征在于：所述干燥得到粉末状固体优选冷冻干燥或减压干燥。
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