CN107893033B - 烟曲霉sqh4及在生物转化法制备花旗松素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种烟曲霉SQH4及在生物转化法制备花旗松素中的应用，以落新妇苷为底物，烟曲霉SQH4发酵制备发酵液为催化剂，在底物投料浓度为3g/L时，花旗松素的转化得率为92.3％。本发明的技术优势有：相比于从植物中提取花旗松素，解决了生产原料紧缺的问题；相比于酸水解落新妇苷法，具有转化专一性好，产物得率高的优点。本发明是一种可选的花旗松素生产方法，工艺具有生产成本低、转化率高、环境污染小等优点。

Description

烟曲霉SQH4及在生物转化法制备花旗松素中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体地说，是关于一种以落新妇苷为原料，生物转化法制备花旗松素的方法。
(二)背景技术
花旗松素(taxifolin)，又名二氢槲皮素(dihydroquercetin)、黄杉素、紫杉叶素，属一种二氢黄酮醇类化合物，化学名为3,5,7,3',4'-五羟基黄烷酮(3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavanone)，CAS号为480-18-2，分子式为C15H12O7，分子量为304.25，结构式见图1。
近年来的研究表明花旗松素有多种药理活性，如具有非常强的抗氧化活性；降低血脂、血粘度、血压和血糖，保护红细胞避免氧化导致的溶血，可以用于心血管疾病和糖尿病的治疗；对四氯化碳引起的肝损伤有保护作用等。动物实验表明花旗松素具有良好的降血压功效，保护缺血、缺氧对脑组织的损伤。此外，花旗松素还具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗突变、抗肿瘤等活性。花旗松素无毒、无过敏、无致畸和致突变作用，可用作药品或食品添加剂。如在俄罗斯，花旗松素已作为一种安全的食品添加剂(抗氧剂)被广泛用于植物油、动物油、奶类制品、肉类制品等食品的保鲜，还应用于功能性饮料及相应的食品。2017年2月14日，欧盟食品安全局就落叶松提取物(花旗松素)作为新资源食品发布意见，批准富含花旗松素的落叶松提取物用于非酒精饮料、酸奶和巧克力糖果等。
花旗松素在紫杉、黄杉、落叶松等植物中含量较高，纹母树、野黑樱等植物中也有极少量存在。花旗松素的直接来源可以从这些植物中提取，但因紫杉和黄杉已被列入全球濒危树种禁止采伐，而落叶松只分布在俄罗斯西伯利亚东部、蒙古国东北部、中国东北地区和朝鲜，且生长周期较长，所以可利用生产花旗松素的资源极为稀少和匮乏。现有的化学合成工艺存在路线复杂、操作难度大、原料毒性大或收率低等问题，还不具备工业化应用条件。目前全球年产量不足20吨，而中国产量仅有5吨。可以看出，花旗松素的市场需求较大，但缺乏经济有效的生产方法。
落新妇苷(astilbin)，即花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(taxifolin-3-O-α-L-rhamnoside)，CAS号为29838-67-3，分子量为450.41，分子式为C21H22O11。落新妇苷在土茯苓、紫荆花、肿节风等植物中含量较高，如在土茯苓中，最高含量可以达到3.68％(中国发明专利201210542691.9)。相比于花旗松素，落新妇苷的生产原料丰富，成本低。所以，如以落新妇苷为原料，水解切除鼠李糖残基而转化为花旗松素，则是一条可行的生产方法。目前国内已有以落新妇苷为原料，采用酸水解的方法制备花旗松素的专利申请(中国发明专利201610114644.2)，落新妇苷的水解率达到89.7％，但该专利未说明相对于底物的花旗松素得率。较高的落新妇苷水解率不代表可以获得较高的花旗松素得率，落新妇苷也可能被水解成其他产物。产物得率低是天然产物酸水解法制备的常见问题，母核结构容易被破坏，产生其他副产物，导致产物得率低。
为了开发一种经济有效的花旗松素生产方法，本发明采用生物转化落新妇苷为花旗松素(反应式见图1)，筛选获得了一株转化能力高、专一性好的微生物菌株，经培养获得含糖苷酶的菌体，以含湿菌体的发酵液或将湿菌体悬浮于缓冲液中反应体系中，将落新妇苷转化为花旗松素，可以获得较高的转化得率。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—烟曲霉(Aspergillusfumigatus)SQH4，及其在转化落新妇苷制备花旗松素中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—烟曲霉(Aspergillus fumigatus)SQH4，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60239，保藏日期2017年9月15日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
本发明所述烟曲霉SQH4，是从中药材土茯苓的富集培养物中，经过筛选获得的专一性菌株。所述烟曲霉SQH4的形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃培养2d，即长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，后变为灰绿色；菌落表面产生大量粉状分生孢子，分生孢子穗圆筒形，呈深浅不同的绿色，分生孢子球形，粗糙，绿色。
所述烟曲霉SQH4的rDNA ITS序列(内源转录间隔区，Internally transcribedspacer)如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种所述烟曲霉SQH4在生物转化落新妇苷制备花旗松素中的应用，具体所述的应用为：以烟曲霉SQH4经发酵培养后的发酵液或发酵液离心收集的湿菌体用pH值6.0～6.5磷酸缓冲液悬浮制成的菌悬液为生物催化剂和反应介质，以落新妇苷为底物，以甲醇为助溶剂构成转化体系，于30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，转化液经分离获得花旗松素。
进一步，本发明所述的转化体系为下列之一：(1)由含湿菌体的发酵液、落新妇苷和甲醇构成；(2)将发酵液过滤，取湿菌体悬浮于等同发酵液体积、pH 6.0～6.5的磷酸缓冲液中，再加入落新妇苷和甲醇构成。所述转化体系中湿菌体的用量以菌体干重计为3～4g/L。
进一步，转化体系中所述底物落新妇苷的终浓度为0.01～3g/L(优选3g/L)，所述助溶剂甲醇的体积终浓度为0.1％～1％(优先选用甲醇溶解落新妇苷，然后再加入转化体系，优选1％)。
进一步，所述的转化反应条件为：在30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化24～48h。
进一步，所述发酵液按如下方法制备：将烟曲霉SQH4接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖10～20g/L，蛋白胨5～8g/L，酵母粉3～5g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0～7.0。
所述的烟曲霉SQH4菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述烟曲霉SQH4发酵培养方法为：
(1)活化培养：将烟曲霉SQH4接种于PDA平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3d，获得烟曲霉SQH4孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后烟曲霉SQH4孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.5。
(3)发酵培养：用步骤(1)活化培养后烟曲霉SQH4孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度3％～6％的接种量接入发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，获得发酵液。所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖10～20g/L，蛋白胨5～8g/L，酵母粉3～5g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0～7.0。
进一步，优选所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖20g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH6.0。
本发明所述的花旗松素分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取1～3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，加入原转化体系1/3～1/5体积的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后)，即得花旗松素。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用烟曲霉SQH4发酵获得生物催化剂，落新妇苷为底物制备花旗松素的方法。以落新妇苷为底物，烟曲霉SQH4发酵制备发酵液为催化剂，在底物投料浓度为3g/L时，花旗松素的转化得率为92.3％。本发明的技术优势有：相比于从植物中提取花旗松素，解决了生产原料紧缺的问题；相比于酸水解落新妇苷法，具有转化专一性好，产物得率高的优点。本发明是一种可选的花旗松素生产方法，工艺具有生产成本低、转化率高、环境污染小等优点。
(四)附图说明
图1落新妇苷生物转化为花旗松素的化学反应式；
图2HPLC法分析花旗松素质量浓度的标准曲线；
图3烟曲霉SQH4于PDA平板上培养3d的照片；
图4落新妇苷和花旗松素的HPLC分析图谱，A为标准品落新妇苷(0.3g/L)和标准品花旗松素(0.2g/L)的HPLC分析图谱；B为未加落新妇苷的空白转化对照的HPLC分析图谱；C为落新妇苷经烟曲霉SQH4生物转化0h的HPLC分析图谱；D为落新妇苷经烟曲霉SQH4生物转化24h的HPLC分析图谱(实施例4样品)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1转化菌种的分离与筛选
将中药材土茯苓粉碎过40目筛，60g土茯苓粉于三角瓶中，加入少量无菌水润湿，于28℃恒温培养3d。然后取出1g左右用100mL无菌水制成悬液，稀释1×106倍后涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养3d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3d，得孢子丰富的菌株5株(菌株编号见表1)，保存于4℃冰箱中备用。
接种环分别挑取上述各个菌株的平板培养基上的孢子2环，接种到100mL初始发酵培养基中(250mL三角瓶装)，于28℃、200r/min振荡培养2d后，加入1mg落新妇苷溶于0.1mL甲醇，使转化体系中落新妇苷浓度为10mg/L。转化体系于30℃、200r/min恒温振荡48h。转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中花旗松素的浓度。
HPLC分析不同菌株发酵转化液中的花旗松素浓度，计算花旗松素的转化得率，结果见表1，由此比较不同菌株产酶转化落新妇苷为花旗松素的能力。5个菌株中，编号为SQH4的霉菌转化落新妇苷生成花旗松素得率最高，转化液中花旗松素的浓度为2.31mg/L，转化得率为34.2％。
表1不同菌株转化落新妇苷生成花旗松素的浓度和得率
Figure BDA0001478786200000051
所述的中药材土茯苓(Smilacis Glabrae)，是百合科植物光叶菝葜(Smilaxglabra Roxb.)的干燥根茎，购自杭州市某中药房。
所述的PDA平板培养基，按以下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取20g，加自来水100mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到100mL，再加入葡萄糖2g和琼脂2g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min，凝固前倒入无菌培养皿，每皿20～25mL。
所述的初始发酵培养基按如下组成和方法配制：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH7.0。250mL的三角瓶装100mL初始发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的HPLC分析方法为：LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Alltima C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温。流动相为甲醇和0.1％(v/v)甲酸水溶液按体积比48:52混合，等度洗脱，流速0.8mL/min。检测波长290nm，进样量10μL。由相同分析条件下的标准品花旗松素质量浓度-峰面积标准曲线(图2)，计算出转化样品中的花旗松素质量浓度。
所述的花旗松素转化得率按以下公式计算：
Figure BDA0001478786200000061
式中，304.25为花旗松素的分子量，450.41为落新妇苷的分子量。
实施例2：菌株SQH4转化稳定性验证
以菌株SQH4为转化菌种，经过种子扩大培养，在100mL摇瓶发酵规模下制备发酵液，用含菌体的发酵液转化落新妇苷，验证菌种的转化稳定性，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的菌株SQH4斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于28℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后菌株SQH4孢子2次至50mL种子培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为2.45g/L的种子液。所述种子培养基组成为：蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.5。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度3％(即3mL)的接种量接种至100mL初始发酵培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为3.03g/L的发酵液。1mg的落新妇苷溶于0.1mL甲醇后加入发酵液中，使转化体系中落新妇苷的浓度为10mg/L、湿菌体用量以干重计为3.03g/L。转化体系于30℃、200r/min恒温振荡48h。所述的初始发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中花旗松素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，菌株SQH4发酵液转化落新妇苷，重复3批次实验，转化样品中花旗松素平均浓度为2.90mg/L，转化得率平均为42.9％，3批次实验结果无显著性差异，表明菌株SQH4发酵转化落新妇苷为花旗松素的性能稳定。
实施例3：菌株SQH4的分类鉴定
将SQH4菌株接于PDA平板培养基，28℃条件下培养2d，即长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，后变为灰绿色；产生大量粉状分生孢子，分生孢子穗圆筒形，呈深浅不同的绿色，分生孢子球形，粗糙，绿色。
将菌株SQH4交由生工生物工程(上海)有限公司进行rDNA ITS测序，测得序列大小为574bp，具体序列(SEQ ID NO:1所示)如下：
5'-CCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAGGCCTTGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGCAGTCTGAGTTGATTATCGTAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCCTCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCTGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACACCCAACTTTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA-3'。
将上述序列与Genbank中的序列进行BLAST比对，结果表明该菌株SQH4与4株烟曲霉(Aspergillus fumigatus)典型菌株和2株新椭孢曲霉(Aspergillus neoellipticus)典型菌株同源性相似度达到100％。绘制的SQH4菌株与曲霉属的典型菌株系统发育树，表明SQH4菌株与烟曲霉亲缘关系更近，因此可以判断菌株SQH4是1株烟曲霉，命名为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)SQH4。该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60239，保藏日期2017年9月15日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
实施例4：优选转化工艺
以烟曲霉SQH4为转化菌种，在实施例2的基础上，优化了发酵培养基中蔗糖、蛋白胨和酵母浸出粉的浓度，提高了底物浓度等，花旗松素的转化得率显著提高，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的烟曲霉SQH4斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后烟曲霉SQH4孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为2.57g/L的种子液。所述种子培养基组成组成和制备方法同实施例2。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度6％(即6mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2d后，得干菌体浓度为3.95g/L的发酵液。0.3g落新妇苷溶于1mL甲醇后加入100mL发酵液中，使转化体系中落新妇苷的浓度为3g/L、湿菌体用量以干重计为3.95g/L(转化体系体积按100mL计)。转化体系于35℃、250r/min恒温振荡24h。所述的发酵培养基终浓度组成为：蔗糖20g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，再用甲醇稀释200倍后用HPLC分析样品中花旗松素的浓度。同时以未加底物的烟曲霉SQH4培养作为空白对照，HPLC分析图谱见图4所示。
HPLC分析表明，按本实施例方法，用烟曲霉SQH4菌株发酵液转化落新妇苷，转化样品中花旗松素浓度为1.87g/L，转化得率为92.3％。
实施例5：菌体缓冲液体系转化
以烟曲霉SQH4为转化菌种，在实施例4的基础上，发酵液经过滤后收获菌体，悬浮于磷酸缓冲液中转化落新妇苷，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的烟曲霉SQH4斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环取步骤(1)活化培养后烟曲霉SQH4孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为2.42g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2；
(3)步骤(2)种子液以体积浓度6％(即6mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2d后，得干菌体浓度为3.87g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤，收集湿菌体，用pH 6.0的磷酸缓冲液100mL重新悬浮菌体于一只250mL三角瓶中，再加入0.3g落新妇苷溶于1mL甲醇的溶液，使转化体系中落新妇苷的浓度为3g/L、湿菌体用量以干重计为3.87g/L(转化体系体积按100mL计)。转化体系于35℃、250r/min恒温振荡24h。所述的发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
(4)转化反应结束后，转化液用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释200倍后用HPLC分析样品中花旗松素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，用烟曲霉SQH4菌株发酵液转化落新妇苷，转化样品中花旗松素浓度为1.82g/L，转化得率为89.8％。相比于实施例4方法，转化得率略有降低，但因菌体重悬于缓冲液中，体系中杂质减少，有利于后续产物的分离。
所述的磷酸缓冲液的配制方法：称取NaH2PO4·2H2O 31.2g，用去离子水定容至1000mL(A液)；称取Na2HPO4·2H2O 35.6g，用去离子水定容至1000mL(B液)，A液和B液的体积按下表比例混合可得pH 6.0～6.5的磷酸缓冲液100mL。
pH A液体积(mL) B液体积(mL)
6.0 87.7 12.3
6.1 85.0 15.0
6.2 81.5 18.5
6.3 77.5 22.5
6.4 73.5 26.5
6.5 68.5 31.5
实施例6：工艺放大与花旗松素的分离
在实施例5的基础上，发酵体系放大到250mL，制备菌体悬浮于缓冲液中进行落新妇苷的生物转化，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的烟曲霉SQH4斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后烟曲霉SQH4孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为2.60g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2；
(3)步骤(2)种子液以体积浓度6％(即15mL)的接种量接种至250mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d后，得干菌体浓度为3.92g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤，收集湿菌体，用pH 6.5的磷酸缓冲液250mL重新悬浮菌体于一只1L三角瓶中，再加入0.75g落新妇苷溶于2.5mL甲醇，使转化体系中落新妇苷的浓度为3g/L、湿菌体用量以干重计为3.92g/L(转化体系体积按250mL计)。转化体系于35℃、250r/min恒温振荡24h。所述的发酵培养基终浓度组成同实施例4，1L的三角瓶装250mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)转化反应结束后，转化液用250mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入50mL甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加10mL甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后得0.554g干燥品。
称取步骤(4)制备的花旗松素样品1mg溶解于5mL甲醇中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中花旗松素的浓度。分析结果表明，按本实施例方法，制备的花旗松素转化得率为90.6％，纯度为82.8％。
序列表
<110> 浙江工业大学、舟山市食品药品检验检测研究院
<120> 烟曲霉SQH4及在生物转化法制备花旗松素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 574
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 1
cctgcggaag gatcattacc gagtgagggc cctctgggtc caacctccca cccgtgtcta 60
tcgtaccttg ttgcttcggc gggcccgccg tttcgacggc cgccggggag gccttgcgcc 120
cccgggcccg cgcccgccga agaccccaac atgaacgctg ttctgaaagt atgcagtctg 180
agttgattat cgtaatcagt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc cggcatcgat 240
gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgagt 300
ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattg 360
ctgccctcaa gcacggcttg tgtgttgggc ccccgtcccc ctctcccggg ggacgggccc 420
gaaaggcagc ggcggcaccg cgtccggtcc tcgagcgtat ggggctttgt cacctgctct 480
gtaggcccgg ccggcgccag ccgacaccca actttatttt tctaaggttg acctcggatc 540
aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaa 574

Claims (8)

1.一种烟曲霉（Aspergillus fumigatus）SQH4，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No: 60239，保藏日期2017年9月15日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
2.一种权利要求1所述烟曲霉SQH4在生物转化落新妇苷制备花旗松素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以烟曲霉SQH4经发酵培养后的发酵液或发酵液离心收集的湿菌体用pH6.0~6.5磷酸缓冲液悬浮制成的菌悬液为生物催化剂和反应介质，以落新妇苷为底物，以甲醇为助溶剂构成转化体系，于30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，转化液经分离获得花旗松素。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中湿菌体用量以干重计为3～4g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中所述底物落新妇苷的终浓度为0.01～3 g/L，所述甲醇的体积终浓度为0.1%～1%。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：将烟曲霉SQH4接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250 r/min恒温振荡条件下培养2～3 d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖10～20 g/L，蛋白胨5～8 g/L，酵母粉3～5 g/L，KH2PO45 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0～7.0。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述烟曲霉SQH4发酵培养方法为：
（1）活化培养：将烟曲霉SQH4接种于PDA平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3 d，获得烟曲霉SQH4孢子；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，溶剂为自来水，pH自然；
（2）种子扩大培养：挑取步骤（1）活化培养后烟曲霉SQH4孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250 r/min恒温振荡条件下培养2～3 d，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，KH2PO4 5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.5；
（3）发酵培养：用步骤（1）活化培养后烟曲霉SQH4孢子，或步骤（2）制备的种子液按体积浓度3%～6%的接种量接入发酵培养基，于28～30℃、200～250 r/min恒温振荡条件下培养2～3 d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖10～20 g/L，蛋白胨5～8 g/L，酵母粉3～5 g/L，KH2PO4 5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0～7.0。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO4 5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O1 g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0。
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