CN101358173A - 黑曲霉zjut712及其在固态发酵炮制牛蒡子中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株新的β－葡萄糖苷酶产生菌——黑曲霉ZJUT712，及其在固态发酵炮制牛蒡子中的应用。黑曲霉(Aspergillusniger)ZJUT712，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2594，保藏日期：2008年7月15日。本发明有益效果主要体现在：提供了一株可供固态发酵法炮制牛蒡子的新菌株——β－葡萄糖苷酶产生菌黑曲霉ZJUT712；利用本发明方法固态发酵炮制牛蒡子，牛蒡子苷转化为牛蒡子苷元的摩尔产率可以达到93.0％，牛蒡子的有效成分大幅度提高，促使牛蒡子摄入人体快速起效；炮制工艺简单、成本低廉、节能环保、适用于大规模推广。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株新的β-葡萄糖苷酶产生菌——黑曲霉(Aspergillusniger)ZJUT712，及其在固态发酵炮制牛蒡子中的应用。
(二)背景技术
牛蒡子是菊科植物牛蒡(Arctium Lappa L.)的干燥成熟果实。牛蒡子苷及牛蒡子苷元是牛蒡子发挥药效的重要成分，具有利尿、泻下，扩张血管及抑制K+挛缩，降血压，抗癌抗突变，抗肾炎活性，抗血小板聚集，抗老年性痴呆，治疗急性肾炎和肾病综合症等作用。
牛蒡子的主要药效功能与牛蒡子苷的体内代谢过程具有相关性，牛蒡子苷(分子式：C27H34O11，分子量：534.55)在消化道中，被肠道菌转变为苷元的脱甲基化合物，此脱甲基化合物在肝脏儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的作用下恢复为苷元，牛蒡子苷元被血液输送到各个器官发挥作用。牛蒡子苷元(分子式：C21H24O6，分子量：372.41)是可以直接被人体吸收发挥药效的物质。将牛蒡子苷在体外转化为牛蒡子苷元有助于提高牛蒡子的药效。
β-葡萄糖苷酶(beta-Glucosidase)系统名称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase；EC 3.2.1.21)。广泛存在于植物、酵母、曲霉菌、木酶菌及细菌体内。β-葡萄糖苷酶可以催化牛蒡子苷转化为牛蒡子苷元。所以利用产β-葡萄糖苷酶菌株固态发酵法炮制牛蒡子可以有效提高牛蒡子有效成分的溶出率。
发酵中药技术是现代生物技术和中药研究的完美结合，依靠微生物发酵来生产发酵中药为中药的发展开辟了新空间。微生物可以利用中药中的氨基酸、蛋白质、微量元素、维生素等多种营养成分，并将苷类物质降解生成的糖作为营养物质，进行自我繁殖。对微生物来说，若以苷的糖为碳源，就相适应地被诱导产生出用于分解该种苷类的酶。微生物在发酵过程中可以分泌几十种胞外酶到培养基中，而微生物进行生理活动所产生的胞内酶更是成百上千，这些丰富而强大的酶系是使中药发生化学反应的物质基础，可将药物成分分解转化形成新成分。通过微生物生长代谢和生命活动来炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。苷类中药经微生物发酵转化，苷元含量显著提高，中药原有组织结构变得较疏松，利于中药中间体——苷元的分离提取。同时使中药中间体的生产工艺简化、成本降低、产值增加，还可利用得到的中药中间体制备新剂型——注射剂等，使中药更易于临床应用。
临床上，牛蒡子多用炮制品。考察牛蒡子炮制的历史沿革发现牛蒡子的传统炮制方法有单炒、酒炒、酒拌蒸、隔纸炒等方法，以清炒为主流。
微生物发酵法炮制牛蒡子是现代生物技术与传统中药炮制技术相结合的产物。随着现代生活节奏的加快，在临床上人们越来越需要一些起效迅速的新药，利用微生物发酵后的炮制品或中药中间体制备其他剂型新药，可使有效物质进入人体后被迅速吸收，在短时间内达到所需的血药浓度，快速起效。
微生物发酵法炮制牛蒡子技术是绿色环保技术，与化学法转化苷类中药相比，不会因使用强酸强碱对环境造成污染，整个工艺过程没有“三废”产生，对环境、能源不会造成太大压力。微生物发酵法炮制牛蒡子能够促进中药产品迈向国际市场。传统中药中有效物质基础不清，作用机理不明是阻碍中药现代化发展的关键，也是国际上对中药产生怀疑态度的原因，利用微生物发酵转化苷类中药技术使中药产品有效物质基础确定、作用机理明确，同时有效避免了传统中药制品“大、黑、多”的缺点。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的β-葡萄糖苷酶产生菌——黑曲霉ZJUT712，以及利用黑曲霉ZJUT712固态发酵炮制牛蒡子的方法。
本发明采用的技术方案是：
黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUT712，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2594，保藏日期：2008年7月15日。所述黑曲霉ZJUT712菌落特征：菌落在查氏培养基上25℃培养7～10天，直径50～80mm。菌丝绒毛状，分生孢子结构呈黑色，无渗出液，无气味。菌落反面略带浅黄色，有同心圆褶皱2～3圈，辐射状褶皱5～6条。
本发明还涉及所述的黑曲霉ZJUT712在固态发酵炮制牛蒡子中的应用。
具体的，所述的应用为：将黑曲霉ZJUT712菌种接种至含有牛蒡子粉的固态发酵培养基中，20～50℃固态发酵炮制2～10天，优选为5～9天，更优选为7天，炮制结束后得到牛蒡子固态发酵炮制品，所述牛蒡子固态发酵炮制品可以按照常规方法分离纯化得到牛蒡子苷元，进一步用于后续药物的制备。常用分离纯化牛蒡子苷元的方法：将牛蒡子固态发酵炮制品干燥去除水分，加入10倍体积甲醇，减压蒸干，残留物加入氯仿溶解，取氯仿液，加无水硫酸钠脱水、过滤、减压蒸干得到主要含有牛蒡子苷元的混合物，再用硅胶柱分离牛蒡子苷元，洗脱剂为氯仿/甲醇(100∶0～95∶5)，并用甲醇等有机溶剂重结晶获得高纯度的牛蒡子苷元。
样品检测方法：将牛蒡子固态发酵炮制品样品过滤，取滤渣干燥除去水分，加入十倍量甲醇回流，提取液转移至容量瓶中，用甲醇定容至25mL。取适量用0.45μm微孔滤膜过滤后用液相色谱分析牛蒡子苷和牛蒡子苷元含量。分析条件为：色谱柱Krom asil ODS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相为甲醇-乙腈-水-四氢呋喃(10∶24∶65∶1至10∶39∶50∶1线性梯度)，流速1mL/min，检测波长220nm，分析时间15min。
所述固态发酵培养基可为常规适用于黑曲霉的培养基添加牛蒡子粉获得，碳源可选稻草粉、大麦粉、甘蔗渣、玉米芯、玉米淀粉或稻谷壳等，氮源可选蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、黄豆饼粉、尿素、(NH4)2SO4或NaNO3等，本发明中，所述固态发酵培养基推荐按如下组成配制：牛蒡子粉0.5～6.0g，麸皮2～5g，甘蔗渣1～3g，蛋白胨0.1～0.5g，Mandels营养液5～12mL，以蒸馏水调节固液比为1∶1.5～5.0，pH3.0～10.0。所述固液比是指培养基中所加入固体物质(牛蒡子粉+麸皮+甘蔗渣+蛋白胨)与液体物质(Mandels营养液+蒸馏水)的质量之比。
优选的，所述固态发酵培养基按如下组成配制：牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL，蒸馏水10mL，pH自然。
其中Mandels营养液(1L)的组成为：KH2PO4 2g，(NH4)2SO4 1.4g，尿素0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO4·H2O1.56mg，ZnSO4 1.4mg，CoCl2 0.2mg，蒸馏水定容至1L。
优选的，所述方法如下：将黑曲霉ZJUT712菌种接种至含有牛蒡子粉的固态发酵培养基中，30℃下固态发酵炮制7天，得到牛蒡子固态发酵炮制品。所述固态发酵培养基按如下组成配制：牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL，蒸馏水10mL，pH自然。
本发明所述黑曲霉ZJUT712可接种在斜面培养基上于20～40℃培养箱中培养5～10天得到斜面菌种，斜面菌种(不用时于4℃冰箱中保藏)再接种至含有牛蒡子粉的固态发酵培养基中进行固态发酵炮制。所述的斜面培养基的配制方法推荐如下：称取马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水1000mL，煮沸半小时，纱布过滤，加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热用纱布过滤，分装，121℃灭菌20min。
本发明采用β-葡萄糖苷酶产生菌黑曲霉ZJUT712固态发酵法炮制牛蒡子的机理如下：
黑曲霉ZJUT712可以利用固态发酵培养基中的营养成分生长繁殖，同时产生的β-葡萄糖苷酶用于水解牛蒡子苷生成牛蒡子苷元，提高牛蒡子中牛蒡子苷元的含量，使牛蒡子摄入人体后迅速起效。
采用β-葡萄糖苷酶产生菌黑曲霉ZJUT712固态发酵炮制牛蒡子与传统的牛蒡子炮制方法相比具有如下优点：①炮制机理明确，将现代生物技术与中药炮制技术相结合，提高了药物的炮制效果，使牛蒡子经本发明方法炮制后有效成分牛蒡子苷元的有效含量大大提高；②绿色环保，没有三废污染；③生产工艺简单，成本低廉；④适用于大规模推广，提高中药现代化生产规模。
本发明有益效果主要体现在：提供了一株可供固态发酵法炮制牛蒡子的新菌株——β-葡萄糖苷酶产生菌黑曲霉ZJUT712；利用本发明方法固态发酵炮制牛蒡子，牛蒡子苷转化为牛蒡子苷元的摩尔产率可以达到93.0％，牛蒡子的有效成分大幅度提高，促使牛蒡子摄入人体快速起效；炮制工艺简单、成本低廉、节能环保、适用于大规模推广。
(四)附图说明
图1为本发明实施例1工艺流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
工艺流程图参见图1。
斜面培养基的配制：称取马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半小时，纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热用纱布过滤，取滤液分装试管，15磅蒸汽(121℃)灭菌20min，摆放斜面，放置冷却。
固态发酵培养基的配制：在250mL三角瓶中分别加入牛蒡子粉0.5、1、1.5、2、2.5、5和6g(每组2个平行样，测量时取平均值)。上述三角瓶中均加入麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL和蒸馏水10mL，pH自然(5.6)。1g牛蒡子粉含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别为3.73mg和0.8mg。
黑曲霉ZJUT712菌种斜面的制备：将黑曲霉ZJUT712(CGMCCNo.2594)接种于斜面培养基上于30℃恒温培养箱中培养7天。
将黑曲霉ZJUT7124从斜面接种于固态发酵培养基中于30℃分别转化1、2、3、4、5、6、7、8和9天，每天取样品过滤，取滤渣干燥除去水分，加入十倍量甲醇回流，提取液转移至容量瓶中，用甲醇定容至25mL。取适量用0.45μm微孔滤膜过滤后用液相色谱分析牛蒡子苷和牛蒡子苷元含量。分析条件为：色谱柱Krom asil ODS C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相为甲醇-乙腈-水-四氢呋喃(10∶24∶65∶1至10∶39∶50∶1线性梯度)，流速1mL/min，检测波长220nm，分析时间15min。计算摩尔产率，结果如表1所示：1天内牛蒡子苷没有发生水解，随着时间的延长产率提高，第7天产率达到较高值，第8、9天的产率与第7天相差不大，说明微生物产生的β-葡萄糖苷酶水解牛蒡子苷的能力在第7天较高，第8、9天酶的水解活力降低，水解速率降低。相关数据说明最佳的炮制时间为7天。
表1：牛蒡子粉的用量和炮制时间不同对牛蒡子苷摩尔产率的影响
实施例2：
按照实施例1中的方法获得黑曲霉ZJUT712菌种斜面。
固态发酵培养基的配置：在250mL三角瓶中分别加入2g甘蔗渣、稻草粉、大麦粉、玉米芯、玉米淀粉和稻谷壳(每组2个平行样，测量时取平均值)。在上述三角瓶中均继续加入牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL和蒸馏水10mL，pH自然(5.6)。1g牛蒡子粉含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别为3.73mg和0.8mg。
将黑曲霉ZJUT712分别接种于上述转化培养基中，30℃转化7天。产率测定及计算方法同实施例1，结果如表2所示。以2g甘蔗渣和3g麸皮为碳源可以获得较高的产率，甘蔗渣可以使培养基的结构更加疏松，有利于传质和氧的传递，有利于获得较高的产率。
表2：固态发酵培养基中不同的碳源对牛蒡子苷摩尔产率的影响
| 碳源的种类(2g) | 稻草粉 | 大麦粉 | 甘蔗渣 | 玉米芯 | 玉米淀粉 | 稻谷壳 |
| 摩尔产率(％) | 87.5 | 82.1 | 93.0 | 72.6 | 70.2 | 81.5 |
实施例3：
按照实施例1中的方法获得黑曲霉ZJUT712菌种斜面。
固态发酵培养基的配置：在250mL三角瓶中分别加入0.3g蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、黄豆饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NaNO3(每组2个平行样，测量时取平均值)。在上述三角瓶中均继续加入牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，Mandels营养液10mL和蒸馏水10mL，pH自然(5.6)。1g牛蒡子粉含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别为3.73mg和0.8mg。
将黑曲霉ZJUT712分别接种于上述转化培养基中，30℃转化7天。产率测定及计算方法同实施例1，结果如表3所示。氮源种类不同对黑曲霉ZJUT712产生的β-葡萄糖苷酶水解活力不同。有机氮源有利于获得较高产率。蛋白胨为较佳的氮源，其次分别为酵母膏、牛肉膏和黄豆饼粉。
表3：固态发酵培养基中不同的氮源对牛蒡子苷摩尔产率的影响
| 氮源的种类(0.3g) | 蛋白胨 | 牛肉膏 | 酵母膏 | 黄豆饼粉 | 尿素 | (NH4)2SO4 | NaNO3 |
| 摩尔产率(％) | 93.0 | 86.3 | 90.2 | 82.1 | 62.1 | 52.6 | 48.5 |
实施例4：
按照实施例1中的方法获得黑曲霉ZJUT712菌种斜面。
固态发酵培养基的配制：在250mL三角瓶中分别加入0、10、20、30和40mL蒸馏水(每组2个平行样，测量时取平均值)。在上述三角瓶中均继续加入牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g和Mandels营养液10mL，pH自然(5.6)，配制成固液比分别为1∶1.8、1∶3.6、1∶5.4、1∶7.3和1∶9的固态发酵培养基。1g牛蒡子粉含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别为3.73mg和0.8mg。
将黑曲霉ZJUT7124分别接种于上述转化培养基中，30℃转化7天。产率测定及计算方法同实施例1，结果如表4所示。固液比不同时，黑曲霉ZJUT712产生的β-葡萄糖苷酶水解活力不同，产率不同。水分含量过高，黑曲霉的菌丝浸没在水中不易形成孢子，不利于菌体生长和产酶。没有足够的水分供给菌体生长也不利于菌体产酶。固液比为1∶3.6时产率最高，说明牛蒡子苷可以在黑曲霉ZJUT712固态发酵过程中实现较好的转化。
表4：固态发酵培养基中不同的固液比对牛蒡子苷摩尔产率的影响
| 固液比 | 1∶1.8 | 1∶3.6 | 1∶5.4 | 1∶7.3 | 1∶9 |
| 摩尔产率(％) | 80.2 | 93.0 | 78.5 | 61.2 | 52.3 |
实施例5：
按照实施例1中的方法获得黑曲霉ZJUT7124菌种斜面。
固态发酵培养基的配置：在250mL三角瓶中加入牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g和Mandels营养液10mL，分别用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节转化培养基初始pH值分别为3、4、5、5.6、6、7、8、9和10(每组2个平行样，测量时取平均值)，并加蒸馏水调节固液比均为1∶3.6。1g牛蒡子粉含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别为3.73mg和0.8mg。
将黑曲霉ZJUT712分别接种于上述转化培养基中，30℃转化7天。产率测定及计算方法同实施例1，结果如表5所示。当初始pH值为5～8之间时，产率相差不大。转化培养基的自然pH5.6可以确定为最佳初始pH值。
表5：固态发酵培养基初始pH值不同对牛蒡子苷摩尔产率的影响
| 固态培养基初始pH值 | 3 | 4 | 5 | 5.6 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 摩尔产率(％) | 68.1 | 72.6 | 92.8 | 93.0 | 93.0 | 92.6 | 92.1 | 82.1 | 75.2 |
实施例6：
按照实施例1中的方法获得黑曲霉ZJUT712菌种斜面。
固态发酵培养基的配置：在250mL三角瓶中加入牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL和蒸馏水10mL，pH自然(5.6)。1g牛蒡子粉含有牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别为3.73mg和0.8mg。
将黑曲霉ZJUT712分别接种于上述转化培养基中，分别于20、25、30、35、40、45和50℃的条件下转化7天(每组2个平行样，测量时取平均值)。产率测定及计算方法同实施例1，结果如表6所示。固态发酵的温度不同黑曲霉ZJUT712产生的β-葡萄糖苷酶活力不同，温度在20～35℃时产率相差不大，温度高于40℃产率迅速下降，温度升高β-葡萄糖苷酶的热失活速率加快，不利于牛蒡子苷的转化，最佳温度为30℃。
表6：炮制温度不同对牛蒡子苷摩尔产率的影响
| 炮制温度(℃) | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 |
| 摩尔产率(％) | 91.2 | 92.5 | 93.0 | 90.3 | 84.1 | 80.5 | 70.2 |
Claims (7)
1.黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUT712，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.2594，保藏日期：2008年7月15日。
2.如权利要求1所述的黑曲霉ZJUT712在固态发酵炮制牛蒡子中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将黑曲霉ZJUT712菌种接种至含有牛蒡子粉的固态发酵培养基中，20～50℃固态发酵炮制2～10天，得到牛蒡子固态发酵炮制品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述固态发酵培养基按如下组成配制：牛蒡子粉0.5～6.0g，麸皮2～5g，甘蔗渣1～3g，蛋白胨0.1～0.5g，Mandels营养液5～12mL，以蒸馏水调节固液比为1∶1.5～5.0，pH3.0～10.0。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述固态发酵培养基按如下组成配制：牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL，蒸馏水10mL，pH自然。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述方法如下：将黑曲霉ZJUT712菌种接种至含有牛蒡子粉的固态发酵培养基中，30℃下固态发酵炮制7天，得到牛蒡子固态发酵炮制品；所述固态发酵培养基按如下组成配制：牛蒡子粉0.5g，麸皮3g，甘蔗渣2g，蛋白胨0.3g，Mandels营养液10mL，蒸馏水10mL，pH自然。
7.如权利要求3～6所述的应用，其特征在于所述黑曲霉ZJUT712接种至斜面培养基上于20～40℃下5～10天得到斜面菌种，所述斜面菌种再接种至含有牛蒡子粉的固态发酵培养基中进行固态发酵炮制；所述的斜面培养基按如下方法配置：称取马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水1000mL，煮沸半小时，纱布过滤，加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热用纱布过滤，分装，121℃灭菌20min，冷却得斜面培养基。
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