CN101768613A - 一种沙棘叶黄酮苷元的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于黄酮苷元的生产方法领域的一种沙棘叶黄酮苷元的生产方法，该方法是从沙棘叶中提取黄酮类化合物，然后将其加入到接种有黑曲霉的液体培养基中，所述液体培养基的组分与用量为：每100mL水中加入乙二醇10-20mL、橘皮粉2-4g，(NH4)2SO4 1-3g，麸皮1-3g，尿素0.05-0.1g，CaCl20.01-0.02g，初始pH值为5.0-5.5；在28-42℃条件下，振荡发酵培养2-10天；然后在40-60℃条件下，振荡酶解1-5h；酶解后的溶液静置、离心，沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。本发明的原料沙棘叶来源广泛，本发明采用微生物菌株作用原料中黄酮糖苷的生物转化技术提高产物中黄酮苷元含量，明显提高了沙棘叶中槲皮素、山奈酚和异鼠李素三种主要苷元的含量。
Description
技术领域
本发明涉及黄酮苷元的生产方法，具体涉及一种沙棘叶黄酮苷元的生产方法，即利用微生物发酵的技术从沙棘叶中获取黄酮苷元的方法。
背景技术
近年来，很多体内和体外实验都表明黄酮类化合物有很多的生物功能，包括抗炎症、抗过敏、抗癌、抗高血压、抗关节炎和抗菌活性，降低慢性疾病如心血管疾病，治疗皮肤病，防止血小管凝集抗过敏作用、抗肿瘤等。沙棘叶中含有丰富的黄酮类物质，其含量远高于果实中黄酮的含量，并且叶片的低油脂含量也使得其成为黄酮的优质来源；另一方面，沙棘叶来源广泛，从未被充分利用。目前，国内有利用沙棘叶提取黄酮的，但是没有人关注其产物的构型和生理活性高低。
通常，黄酮糖苷的生理活性低于黄酮苷元，黄酮苷元比黄酮糖苷具有更高的生物利用率。人体实验表明，黄酮主要在肠道中被吸收，脂溶性的苷元可从小肠直接吸收；糖苷型的黄酮小部分可以通过结肠中的细菌、微生物的β-葡萄糖苷酶或β-半乳糖苷酶作用而水解，生成的产物又进一步被细胞降解，生成苷元，被结肠壁吸收入血，大部分被肠腔内微生物通过杂环裂解方式降解和代谢而损失掉。即黄酮苷元比黄酮糖苷具有更高的生物效价。有研究表明，在人体内，苷元型的大豆异黄酮比糖苷型吸收更快，被吸收量更多。另外，由于黄酮苷元更容易被吸收，其各种生物活性功能也更强。高荣海等发现小鼠对大豆异黄酮苷元吸收效果强于大豆异黄酮糖苷，大豆异黄酮苷元免疫功能优于大豆异黄酮糖苷。因此，生产黄酮苷元具有更为明显的意义。
所谓微生物转化是利用微生物细胞中的酶高效地、选择性地催化一种化学成分进行某种化学反应，以获得具有高活性成分的过程。利用微生物发酵液中的代谢酶转化糖苷型黄酮为苷元形式的黄酮不仅可以降低成本，而且具有反应条件温和，大豆异黄酮苷元不易变性等优点，因此成为近年来许多学者研究的热点之一。
目前研究最多的是大豆异黄酮，大豆制品发酵过程中能分泌β-葡萄糖苷酶的微生物，主要是曲霉、根霉、毛霉和酵母等真菌，尤其是根霉属(吴定，江汉湖，发酵大豆制品中异黄酮形成及其功能，中国调味品，2001(6)：3-6)。申请号为200610134132.9、发明名称为微生物酶法制备大豆异黄酮苷元的方法的专利申请中以大豆异黄酮粉为原料，用培养米曲霉菌发酵制备的β-葡萄糖苷酶能使大豆异黄酮苷转化率达到90％以上，生物利用率明显提高。王振丽(王振丽，利用微生物代谢酶转化大豆异黄酮的研究，沈阳农业大学，2007)筛选了产胞外β-葡萄糖苷酶活力较高的菌株LWQ-0508。王秀伶等(王秀伶，邵建柱，朱宝成等，大豆异黄酮微生物转化菌株的筛选与鉴定，河北农业大学，2006)以氢黄豆苷元为底物，分离出了能转化二氢黄豆苷为100％S-型雌马酚的革兰氏阴性细菌菌株。在其他黄酮类化合物的转化方面，申请号为03153489.9、发明名称为银杏黄酮甙元的生产方法的专利申请公开了一种银杏黄酮苷元的生产方法，采用微生物菌株或生物酶作用原料中黄酮糖苷的生物转化技术提高产物中黄酮苷元含量。
在其它天然化合物的生物转化方面，研究也十分活跃。目前有通过酶的作用对沙棘黄酮进行构型转化，但是酶解法转化中催化剂是昂贵的糖苷水解酶，成本高，不利于工业化生产。因此应该更多考虑微生物进行转化。微生物在常温、常压等较为温和的条件下进行糖苷的转化，能最大限度保护原料中化学成分免遭破坏，为绿色环保技术，能够在最小成本下获得最大利益。但是，目前尚未见关于沙棘黄酮微生物发酵转化的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙棘叶黄酮苷元的生产方法，利用微生物转化技术提高苷元型沙棘黄酮的含量，从而提高沙棘黄酮的生理活性和最终产品中苷元型黄酮的含量。本发明利用黑曲霉对沙棘叶黄酮进行转化，即利用黑曲霉代谢产生的聚乳糖醛酸酶等对糖苷型黄酮进行酶解，最后生成槲皮素、山奈酚和异鼠李素等黄酮苷元。本发明所采用的为食源性微生物，转化产物可以直接用于食品。
一种沙棘叶黄酮苷元的生产方法，按照如下操作步骤进行：
(1)将黑曲霉接种于液体培养基中，所述液体培养基的组分与用量为：每100mL水中加入乙二醇10-20mL、橘皮粉2-4g，(NH4)2SO4 1-3g，麸皮1-3g，尿素0.05-0.1g，CaCl2 0.01-0.02g，初始pH值为5.0-5.5；
(2)将黄酮类化合物含量为10-15％的沙棘叶提取物粉末加入到接种有黑曲霉的液体培养基中，然后将其置于28-42℃条件下，振荡发酵2-10天，其中，每毫升液体培养基中加入3-7mg沙棘叶提取物粉末；
(3)将发酵后的溶液在40-60℃条件下，振荡酶解1-5h；
(4)酶解后的溶液置于4℃条件下静置30-90min，离心15-60min，将沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。
所述黑曲霉接种于液体培养基中的接种量为每毫升培养基中300-200000个孢子。
步骤(2)中所述沙棘叶提取物粉末的制备方法为本领域常规方法，例如：以沙棘叶为原料，提取采用的溶剂是甲醇水溶液、碱性水或者乙醇水溶液，利用振荡提取，微波辅助提取或者回流方法提取，然后将得到的提取液冷冻干燥，得到含有黄酮类化合物的沙棘叶提取物粉末。
所述步骤(2)和(3)的振荡速度为80-180r/min。
本发明的有益效果：本发明以沙棘叶为主料生产黄酮苷元产品，根据文献报道和实验结果证明，以往作为废弃物丢弃的沙棘叶中同样含有大量的黄酮类物质，其含量比果实高。而且，叶子还有产量大，易采摘收集，储存方便，采摘周期长等优势。本发明采用微生物菌株作用原料中黄酮糖苷的生物转化技术提高产物中黄酮苷元含量，微生物在常温、常压等较为温和的条件下进行糖苷的转化，能最大限度保护原料中化学成分免遭破坏，为绿色环保技术，能够在最小成本下获得最大利益。该方法将糖苷型沙棘总黄酮转化成黄酮苷元的效率达到10-30％。此外，本发明所采用的微生物为食源性微生物，转化产物可以直接用于食品。
具体实施方式
以下实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案。
实施例1
(1)含有黄酮类化合物的沙棘叶提取物粉末的制备：在45℃下，对沙棘叶通过80％甲醇水溶液震荡提取8小时，抽滤，重复三次，合并提取液。然后，将提取液冷冻干燥，得到沙棘叶提取物粉末，粉末中黄酮类化合物含量为12％，其中沙棘总黄酮(即三种主要苷元的所有存在形式的总和)的含量为3.3％；
(2)液体培养基的配制：向100mL水中加入乙二醇15mL、橘皮粉3g，(NH4)2SO4 2g，麸皮2g，尿素0.075g，CaCl2 0.015g，调节pH值为5.0；
(3)取50mL步骤(2)的液体培养基向其中接种黑曲霉(Asp.niger cmcc3.316，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC))，每毫升培养基接种量2×105个孢子；
(4)取步骤(1)得到的沙棘叶提取物粉末150mg加入到步骤(3)的接种有黑曲霉的液体培养基中，然后将其置于28℃，150r/min条件下，发酵4-5天；
(5)将发酵后的溶液在50℃，150r/min条件下，酶解3h；
(6)酶解后的溶液置于4℃条件下静置30min，以3000rpm离心15min，将沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。溶液中山奈酚0.4484mg、异鼠李素0.2828mg，转化率为23％(以沙棘总黄酮计)。
实施例2
(1)含有黄酮类化合物的沙棘叶提取物粉末的制备：在45℃下，对沙棘叶通过65％乙醇水溶液震荡提取8小时，抽滤，重复三次，合并提取液。然后，将提取液冷冻干燥，得到沙棘叶提取物粉末，粉末中黄酮类化合物含量为15％，其中沙棘总黄酮(即三种主要苷元的所有存在形式的总和)的含量为4.7％；
(2)液体培养基的配制：向100mL水中加入乙二醇10mL、橘皮粉2g，(NH4)2SO4 1g，麸皮1g，尿素0.05g，CaCl2 0.01g，调节pH值为5.5；
(3)取50mL步骤(2)的液体培养基向其中接种黑曲霉(Asp.niger cmcc3.316，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC))，每毫升培养基接种量4×103个孢子；
(4)取步骤(1)得到的沙棘叶提取物粉末250mg加入到步骤(3)的接种有黑曲霉的液体培养基中，然后将其置于30℃，80r/min条件下，发酵7-10天；
(5)将发酵后的溶液在60℃，80r/min条件下，酶解5h；
(6)酶解后的溶液置于4℃条件下静置90min，以3000r/min离心30min，将沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。溶液中槲皮素0.2462mg，山奈酚0.0758mg，异鼠李素0.7008mg，转化率为21％(以沙棘总黄酮计)。
实施例3
(1)含有黄酮类化合物的沙棘叶提取物粉末的制备：在45℃下，对沙棘叶通过80％甲醇水溶液震荡提取8小时，抽滤，重复三次，合并提取液。然后，将提取液冷冻干燥，得到沙棘叶黄酮类化合物粉末，粉末中黄酮类化合物含量为12％，其中沙棘总黄酮的含量为3.1％；
(2)液体培养基的配制：向100mL水中加入乙二醇20mL、橘皮粉4g，(NH4)2SO4 3g，麸皮3g，尿素0.1g，CaCl2 0.02g，调节pH值为5.2；
(3)取50mL步骤(2)的液体培养基向其中接种黑曲霉(Asp.nigercmcc3.316，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC))，每毫升培养基接种300个孢子；
(4)取步骤(1)得到的沙棘叶提取物粉末350mg加入到步骤(3)的接种有黑曲霉的液体培养基中，然后将其置于42℃，180r/min条件下，发酵2-3天；
(5)将发酵后的溶液在40℃，180r/min条件下，酶解1h；
(6)酶解后的溶液置于4℃条件下静置60min，以1500r/min离心30min，将沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。溶液中主要苷元为槲皮素0.5185mg，转化率为14％(以沙棘总黄酮计)。
Claims (4)
1.一种沙棘叶黄酮苷元的生产方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：(1)将黑曲霉接种于液体培养基中，所述液体培养基的组分与用量为：每100mL水中加入乙二醇10-20mL、橘皮粉2-4g，(NH4)2SO4 1-3g，麸皮1-3g，尿素0.05-0.1g，CaCl2 0.01-0.02g，初始pH值为5.0-5.5；
(2)将黄酮类化合物含量为10-15％的沙棘叶提取物粉末加入到接种有黑曲霉的液体培养基中，然后将其置于28-42℃条件下，振荡发酵2-10天，其中，每毫升液体培养基中加入3-7mg沙棘叶提取物粉末；
(3)将发酵后的溶液在40-60℃条件下，振荡酶解1-5h；
(4)酶解后的溶液置于4℃条件下静置30-90min，离心15-60min，将沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。
2.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮苷元的生产方法，其特征在于，所述黑曲霉接种于液体培养基中的接种量为每毫升培养基中300-200000个孢子。
3.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮苷元的生产方法，其特征在于，步骤(2)中所述沙棘叶提取物粉末的制备方法为以沙棘叶为原料，提取采用的溶剂是甲醇水溶液、碱性水或者乙醇水溶液，利用振荡提取，微波辅助提取或者回流方法提取，然后将得到的提取液冷冻干燥，得到含有黄酮类化合物的沙棘叶提取物粉末。
4.根据权利要求1所述的沙棘叶黄酮苷元的生产方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)的振荡速度为80-180r/min。
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