CN104830925B - 一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，该方法包括：将灰树花接入培养基进行发酵培养，获得含灰树花菌丝体的发酵液；对发酵液进行匀浆处理，使灰树花菌丝体破碎，β‑葡萄糖苷酶释放到发酵液中，获得粗酶液；将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。本发明通过深度发酵灰树花获得大量β‑葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮糖苷制备苷元，获得的β‑葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收率，同时转化产物还富含灰树花胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发及工业化生产奠定基础。

Description

一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法。

背景技术

大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有12种，分为游离型的苷元(Aglycon)和结合型的糖苷(Glycosides)两类，游离的苷元占总量的2％-3％，包括染料木素(Genistein)、大豆苷元(Daidzein)和黄豆黄素(Glycitein)；糖苷型占总量的97％-98％，主要以葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷型等形式存在。

大豆异黄酮带有2个或3个羟基和芳香环，与人体分泌的雌激素在结构上十分相似，具有弱雌激素活性，因此大豆异黄酮被称之为天然的植物雌激素。另外，大豆异黄酮还能有效地预防骨质疏松、乳腺癌、子宫内膜癌，具有抗氧化、抗溶血和抗真菌活性等。经研究，大豆异黄酮在大豆中通常以没有活性的糖苷结合形式存在，在人体内只有经肠道菌群的葡萄糖苷酶分解后，形成游离的大豆异黄酮苷元才具有生物活性。如何有效地将糖苷型的大豆异黄酮通过水解转化成游离型的苷元以增强大豆异黄酮的生物活性已成为近年来世界各国科学家研究的热点。

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现。后来发现该酶在自然界分布广泛，普遍存在于植物、动物和微生物中。β-葡萄糖苷酶能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，还能协助纤维素酶降解纤维素，已被广泛应用于食品、医药等领域。此外，食物中黄酮类糖苷在人体吸收过程中包含一个关键的脱糖基作用，它是由小肠上皮中的β-葡萄糖苷酶作用下进行的，因此该酶在制备黄酮类活性苷元方面亦显示出极大的应用前景。

灰树花(Grifola frondosa)，隶属于担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌科、树花属，又名贝叶多孔菌、千佛菌、莲花菌，日本称“舞茸”，子实体营养丰富、口味鲜美，是一种珍贵的药、食两用蕈菌，灰树花多糖是其主要的活性成分，具有明显的抗艾滋病病毒，抗肿瘤、改善免疫系统功能，调节血糖、血脂及胆固醇水平，降血压等作用，目前市场上开发的灰树花多糖产品，多数是从灰树花子实体里提取的，由于灰树花子实体的生长周期长，易受气候、环境因素影响，而利用液体深层发酵法可使灰树花生产工业化，周期缩短，产量增加。作为一种白腐真菌，灰树花具有丰富的水解酶系，目前已发现的有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、漆酶、Mn过氧化物酶等。

微生物转化是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化反应，具有反应条件温和、操作性强、无环境污染等特点，同时微生物培养具有繁殖迅速，生长周期短，可以降低成本，易于工业化生产。由于大豆异黄酮分子中糖基的连接键是β-糖苷键，所以可以利用可分泌β-葡萄糖苷酶的微生物发酵来实现大豆异黄酮苷元的制备。目前，曲霉被普遍认为是产β-葡萄糖苷酶的优良菌种，尤以黑曲霉的效率最高，但仅限于实验室研制阶段，黑曲霉β-葡萄糖苷酶的转化效率仍有待提高。

因此，有必要探究一种新的转化大豆异黄酮糖苷生成大豆异黄酮苷元的方法，以提高苷元的转化效率。

发明内容

本发明提供了一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，该方法获得的灰树花β-葡萄糖苷酶的酶活高，产物大豆异黄酮糖苷元的转化率高。

一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，包括：

(1)将灰树花接入培养基进行发酵培养，获得含灰树花菌丝体的发酵液；

(2)对发酵液进行匀浆处理，使灰树花菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液中，获得粗酶液；

(3)将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元。

由于β-葡萄糖苷酶为胞内酶，需要从菌体中释放出来才能发挥作用，所以对发酵液进行匀浆处理，即可破碎发酵液中的菌丝体，释放β-葡萄糖苷酶；释放后无需提取β-葡萄糖苷酶即可直接用于大豆异黄酮糖苷的转化，转化后产生的大豆异黄酮苷元，包含染料木素(Genistein)、大豆苷元(Daidzein)和黄豆黄素(Glycitein)，其中，黄豆黄素的含量极低，可以忽略。

作为优选，以重量百分比计，所述培养基包括葡萄糖2～4％，麸皮3～5％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB₁ 0.005％，pH 5.0，以提高菌株生物量和β-葡萄糖苷酶的酶活。

作为优选，所述发酵培养的条件为：20～28℃下培养6～9天。

通过实验对粗酶液与大豆异黄酮糖苷的反应条件以及粗酶液中β-葡萄糖苷酶与大豆异黄酮糖苷的用量关系进行优选，作为优选，步骤(3)中，反应的温度为40℃～60℃。作为优选，步骤(3)中，反应的时间为12～20h。

作为优选，以1g大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中β-葡萄糖苷酶的用量为60～70U。

发酵培养前，将灰树花接入种子培养基中进行培养，培养条件为：25～28℃下培养5～8天。

作为优选，以重量百分比计，所述种子培养基包括马玲薯20％，葡萄糖2％，蛋白胨1％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB1 0.005％，pH 6.0。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过深度发酵灰树花获得大量β-葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮糖苷制备苷元，获得的β-葡萄糖苷酶的活性高，产物转化率高，大大提高了大豆异黄酮的活性及吸收率，同时转化产物还富含灰树花胞外及菌丝体多糖等生物活性物质，为新型功能物质的开发及工业化生产奠定基础；

(2)灰树花液体深层发酵具有繁殖迅速，生长周期短等优点，可以降低成本，易于工业化生产；

(3)采用灰树花的发酵产物转化大豆异黄酮糖苷，具有反应条件温和，工艺简单、操作性强、无有机溶剂残留、无环境污染等特点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步地说明和阐述。

本发明选用的菌株为灰树花(Grifola frondosa)3号，购自河南省农业科学研究院。本发明采用的大豆异黄酮提取物为市售产品，该产品中大豆异黄酮的质量分数为40％，其中大豆苷含量为9.67％，染料木苷含量为27.33％。

实施例1灰树花液体发酵产β-葡萄糖苷酶

1、β-葡萄糖苷酶的活力测定方法

(1)标准曲线的制作

准确称取pNP(对-硝基苯酚)13.90mg，溶解于蒸馏水并定容至100mL。取6个10mL容量瓶，分别吸取100、200、300、400、500、600μLpNP溶液至1-6号瓶，用1mol/L Na₂CO₃溶液定容并混匀，1-6号瓶对应的pNP浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mmol/L，以蒸馏水为对照测定400nm吸光值并绘制标准曲线。

(2)样品中β-葡萄糖苷酶活力的测定

取匀浆处理的发酵菌液1mL于离心管中，4℃，10000rpm离心10min。取100μL上清与200μL 5mM pNPG混匀，50℃保温30min，加入2mL 1mol/L Na₂CO₃中止反应并显色，于400nm下测定吸光值。β-葡萄糖苷酶酶活力单位(U)定义为，在pH5.0，50℃反应条件下，一分钟时间内底物被水解释放出1μmol的pNP所需要的酶量。

2、种子培养基的制备及其菌种培养

种子培养基为马玲薯20％，葡萄糖2％，蛋白胨1％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄ 0.15％，VB10.005％，pH 6.0，于121℃灭菌20min；挑取10块左右黄豆大小的固体种子到100mL种子培养基中，于25℃、180r/min振荡培养7天。

3、灰树花液体发酵培养基的制备及其发酵培养产β-葡萄糖苷酶

为了优化灰树花液体发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵培养基，选择葡萄糖和麸皮2个因素为变量，生物量、胞内多糖及β-葡萄糖苷酶活力为响应值，其它培养基成分与基础培养基相同，设计二因素三水平共13个试验点的响应面分析试验，其因素水平选取见表1，试验方案及结果见表2。

表1 响应面的因素与水平

表2 中心组合试验设计与结果

利用Design Expert对以上结果进行综合分析，得到灰树花发酵最佳培养基组成(g/L)为：葡萄糖27.83，麸皮35.57，KH₂PO₄ 3，MgSO₄ 1.5，VB₁ 0.05。

以10％的接种量将制备好的种子液接入上述优化的发酵培养基中，在25℃，180r/min条件下摇床培养7天，获得发酵菌液，进行匀浆处理，使菌丝破碎，胞内β-葡萄糖苷酶进入发酵液中，此时菌液酶活可达到最大，为0.202U/mL。

实施例2β-葡萄糖苷酶生物转化大豆异黄酮糖苷

1、β-葡萄糖苷酶生物转化大豆异黄酮糖苷生产苷元

取3～5g大豆异黄酮提取物作为底物，与100mL匀浆后的发酵菌液混合，在40℃～60℃下进行搅拌反应(转化)12～20h后，获得大豆异黄酮苷元。(对上述参数进行的优化，如本实施例的第3部分所述)

2、HPLC检测大豆异黄酮

采用液相色谱进行检测，色谱柱为C18，4.6mm×250mm，粒度5μm；流动相A、B分别为乙腈和pH＝3.0的磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表3。流速为1.0mL/min，检测波长为260nm，进样量为10μL，柱温为30℃。取转化后的样品，用甲醇稀释至1mg/mL，用上述方法对其中的糖苷及苷元含量进行HPLC检测分析，计算转化率。

表3 大豆异黄酮HPLC检测梯度洗脱条件

3、大豆异黄酮转化条件的优化和相应结果

以大豆异黄酮提取物为底物，以底物量、转化温度以及转化时间三个因素作为变量，设计正交试验，其因素水平选取见表3，试验方案及结果见表4、5。

表3 因素水平

表4 大豆苷转化正交结果直观分析表

表5 染料木苷转化正交结果直观分析表

对大豆苷及染料木苷转化正交结果的直观分析及各因素效应曲线图可得，最优组合为：底物量3g，转化时间18h，转化温度60℃，经验证大豆异黄酮产物中大豆苷和染料木苷转化为大豆苷元和染料木素的转化率分别为99.22％和99.69％。

Claims (3)

1.一种灰树花发酵转化大豆异黄酮糖苷生成苷元的方法，其特征在于，包括：

（1）将灰树花（Grifola frondosa）3号接入培养基进行发酵培养，获得含灰树花菌丝体的发酵液；以重量百分比计，所述培养基包括葡萄糖2~4%，麸皮3~5%，KH₂PO₄ 0.3%，MgSO₄0.15%，VB₁ 0.005%，pH 5.0；所述发酵培养的条件为：20~28℃下培养6~9天；

（2）对发酵液进行匀浆处理，使灰树花菌丝体破碎，β-葡萄糖苷酶释放到发酵液中，获得粗酶液；以1g大豆异黄酮糖苷计，粗酶液中β-葡萄糖苷酶的用量为 60~70U；

（3）将粗酶液与大豆异黄酮糖苷混合，反应获得大豆异黄酮苷元；反应的温度为40℃~60℃；时间为12~20 h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养前，将灰树花（Grifola frondosa）3号接入种子培养基中进行培养，培养条件为：25~28℃下培养5~8天。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述种子培养基包括马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH₂PO₄ 0.3%，MgSO₄ 0.15%，VB₁ 0.005%，pH 6.0。