CN109735585B - 一种提高槐角中染料木素含量的方法 - Google Patents
一种提高槐角中染料木素含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高槐角中染料木素含量的方法，所述方法为：将槐角加入糖苷酶粗酶液中，在30‑35℃、100‑200r/min的振荡条下转化24‑72h(优选30℃、24h)，过滤除去粗酶液，滤饼烘干，即得富含染料木素的槐角；所述糖苷酶粗酶液是米根霉GDMCC No:60145发酵液过滤除去菌体获得的滤液。槐角中的染料木素含量提高幅度大，最高可达21.5倍，含量由原来的2.34mg/g提高到52.7mg/g；本发明具有专一性好、产物结构不会被破坏、生物催化剂的成本低，且可使槐角中多种糖苷转化为染料木素，其含量提高幅度大。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种采用生物转化法提高中药槐角中染料木素含量的方法。
(二)背景技术
槐角(Sophorae Fructus)为我国传统中药材，是豆科植物槐(Sophora japonicaL.)的干燥成熟果实(完整的豆荚)。槐角始载于《神农本草经》，列为上品。性寒、味苦，归肝、大肠经，具有清热泻火，凉血止血的功效，用于肠热便血，痔肿出血，肝热头痛，眩晕目赤。槐角是历版《中华人民共和国药典》均收载的中药品种，据统计，槐角为原料生产的槐角丸、地榆槐角丸、脏连丸达30多种，对治疗冠心病、高血压、脑血管栓塞等病症，疗效显著。
槐角的主要药效成分为槐角苷(sophoricoside，CAS号152-95-4)，又名为槐苷、槐黄苷、染料木素-4'-葡萄糖苷(genistein-4'-glucoside)，是历版中国药典要求的质控成分，如2015版《中华人民共和国药典》要求槐角干燥品中，槐角苷含量不得低于4.0％。槐角除了含有槐角苷之外，还含有它的苷元染料木素(genistein，CAS号446-72-0)，以及染料木素的其他糖苷形式，包括染料木苷(genistin，genistein-7-glucoside，CAS号529-59-9)、槐角双苷(sophorabioside，genistein-4'-diglucoside，CAS号2945-88-2)、染料木素-7-双葡萄糖苷(genistein-7-diglucoside,genistein-7-cellobioside)和染料木素-7,4'-双葡萄糖苷(genistein-7,4'-diglucoside，CAS号36190-98-4)等。染料木素又称染料木黄酮、染料木因和金雀异黄素等，属于异黄酮类化合物，在槐角中的含量为0.2％左右。染料木素的结构与雌二醇类似，因此有植物雌激素之称，具有抗炎、抗生育和预防骨质疏松症的疗效，近年来不少学者对染料木素的生物活性进行了研究，发现其还具有抗氧化、降血脂和抗肿瘤等生物活性。
现代药理学研究表明，槐角苷只有被体内肠道菌群转化为染料木素后才能发挥效用。但人体摄入的槐角苷，并不是都能被肠道菌群转化为染料木素而被吸收，如果肠道菌群产生的糖苷酶活性较弱，槐角苷进入肠道后，不能被转化，发挥的药效就较弱，甚至不能发挥作用。所以，如果在体外将槐角苷以及染料木素的其他糖苷都转化为染料木素，槐角的药理作用将显著提高。
目前，已有文献报道采用酸水解或酶转化处理槐角，染料木素的提取率显著提高。但是，酸水解专一性差，容易破坏苷元的结构，导致产物收率低，并产生非药效物质等问题；而利用商品糖苷酶(如中国发明专利CN101760488.A采用的是淀粉酶、纤维素酶或β-葡萄糖苷酶等)转化处理槐角，只能转化少数种类的染料木素糖苷，存在效率低、成本高的缺点，致使这些技术工业化应用困难。
由此可见，如果采用微生物发酵的复合糖苷酶处理槐角，可以将其中各种形式糖苷，都转化为染料木素(图1)，含量可大幅度提高，而且微生物产生的多糖水解酶对槐角组成结构的纤维素和半纤维素降解，使槐角质地疏松，从而有利于染料木素的释放。经过转化处理的槐角，既可作为中药材应用中药方剂，疗效将显著提高；也可以作为染料木素提取的原料，提取率将大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是采用微生物发酵制备的复合糖苷酶，生物转化法处理中药槐角，提高其染料木素的含量。经转化处理的槐角中，染料木素的含量显著提高，最高可达21.5倍。本发明工艺具有成本低、流程简单、转化率高等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种提高槐角中染料木素含量的方法，所述方法为：将槐角加入糖苷酶粗酶液中，在30-35℃、100-200r/min的振荡条下转化24-72h(优选30℃、24h)，过滤除去粗酶液，滤饼烘干，即得富含染料木素的槐角；所述糖苷酶粗酶液是米根霉(Rhizopusoryzae)GDMCC No:60145发酵液过滤除去菌体获得的滤液。
本发明所述的米根霉(Rhizopus oryzae)LJH3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075，已在专利申请CN201710442332.9中公开。
进一步，所述槐角的加入量以糖苷酶粗酶液体积计为10-50g/L，所述槐角在加入前需在85℃干燥并粉碎成粒径为0.2-10mm的颗粒。所述糖苷酶粗酶液中糖苷酶活力以β-葡萄糖苷酶计为1.0-1.2U/mL。
进一步，所述糖苷酶粗酶液制备方法为：将米根霉GDMCC No:60145接种于发酵培养基中，于28-30℃、200-250r/min恒温振荡条件下培养3-5d，发酵液过滤，滤液即为糖苷酶粗酶液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9-12g/L，蛋白胨5-7g/L，麦芽糖8-11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0-7.0。
进一步，所述滤饼烘干条件为85-105℃、10-12h(更优选105℃、12h)。
本发明所述米根霉GDMCC No:60145在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述米根霉GDMCC No:60145发酵培养方法为：
(1)活化培养：将米根霉GDMCC No:60145接种于PDA平板培养基，于28-30℃恒温培养2-3d，获得米根霉GDMCC No:60145孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后米根霉GDMCC No:60145孢子接种至种子培养基中，于28-30℃、200-250r/min恒温振荡条件下培养2-3d，得种子液；所述种子培养基组成为：酵母浸出粉9-12g/L，蛋白胨5-7g/L，麦芽糖8-11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0-7.0；优选的种子培养基组成为：酵母浸出粉9g/L，蛋白胨5g/L，麦芽糖8g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0；
(3)发酵培养：用步骤(1)活化培养后米根霉GDMCC No:60145孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度2-5％(优选5％)的接种量接入发酵培养基，于28-30℃、200-250r/min恒温振荡条件下培养3-5d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9-12g/L，蛋白胨5-7g/L，麦芽糖8-11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH6.0-7.0；优选的发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)槐角中的染料木素含量提高幅度大，最高可达21.5倍，含量由原来的2.34mg/g提高到52.7mg/g；(2)相比于化学转化法，具有专一性好，产物结构不会被破坏；(3)相比于纯酶法转化，生物催化剂的成本低，且可使槐角中多种糖苷转化为染料木素，其含量提高幅度大：(4)实现槐角中药效成分原位转化，经处理的槐角既可以作为中药材应用于方剂，也可以作为染料木素提取的原料。
(四)附图说明
图1染料木素的糖苷转化为染料木素的化学反应式；
图2硝基苯酚摩尔浓度—A400标准曲线；
图3 HPLC法分析槐角中染料木素浓度的标准曲线；
图4标准品染料木素的HPLC分析图谱(溶于甲醇，浓度0.04g/L)；
图5未转化处理的槐角甲醇提取液HPLC分析图谱；
图6米根霉GDMCC No:60145糖苷酶转化处理的槐角甲醇提取液HPLC分析图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
分别采用盐酸水解法、纯酶转化法和米根霉LJH3糖苷酶转化法处理槐角，比较3种方法提高槐角中染料木素含量的效率。
(1)盐酸水解法：槐角85℃烘干，粉碎后过80目筛(槐角粉粒径0.2mm左右)，获得槐角粉。取5g槐角粉加入到100mL的2.5mol/L盐酸(HCl)水溶液中，50℃、200r/min振荡24h后，过滤，滤饼105℃烘干，HPLC分析染料木素含量。
(2)纯酶转化法：槐角85℃烘干，粉碎后过80目筛，获得槐角粉。取5g槐角粉加入到100mL的pH 6.0磷酸缓冲液中，加入β-葡萄糖苷酶，使体系中的酶活力为2U/mL，30℃、200r/min振荡24h后，过滤，滤饼105℃烘干，HPLC分析染料木素含量。
(3)米根霉LJH3糖苷酶转化法：槐角85℃烘干，粉碎后过80目筛，获得槐角粉。取5g槐角粉加入到100mL米根霉LJH发酵制备的糖苷酶粗酶液，30℃、100r/min振荡24h后，过滤，滤饼105℃烘干，HPLC分析染料木素含量。
经以上3种方法处理槐角，其中的染料木素含量和提高倍数见表1，以槐角粉原料为未处理对照。
表1经不同方法处理后槐角中染料木素的含量
从表1数据可以看出，3种方法处理槐角后，槐角中的染料木素含量均有提高，但米根霉LJH3糖苷酶转化法对提高槐角中染料木素含量的效率最佳，可以提高11.6倍。
所述的米根霉LJH3糖苷酶粗酶液按以下方法制备：
(1)将4℃冰箱中保存的米根霉LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于28℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子2次接种至100mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养5d后，得干菌体浓度为4.26g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液，测定β-葡萄糖苷酶活力为1.12U/mL。所述的发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的中药材槐角(Sophorae Fructus)由药材公司购得，质量符合《中华人民共和国药典》(2015版)要求。
所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.6mL、pH 5.0的柠檬酸缓冲液0.2mL和10mmol/L的硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)0.2mL，于37℃下反应10min后，加入5mL的1mol/L Na2CO3溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于400nm波长下测定吸光度(A400)。由硝基苯酚(pNP)摩尔浓度—A400标准曲线(图2)计算出反应体系中pNP浓度。
β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：37℃下、pH 5.0缓冲体系中，l min内水解pNPG生成1μmol的pNP的酶量为1个酶活单位。
酶活按以下公式(1)计算。
式(1)中，V1：反应体系总体积；V2：粗酶液体积；C1：pNP浓度；T：反应时间。
所述的染料木素HPLC分析方法为：1g槐角粉于20mL的甲醇中，于室温、40KHz、100W条件下超声提取30min；过滤得甲醇提取液，依据提取液中染料木素含量的高低，用甲醇作适当倍数稀释后，经0.45μm微孔滤膜过滤后HPLC法分析。HPLC分析条件为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温；体积比60:40的甲醇和水等度洗脱，流速0.8mL/min，检测波长260nm，进样量15μL。由相同分析条件下的标准品染料木素浓度—峰面积标准曲线(图3)，计算出槐角中的染料木素的含量。
实施例2：
槐角85℃烘干，粉碎后过80目筛(槐角粉粒径0.2mm左右)，获得槐角粉。按表2取不同质量的槐角粉加入到100mL的米根霉LJH发酵制备的糖苷酶粗酶液，30℃、100r/min振荡24h后，过滤，滤饼105℃烘干，HPLC分析染料木素含量，不同料液比下米根霉LJH3糖苷酶转化槐角后染料木素含量和提高倍数见表2。
表2不同料液比下米根霉LJH3糖苷酶槐角后染料木素含量
从表2数据可以看出，料液比越高，经转化后的槐角中染料木素含量提高倍数就越小。从粗酶液的制备成本考虑，即使选择50g/L的料液比进行转化，此时染料木素的含量仍可以提高10倍以上。
在料液比为10g/L时，经转化处理的槐角中，染料木素及其糖苷的含量变化见表3。
表3经转化处理的槐角中染料木素及其糖苷的含量变化
经转化处理的槐角中，如果5种糖苷100％转化为染料木素，染料木素的理论最大含量应为48.4mg/g，但分析得出的含量为52.7mg/g，这说明经转化处理的槐角，用甲醇超声提取，各种糖苷转化为染料木素后更容易溶出，所以分析得出的染料木素含量高于理论最大含量。
所述的米根霉LJH3糖苷酶粗酶液制备方法同实施例1，β-葡萄糖苷酶活力为1.12U/mL。
实施例3：
槐角85℃烘干，粉碎或剪切后过不同孔径筛，使槐角粉的颗粒粒径不同(见表4)。5g槐角颗粒加入到100mL的米根霉LJH发酵制备的糖苷酶粗酶液，30℃、100r/min振荡24h后，过滤，滤饼105℃烘干，HPLC分析染料木素含量，不同粒径的槐角经米根霉LJH3糖苷酶转化后染料木素含量和提高倍数见表4。
表4不同粒径的槐角经米根霉LJH3糖苷酶转化后染料木素含量和提高倍数
从表4数据可以看出，槐角颗粒粒径大小不同，经米根霉LJH3糖苷酶转化后，染料木素提高的倍数有显著的不同，颗粒越小，染料木素含量提高的倍数越大，所以可以根据转化后槐角的用途不同，粉粹或剪切成不同粒径进行转化，如用于染料木素的提取，可以粉粹成较小的颗粒；如用于中药临床处方调配，可以剪切成稍大的颗粒进行转化，以方便方剂的调剂操作。
所述的米根霉LJH3糖苷酶粗酶液制备方法同实施例1，β-葡萄糖苷酶活力为1.12U/mL。
实施例4
米根霉LJH3糖苷酶转化处理小颗粒槐角粉，提高染料木素的含量，优选的工艺可按以下步骤进行：
(1)将4℃冰箱中保存的米根霉LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于28℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为2.67g/L的种子液。所述种子培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9g/L，蛋白胨5g/L，麦芽糖8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，NaCl5g/L，溶解为自来水，初始pH 6.0，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即5mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d后，得干菌体浓度为4.23g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液，测定β-葡萄糖苷酶活力为1.05U/mL。所述的发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)槐角85℃烘干，粉碎后过80目筛(槐角粉粒径0.2mm左右)，5g加入到100mL步骤(3)制备的米根霉LJH3糖苷酶粗酶液中，30℃、200r/min振荡24h后，过滤，滤饼105℃烘干，即得富含染料木素的槐角。
经转化处理后的槐角，染料木素含量为32.2mg/g，较未转化的槐角提高了12.8倍。
实施例5
米根霉LJH3糖苷酶转化处理大颗粒槐角，提高染料木素的含量，优选的工艺可按以下步骤进行：
(1)将4℃冰箱中保存的米根霉LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于28℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为2.59g/L的种子液。所述种子培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9g/L，蛋白胨5g/L，麦芽糖8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，NaCl5g/L，溶解为自来水，初始pH 6.0，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即5mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d后，得干菌体浓度为4.15g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液，测定β-葡萄糖苷酶活力为1.08U/mL。所述的发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7.0。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)槐角85℃烘干后，从槐角豆荚的种粒间切断，5g加入到100mL步骤(3)制备的米根霉LJH3糖苷酶粗酶液中，35℃、200r/min振荡72h后，过滤，滤饼105℃烘干，即得富含染料木素的槐角。
经转化处理后的槐角，染料木素含量为17.7mg/g，较未转化的槐角提高了6.56倍。
Claims (4)
1.一种提高槐角中染料木素含量的方法，其特征在于所述方法为：将槐角加入糖苷酶粗酶液中，在30℃、100 r/min的振荡条下转化24 h，过滤除去粗酶液，滤饼烘干，即得富含染料木素的槐角；所述糖苷酶粗酶液是米根霉（Rhizopus oryzae）GDMCC No: 60145发酵液过滤除去菌体后获得的滤液；
所述槐角的加入量以糖苷酶粗酶液体积计为10g/L；所述糖苷酶粗酶液中糖苷酶活力以β-葡萄糖苷酶计为1.12 U/mL；
所述糖苷酶粗酶液制备方法为：将米根霉GDMCC No: 60145接种于发酵培养基中，于30℃、200 r/min恒温振荡条件下培养5 d，发酵液过滤，取滤液即为糖苷酶粗酶液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12 g/L，蛋白胨7 g/L，麦芽糖11 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，溶剂为自来水，初始pH7.0。
2.如权利要求1所述提高槐角中染料木素含量的方法，其特征在于所述槐角在加入前需在85℃干燥并粉碎成粒径为0.2-10 mm的颗粒。
3.如权利要求1所述提高槐角中染料木素含量的方法，其特征在于所述滤饼烘干条件为85-105℃、10-12 h。
4.如权利要求1所述提高槐角中染料木素含量的方法，其特征在于所述米根霉GDMCCNo: 60145在发酵前，需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述米根霉GDMCC No:60145的孢子或种子液的培养方法为：
（1）活化培养：将米根霉GDMCC No: 60145接种于PDA平板培养基，于28-30℃恒温培养2-3 d，获得米根霉GDMCC No: 60145孢子；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，溶剂为自来水，pH6.5；
（2）种子扩大培养：挑取步骤（1）活化培养后米根霉GDMCC No: 60145孢子接种至种子培养基中，于28-30℃、200-250 r/min恒温振荡条件下培养2-3 d，得种子液；所述种子培养基组成为：酵母浸出粉9-12 g/L，蛋白胨5-7 g/L，麦芽糖8-11 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，溶剂为自来水，初始pH 6.0-7.0。
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