CN116426596A - 一种生物转化制备红参Rg3的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物转化制备红参Rg3的方法，属于红参Rg3制备技术领域，包括以下步骤：将红参粉碎、过筛，再称取粉碎后的红参粉末加水搅拌混合作为培养基，经灭菌、接种、培养、烘干得到生物转化红参；将生物转化红参粉碎过筛，再加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，在温度28‑45℃、200‑250r/min恒温振荡条件下进行生物转化反应，反应完成后，用真空抽滤得到滤液；将滤液用乙醇萃取四次，体积比为1：1，取上层萃取液合并，然后将有机层蒸发，用乙睛溶液溶解，进行柱层析分离制备得到红参Rg3；经过两次生物转化处理，其红参Rg3的转化效率和总制备含量提高，且制备工艺简单，成本降低，适合规模化生产应用。
Description
技术领域
本发明属于红参Rg3制备技术领域，具体涉及一种生物转化制备红参Rg3的方法。
背景技术
人参作为中草药，在亚洲已有上千年的药用历史，人参中包含多种有效成分，如人参皂苷、多糖、氨基酸、有机酸等，其中人参的主要药理作用来自于人参皂苷。目前，人参中已被分离提取出的人参皂苷约有60多种，Rg3就是其中的一种，近年来对人参皂苷-Rg3的药理研究表明，它具有抗肿瘤增长及抗转移作用，并在心血管、神经方面有良好的调节作用，在降血糖和抗疲劳方面也显示出显著的效果。而红参作为人参的加工品，经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干等多道工序炮制后即得，可以作为原料制备红参Rg3。
目前制备红参Rg3的方式有物理方法、化学方法和生物转化法，物理方法和化学方法得到的Rg3含量较低。在已经发现的180多种皂苷中，人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc等占了皂苷总量的50％以上，而被称为稀有人参皂苷的Rg3只占人参干重的0.015％。采用生物转化法可以将含量高的人参皂苷单体转化为稀有人参皂苷Rg3，提高Rg3的含量。
目前已有生物转化法制备人参Rg3的专利申请，如CN109182439B人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，公开了先提取人参总皂苷提取液，再加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3等糖苷酶直接酶解进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物，其方法对于环境友好，转化效率高，但是其采用的酶成本高，不利于生产应用，而且对于提取液进行生物转化，制备得到的Rg3含量少，制备效率低。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种生物转化制备红参Rg3的方法，经过两次生物转化处理，其红参Rg3的转化效率和总制备含量提高，且制备工艺简单，成本降低，适合规模化生产应用。
为实现以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种生物转化制备红参Rg3的方法，包括以下步骤：
S1：将红参粉碎、过筛，再称取粉碎后的红参粉末加水搅拌混合作为培养基，经灭菌、接种、培养、烘干得到生物转化红参；
S2：将生物转化红参粉碎过筛，再加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，在温度28-45℃、200-250r/min恒温振荡条件下进行生物转化反应，反应完成后，用真空抽滤得到滤液；
S3：将滤液用乙醇萃取四次，体积比为1：1，取上层萃取液合并，然后将有机层蒸发，用乙睛溶液溶解，进行柱层析分离制备得到红参Rg3。
进一步地，所述步骤S1过10-20目筛。
进一步地，所述步骤S1中接种黄岗山脉蕈状芽孢杆菌。
进一步地，所述步骤S1中将接种后的培养基放入恒温培养箱重进行培养，温度为25-30℃，时间为25-45d。
进一步地，所述步骤S1中的烘干温度设置为35-45℃。
进一步地，所述步骤S2中黑曲霉发酵培养过程是：将黑曲霉接种袍子接种于平板培养基中，在20-25℃恒温培养4-6d，获得平板孢子；然后将孢子接种至种子培养基中进行扩大培养，得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，过滤，得到粗酶液。
进一步地，所述平板培养基为沙堡氏葡萄糖琼脂培养基；所述种子培养基为查氏培养基。
进一步地，所述扩大培养的温度为32-35℃，在150-200r/min恒温振荡条件下培养24-35h。
进一步地，所述发酵温度为20-25℃，时间为4-5d。
本发明的有益效果是：(1)本发明采用的原料为红参，是人参加工后的熟用品，其经过高温处理后，精氨酸双糖苷含量增高，和人参相比提高了3.78％，在作为培养基时提供了丰富的营养成分，且经过接种后，产生更多特定的糖苷酶，提高后续生物转化的效率；红参中还产生了新的成分麦芽酚，增加了红参香气，可以掩盖人参特有的苦涩味；
(2)本发明采用的是先对红参进行接种培养得到生物转化红参，采用的接种菌是黄岗山脉蕈状芽孢杆菌，作为一种内生菌，可以降解红参的农药残留，提高制备的红参Rg3的品质，以及转化红参皂苷，将含量较多的人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc转化为稀有皂苷Rg3，得到生物转化红参，提高稀有皂苷Rg3的含量，在现有技术中，一般是先将红参中的皂苷提取出来，再进行转化，但这样会对皂苷总量有所损耗，进而减少Rg3的转化效率及转化总量，而本发明是先直接接种内生菌对红参含有的皂苷进行第一次转化，最大限度的提高了转化效率；
(3)现有技术中制备人参Rg3，一般是先将皂苷采用化学方法提取，再进行转化，这样可以集中对皂苷进行转化，显著提高转化效率，但是转化总量却被减少，因为在提取时由于技术的局限性，得到的皂苷量都会有所损耗，加上还要进行转化过滤分离提纯，最终得到的红参Rg3含量少，因此红参Rg3的价格一直居高不下，就是因为其成本高，效率低，而本发明直接以生物转化红参为原料，利用转化能力强的微生物菌种发酵得到的粗酶液生物转化红参进行酶解处理，在粗酶液中糖苷酶的作用下，继续将其他皂苷单体转化为稀有Rg3，其菌种发酵培养基成分简单，发酵成本低，容易培养，而且直接以红参为原料，免去了提取分离操作，也免去了分离纯化步骤，工艺简单，避免人参皂苷的流失损耗，经过两次生物转化，不仅提高了转化效率，而且在一定量的人参中制备的稀有Rg3总量增加，减少成本，更有利于红参Rg3应用推广；
(4)本发明在步骤S2中采用的黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，不仅具有转化为稀有Rg3的作用，而且发酵过程中产生的纤维素酶和糖苷酶，其中纤维素酶破坏红参细胞壁纤维素的致密结构，有助于暴露出酚类物质与其他物质之间结合的化学键，然后纤维素酶、糖苷酶等水解酶系断裂结合态多酚与植物纤维素、半纤维素、木质素以及一些多糖结构连接的共价键，释放出人参中结合态酚类物质，从而使可溶性酚类物质含量增加，使红参中加工形成的副产物容易去除，提高Rg3的纯度，降低提纯难度。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
下述实施例中发酵培养基为现有常规的普通发酵培养基。
实施例1：
一种生物转化制备红参Rg3的方法，包括以下步骤：
S1：称取10g红参粉碎、过10目筛，再称取粉碎后的红参粉末加水搅拌混合作为培养基，经灭菌、接种黄岗山脉蕈状芽孢杆菌、接种后的培养基放入恒温培养箱重进行培养，温度为25℃，时间为45d，烘干得到生物转化红参，烘干温度设置为35℃；
S2：将生物转化红参粉碎过筛，再加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，在温度30℃、200r/min恒温振荡条件下进行生物转化反应，反应完成后，用真空抽滤得到滤液；所述黑曲霉发酵培养过程是：将黑曲霉接种袍子接种于平板培养基中，平板培养基为沙堡氏葡萄糖琼脂培养基；在20℃恒温培养4d，获得平板孢子；然后将孢子接种至种子培养基中进行扩大培养，扩大培养的温度为35℃，在150r/min恒温振荡条件下培养35h，种子培养基为查氏培养基；得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，发酵温度为20℃，时间为5d，过滤，得到粗酶液；
S3：将滤液用乙醇萃取四次，体积比为1：1，取上层萃取液合并，然后将有机层蒸发，用乙睛溶液溶解，进行柱层析分离制备得到红参Rg3。
实施例2：
一种生物转化制备红参Rg3的方法，包括以下步骤：
S1：称取10g红参粉碎、过15目筛，再称取粉碎后的红参粉末加水搅拌混合作为培养基，经灭菌、接种黄岗山脉蕈状芽孢杆菌、接种后的培养基放入恒温培养箱重进行培养，温度为30℃，时间为25d，烘干得到生物转化红参，烘干温度设置为40℃；
S2：将生物转化红参粉碎过筛，再加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，在温度28℃、250r/min恒温振荡条件下进行生物转化反应，反应完成后，用真空抽滤得到滤液；所述黑曲霉发酵培养过程是：将黑曲霉接种袍子接种于平板培养基中，平板培养基为沙堡氏葡萄糖琼脂培养基；在25℃恒温培养6d，获得平板孢子；然后将孢子接种至种子培养基中进行扩大培养，扩大培养的温度为32℃，在200r/min恒温振荡条件下培养24h，种子培养基为查氏培养基；得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25℃，时间为4d，过滤，得到粗酶液；
S3：将滤液用乙醇萃取四次，体积比为1：1，取上层萃取液合并，然后将有机层蒸发，用乙睛溶液溶解，进行柱层析分离制备得到红参Rg3。
实施例3：
一种生物转化制备红参Rg3的方法，包括以下步骤：
S1：将称取10g红参粉碎、过20目筛，再称取粉碎后的红参粉末加水搅拌混合作为培养基，经灭菌、接种黄岗山脉蕈状芽孢杆菌、接种后的培养基放入恒温培养箱重进行培养，温度为28℃，时间为30d，烘干得到生物转化红参，烘干温度设置为45℃；
S2：将生物转化红参粉碎过筛，再加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，在温度45℃、220r/min恒温振荡条件下进行生物转化反应，反应完成后，用真空抽滤得到滤液；所述黑曲霉发酵培养过程是：将黑曲霉接种袍子接种于平板培养基中，平板培养基为沙堡氏葡萄糖琼脂培养基；在24℃恒温培养5d，获得平板孢子；然后将孢子接种至种子培养基中进行扩大培养，扩大培养的温度为34℃，在180r/min恒温振荡条件下培养30h，种子培养基为查氏培养基；得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，发酵温度为22℃，时间为4.5d，过滤，得到粗酶液；
S3：将滤液用乙醇萃取四次，体积比为1：1，取上层萃取液合并，然后将有机层蒸发，用乙睛溶液溶解，进行柱层析分离制备得到红参Rg3。
对比例1：
对比例1与实施例1相比，其不同之处在于，在步骤S1中称取10g红参，研磨成粉末放入离心管中，取30mL甲醇加入100mL离心管中，经超声震荡后，取上清液，过滤得到提取液；然后在步骤S2中加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液进行转化。
对比例2：
对比例2与实施例1相比，其不同之处在于，步骤S1的接种菌种替换为番茄叶霉，其他技术内容与实施例1相同。
对比例3：
对比例3与实施例1相比，其不同之处在于，步骤S2中加入的是β-葡萄糖苷酶进行生物转化反应，其他技术内容与实施例1相同。
将实施例1-3与对比例1-3中得到的红参Rg3用HPLC法检测，检测结果如表1所示。
表1
将实施例1-3和对比例1-3制备得到的红参Rg3进行纯化，采用大孔吸附树脂柱吸附纯化Rg3，得到的Rg3纯度结果如表2所示。
表2
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员理解和使用本发明。熟悉本领域的技术人员可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将红参粉碎、过筛，再称取粉碎后的红参粉末加水搅拌混合作为培养基，经灭菌、接种、培养、烘干得到生物转化红参；
S2：将生物转化红参粉碎过筛，再加入经黑曲霉发酵培养得到的粗酶液，在温度28-45℃、200-250r/min恒温振荡条件下进行生物转化反应，反应完成后，用真空抽滤得到滤液；
S3：将滤液用乙醇萃取四次，体积比为1：1，取上层萃取液合并，然后将有机层蒸发，用乙睛溶液溶解，进行柱层析分离制备得到红参Rg3。
2.根据权利要求1所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述步骤S1过10-20目筛。
3.根据权利要求1所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述步骤S1中接种黄岗山脉蕈状芽孢杆菌。
4.根据权利要求1所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述步骤S1中将接种后的培养基放入恒温培养箱重进行培养，温度为25-30℃，时间为25-45d。
5.根据权利要求1所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述步骤S1中的烘干温度设置为35-45℃。
6.根据权利要求1所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述步骤S2中黑曲霉发酵培养过程是：将黑曲霉接种袍子接种于平板培养基中，在20-25℃恒温培养4-6d，获得平板孢子；然后将孢子接种至种子培养基中进行扩大培养，得到种子液；再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，过滤，得到粗酶液。
7.根据权利要求6所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述平板培养基为沙堡氏葡萄糖琼脂培养基；所述种子培养基为查氏培养基。
8.根据权利要求6所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述扩大培养的温度为32-35℃，在150-200r/min恒温振荡条件下培养24-35h。
9.根据权利要求6所述的一种生物转化制备红参Rg3的方法，其特征在于，所述发酵温度为20-25℃，时间为4-5d。
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