CN111485012B - 一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过固态发酵甘草制备单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)的方法，是一种以甘草为固态培养基主要成分，接入Chaetomium globosumTHS3进行固态培养，发酵结束后甘草中甘草酸(GL)的转化率可达90％以上，形成含GAMG和GL的混合物，可用于制备含GAMG的混合甜味剂或GAMG单体甜味剂，具有更高的甜度和溶解度。该方法直接以廉价、药食同源的甘草为原料进行固态发酵，通过发酵产物的提取、分离纯化和浓缩干燥，可获得高产率和高纯度GAMG，既不需要先提取分离得到GL，也不需要预先制备β‑D‑葡萄糖醛酸苷酶，即可制得目标产物，工艺步骤少、生产成本低、无污染，适合大规模生产。

Description

一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种通过固态发酵技术制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法。
背景技术
由于过量食用糖容易导致龋齿、高血压、糖尿病和其他疾病，因此寻找高甜度、低热量以及安全的天然甜味剂成为人们的迫切需要。甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)植物，为我国重要药食同源的传统中草药。被《中国药典》认定的甘草药材原植物有3种，即乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的根及根茎。目前，甘草提取物在全球广泛被用作食品和饮料中的天然甜味剂，也被用作药剂和膳食补充剂。甘草酸(GL)是甘草中的一种非常重要天然活性物质，其比普通食用糖(蔗糖)甜190倍，并被美国、欧盟和其他国家认为是安全的(GRAS)的甜味剂。此外，GL还具有许多药理学活性，如抗病毒、抗氧化、抗癌和抗炎作用等，因此在功能性食品中具有广阔的应用前景。但GL存在血液中吸收过低、过量摄入可能会干扰离子代谢平衡等问题，由此可能会对动物和人类造成一些不良影响。单葡萄糖醛酸甘草次酸(glycyrrhetinic acidmonoglucuronide，简称GAMG)是通过专一性地水解GL的一个远端葡萄糖醛酸转化而成的，其甜度分别为GL、蔗糖的5倍和1000倍。与GL相比，GAMG具有更好的溶解度、更好的味道、更高的生物利用度、更强的生理活性以及更低的毒副作用(GAMG的LD50为5000mg/kg，而GL的LD50为805mg/kg)。近年来，由于GAMG有益的健康效果而被开发为新型的功能性甜味剂。
GAMG的制备方法主要包括化学法和生物法，而传统的化学法制备GAMG，包括合成和水解两种方法。例如，在Ag2CO3存在的条件下，甘草次酸(GA)与三乙酰溴代葡萄糖甲酯为反应物，生成了的其中一种中间物质经5％KOH的甲醇溶液作用后，生成了GAMG。但是，该方法的合成路线长、收率低，不能用于大量制备GAMG。而传统的化学水解方法，对于GL中的两个不同位置的糖苷键的选择性低，可调控性差，不能实现GAMG的定向水解，因此，水解反应所得的GAMG产率也很低。与传统的化学方法相比，生物法合成GAMG，具有操作简单、反应条件温和、键的选择性强、反应速率快等优点。生物法在提高产品安全性、减少副产物形成和提高经济可行性等方面优于化学法，并且正在成为食品和制药行业中生产高价值生物活性化合物的常用方法。
生物法合成GAMG，是利用微生物菌体所产的β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase)水解GL结构上的β-1,2糖苷键，从而得到水解产物GAMG。目前生物转化法无法满足工业规模生产GAMG的原因主要包括以下几个方面：(1)以GL为底物发酵，不仅价格较为昂贵，而且GL具有强极性和低水溶性，影响微生物对GL的消耗，从而限制了微生物细胞生长和酶的生产；(2)发酵过程中低生物量和酶产量导致GAMG产量低，严重限制了GAMG的工业规模应用；(3)只有少数酶具有GL水解活性，而能选择性地去除GL的一个远端葡糖醛酸而产生GAMG的酶更少，且很多会产生副产物GA，同时造成产物分离较为困难，限制了GAMG的工业规模生产。
综上所述，GAMG是一种功能性甜味剂，具有巨大的开发价值。针对目前工业化生产GAMG存在的技术难点和瓶颈，我们先期获得了多株高效制备GAMG的东乡野生稻内生真菌。在此基础上，本发明提供了一种甘草发酵制备GAMG的方法，可以有效降低生产成本，解决上述问题。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)的方法。
本发明的技术方案如下：通过固态发酵技术，以中药材甘草并添加各种所需物质为固体培养基，接入筛选出的能够专一且高效的转化GL的植物内生真菌菌株，在适宜温度26-30℃的培养箱中静置发酵6-30d。发酵产物经过提取、分离纯化和浓缩干燥，可以制得GAMG的混合物或单体。该方法直接以中药材甘草为原料进行发酵，不需要先制得GL，也不需要专门制备β-D-葡萄糖醛酸苷酶，只需通过植物内生真菌直接固态发酵中药材甘草即可获得高产率的GAMG。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)的方法，包括以下步骤：
1)种子培养；
2)固态培养基的配制；
3)接种发酵；
4)分离纯化。
优选地，步骤1)所述种子培养具体是：液体种子培养基在121℃灭菌25min，将植物内生真菌菌种接种至液体种子培养基，28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液；
步骤1)所述液体种子培养基的制备方法为：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎。
步骤1)所述植物内生真菌为本研究团队筛选出的植物内生真菌Chaetomiumglobosum DX-THS3或Microsphaeropsi sarundinis DX-SES3，其中，ChaetomiumglobosumDX-THS3已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2016年1月4日，保藏号为CCTCC NO:M 2016005。Microsphaeropsi sarundinisDX-SES3已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏时间为2014年5月3日，保藏号为CCTCCNO:M2014177。
优选地，步骤2)所述固态培养基的配制具体是：将购得的中药材甘草清洗、烘干、粉碎，以甘草为主要原料，添加麦麸、稻壳、玉米芯、米糠中的一种或多种，并添加含碳源、氮源以及无机离子的培养液，充分搅拌混匀后，固态培养基在121℃灭菌25min，随后冷却至室温；
步骤2)所述的甘草为豆科、甘草属多年生草本(乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草)的根及根茎，以及各种粉碎规格、含有甘草酸的植株组织或其干燥提取物。
步骤2)所述固态培养基中，甘草添加量占比为80％(m/m)以上；而且在步骤2)中还可以选择性加入的麦麸、稻壳、玉米芯、米糠中的一种或多种，以增加在固态发酵时底物、菌体与空气的接触面积；配制的固态培养基含水量为20％-60％(m/m)。
步骤2)所述含碳源、氮源以及无机离子的培养液的成分为：碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖)5～10g/L；所述氮源(硝酸铵、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、牛肉膏和硝酸钠)1～3g/L；KH2PO4 1.2～2.2g/L；NaCl 0.5～5g/L；硫酸镁0.1～0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.002～0.05g/L；MnSO4·7H2O 0.001～0.004g/L；余量为水，初始pH 5～7。
优选地，步骤3)所述接种发酵具体是：灭菌后，接入种子液，接菌量为培养基总重量的1％-30％，在培养箱中静置培养，发酵过程中，培养基根据菌株特性维持在最适温度范围内，即20℃-35℃，固态发酵培养7-30d后，可得到产率较高的GAMG，且有较高的β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活；
优选地，步骤4)所述分离纯化具体是：步骤3)获得的发酵产物用氨性醇浸泡、提取，即得GAMG的提取液，经分离纯化、真空减压浓缩、真空或喷雾干燥后，获得高产率的GAMG的混合物或单体。
步骤4)中所述氨性醇为含0.1％-2％(v/v)氨水的10％-60％(v/v)甲醇溶液或含0.1％-2％(v/v)氨水的10％-60％(v/v)乙醇溶液。
本发明中固态发酵结束后，甘草中GL的转化率大于90％。所得到的含GAMG的混合甜味剂或新型高效甜味剂GAMG单体，可以添加到功能食品、保健品、化妆品、药品中。
本发明的有益效果在于：
本发明以甘草为原料，可以有效节省现有技术分离提取甘草酸的成本，同时东野内生真菌能够侵染甘草木本植物，利用与破坏其木质纤维素，进一步降解甘草酸的末端的葡萄糖醛酸，该过程采用固态发酵工艺，操作参数简单，易于放大。
本发明中工艺步骤少、生产成本低、无污染，适合大规模生产。
附图说明
图1为甘草固态发酵菌体生长过程图。
图2为所得发酵产物的TLC检测图(1.标准品GL；2.甘草提取液；3.发酵产物提取液；4.标准品GL、GAMG和GA的混合物；5.标准品GAMG；6.标准品GA)。
图3为实施例1制备得到GAMG的UPLC检测图。
图4为UPLC检测图(A.GL、GAMG标准品；B.固态发酵的培养基；C.固态发酵产物)。
具体实施方式
下面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“约”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。
下述实施例中所使用的甘草经测定甘草酸的含量约为4.5％，其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Chaetomium globosum DX-THS3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g麦麸混合，加入50mL培养液(其中含有葡萄糖10g/L；硝酸铵3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵产物结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡150min，超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.49g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.41g，纯度93％，如图3所示。
实施例2、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Chaetomium globosum DX-THS3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g稻壳混合，加入50mL培养液(其中含有蔗糖10g/L；蛋白胨3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵产物结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.50g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.42g，纯度为92％。
实施例3、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Chaetomium globosum DX-THS3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g玉米芯混合，加入50mL培养液(其中含有果糖10g/L；酵母粉3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵产物结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.48g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.40g，纯度为94％。
实施例4、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Chaetomium globosum DX-THS3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g米糠混合，加入50mL培养液(其中含有乳糖10g/L；酵母膏3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵产物结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.48g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.41，纯度为92％。
实施例5、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Chaetomium globosum DX-THS3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g麦麸混合，加入50mL培养液(其中含有葡萄糖10g/L；牛肉膏3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵产物结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.48g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.41g，纯度为92％。
实施例6、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Chaetomium globosum DX-THS3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g麦麸混合，加入50mL培养液(其中含有葡萄糖10g/L；硝酸钠3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.49g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.42g，纯度为93％。
实施例7、一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，包括以下步骤：
1)制备种子培养液：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖20g，搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎，在121℃灭菌25min，降温后接入本研究团队筛选出的一种植物内生真菌Microsphaeropsi sarundinis DX-SES3，于28℃、180rpm摇床培养72h，得种子液。
2)固态发酵：甘草烘干，粉碎至10目，取15g于250mL三角瓶中，与2g麦麸混合，加入50mL培养液(其中含有蔗糖10g/L；蛋白胨3g/L；KH2PO4 2.2g/L；NaCl 0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.0029g/L；MnSO4·7H2O 0.0017g/L，初始pH 6.0)调节湿度，搅拌均匀，在121℃灭菌25min，降温后接入制备好的种子液。接菌量为培养基总重量的10％，置于28℃培养箱中静置培养。发酵培养20d后结束，发酵结果如图2所示。
3)然后在三角瓶中加入含0.5％氨水的10％乙醇溶液50mL，浸泡超声3次，过滤，溶剂洗涤滤渣，合并滤液，UPLC检测GAMG的含量约为0.46g。提取液减压浓缩，有机溶剂萃取，蒸干有机相，得粉末。
4)将上述所得粉末用少量甲醇溶解，将溶解后的溶液上C18色谱柱至全部被吸附，用甲醇：0.5％冰乙酸梯度小→大洗脱，在比例为甲醇：0.5％冰乙酸(v/v)＝80:20时收集流出液，浓缩蒸干后得GAMG 0.38g，纯度为94％。
对比例1：CN 106701604 A的中国专利中公开了一株高效转化甘草酸生产GAMG的东乡野生稻内生真菌及其应用，其采用植物内生菌Chaetomium globosum DX-THS3，以甘草酸(甘草酸盐或甘草粗提物)为碳源，采用液态发酵生产GAMG。其效果最好的实施例2，甘草酸的转化率为88.7％，GAMG的生成率为86.4％。
对比例2：CN103981194A的中国专利中公开了一株内生真菌及其生物转化甘草酸为甘草次苷的方法，其采用植物内生菌Microsphaeropsi sarundinis DX-SES3进行液态发酵，能在甘草酸的诱导下产生β-葡萄糖醛酸苷酶，进而催化甘草酸生产GAMG。其实施例3中甘草酸的转化率为80.5.7％，GAMG的生成率为75.2％。
表1实施例1-7甘草中GL的转化情况
Figure BDA0001957976730000101
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：直接采用甘草为原料进行发酵，得到单葡萄糖醛酸甘草次酸，发酵方法为固态发酵，发酵菌种为植 物内生真菌 ChaetomiumglobosumDX-THS3 或 Microsphaeropsi sarundinis DX-SES3，其中，Chaetomium globosumDX-THS3 已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为 湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为 2016 年 1 月 4 日，保藏号为 CCTCC NO:M 2016005，Microsphaeropsisarundinis DX-SES3 已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址 为湖北省武汉市武汉大学，保藏时间为 2014 年 5 月 3 日，保藏号为 CCTCCNO:M2014177；
所述一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法包括以下步骤：
1)种子培养 步骤 1)所述种子培养具体是：液体种子培养基在 121℃灭菌 25min，将植物内生真 菌菌种接种至液体种子培养基，28℃、180rpm 摇床培养 72h，得种子液；
2)固态培养基的配制 步骤 2)所述固态培养基的配制具体是：将购得的中药材甘草清洗、烘干、粉碎， 以甘草为主要原料，添加麦麸、稻壳、玉米芯、米糠中的一种或多种，并添加含碳源、氮源以及无机离子的培养液，充分搅拌混匀后，固态培养基在 121℃灭菌25min，随后 冷却至室温，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖或乳糖，所述氮源为硝酸铵、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、牛肉膏或硝酸钠；
3)接种发酵 步骤 3)所述接种发酵具体是：灭菌后，接入种子液，接菌量为培养基总重量的 1％ -30％，在培养箱中静置培养，发酵过程中，培养基根据菌株特性维持在最适温度范围内，即20℃-35℃，固态发酵培养7-30d 后，可得到产率较高的 GAMG，且有较高的 β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活。
2.如权利要求 1 所述的一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：所述的甘草为豆科、甘草属多年生草本乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的根 及根茎，以及各种粉碎规格、含有甘草酸的植株组织或其干燥提取物。
3.如权利要求 1-2 任一项所述的一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：还包括以下步骤：
4)分离纯化 步骤 4)所述分离纯化具体是：步骤 3)获得的发酵产物用氨性醇浸泡、提取，即得 GAMG 的提取液，经分离纯化、真空减压浓缩、真空或喷雾干燥后，获得高产率的GAMG 的混合物或单体。
4.如权利要求 3 所述的一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：步骤 1)所述液体种子培养基的制备方法为：称取 200g 马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮沸 20～30 分钟，用八层纱布过滤，加葡萄糖 20g，搅拌混匀，稍冷却后再 补足水分至1000mL，分装至三角瓶，加塞、包扎。
5.如权利要求 3 所述的一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：步骤 2)所述固态培养基中，甘草添加量占比为 80％以上。
6.如权利要求 3 所述的一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：步骤 2)所述含碳源、氮源以及无机离子的培养液的成分为：碳源 5～10g/L；所 述氮源1～3g/L；KH 2 PO 4 1.2～2.2g/L；NaCl 0.5～5g/L；硫酸镁0.1～0.5g/L； ZnSO 4 ·7H 2O 0.002～0.05g/L；MnSO 4 ·7H 2 O 0.001～0.004g/L；余量为水， 初始 pH 5～7。
7.如权利要求 3 所述的一种甘草发酵制备单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，其特征在于：步骤 4)中所述氨性醇为含 0.1％-2％(v/v)氨水的 10％-60％(v/v)甲醇溶液或含0.1％-2％(v/v)氨水的 10％-60％(v/v)乙醇溶液。
8.采用权利要求 1-7 任一项方法制备得到的含单葡萄糖醛酸甘草次酸的混合甜味剂或单葡萄糖醛酸甘草次酸单体在食品、化妆品、药品中的应用。
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