CN112999127A - 一种龙胆复方酵素及其制备方法和应用 - Google Patents

一种龙胆复方酵素及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种龙胆复方酵素的制备方法，包括以下步骤：S10、选取新鲜的龙胆草、獐芽菜和积雪草粉碎、过筛，然后加入去离子水溶解过筛后的粉体，获得溶解液；S20、在溶解液中加入纤维素酶和果胶酶进行酶解处理，获得酶解液；S30、在酶解液中加入酵母膏、蛋白胨和葡萄糖，然后进行灭菌处理，获得灭菌液；S40、在灭菌液中接种由酿酒酵母和植物乳杆菌组成的菌株组合并进行发酵处理，获得龙胆复方酵素。采用本发明的方法制备的龙胆复方酵素，有效物质含量高，应用于日化产品中可加强皮肤机能，改善皮肤状况，有很好的抗敏舒缓和抗氧化功效。

Description

一种龙胆复方酵素及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及日化产品技术领域，具体涉及一种龙胆复方酵素及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们对健康生活和环境的重视，化学合成原料带来的副作用不断增加消费者的担忧，日化产品越来越崇尚天然。目前国内日化产品植物原料应用的较多的是以提取物形式加入，由于工艺的限制，提取物有效成分含量低，功效无法保证。提取一般根据植物活性成分的极性选择合适的溶剂，极性大的成分一般选择水提法，极性小的成分一般选择醇提法，醇提法一般会用丙二醇、丁二醇、甘油等，最终产品醇的含量一般会超过25％，违背了天然原料的初衷。提取法由于工艺门槛低，市场上产品良莠不齐，产品有效含量不标注，批次间稳定性差，产品的安全性测试中的刺激性较大，有的甚至不做安全性和功效性测试，概念性产品多。
植物酵素由于其绿色环保，生物可降解，安全性高，已经成为当今日化产品的发展趋势。植物发酵技术在日化产品中的应用也存在一些不足之处。通过发酵得到的产品有效物质含量偏低，添加到日化产品中之后使用效果不佳。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种龙胆复方酵素及其制备方法，采用该制备方法可以制得有效物质含量高的龙胆复方酵素。
本发明的目的之二在于提供一种龙胆复方酵素在日化产品中的应用，可以使日化产品具有良好的使用效果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，提供一种龙胆复方酵素的制备方法，包括以下步骤：
S10、选取新鲜的龙胆草、獐芽菜和积雪草粉碎、过筛，然后加入去离子水溶解过筛后的粉体，获得溶解液；
S20、在所述溶解液中加入纤维素酶和果胶酶进行酶解处理，获得酶解液；
S30、在所述酶解液中加入酵母膏、蛋白胨和葡萄糖，然后进行灭菌处理，获得灭菌液；
S40、在所述灭菌液中接种由酿酒酵母和植物乳杆菌组成的菌株组合并进行发酵处理，获得龙胆复方酵素。
其中，龙胆草功能成分为裂环烯醚萜甙类：龙胆苦甙(gentiopicroside)，当药苦甙(swertiamarin)，当药甙(sweroside)，苦龙胆酯甙(amarogentin)；苦甙总含量可高达7.33％。龙胆苦苷具有抗炎活性，龙胆碱具有抗菌活性，龙胆酸具抑制酪氨酸酶的活性，能够抑制黑色素生成，积雪草《神农本草经》记载，积雪草：味苦寒，主治大热，恶疮痈疽，浸淫赤熛，皮肤赤，身热，生川谷。积雪草甘通过促进成纤维细胞增殖、抗菌和抗氧化活性而有效地增加愈合组织中的羟脯氨酸含量、抗张力强度、胶原含量，具有较好修复皮肤屏障作用。獐芽菜《民族药志三》记载：全草用于痈肿疮毒，红肿热痛，乳痈初起，肺热咳嗽，烧烫伤，湿热黄疸性肝炎，腹泻，慢性咽喉红肿；根主治牙痛。
本发明以新鲜的龙胆草、獐芽菜和积雪草组合作为提取原料，通过微生物发酵技术转化中草药，微生物进行自身生长繁殖等生理活动会产生丰富而强大的酶系，这些生物酶正是微生物发酵中药过程中中药发生结构改变的物质基础，酶催化反应中药成分被分解转化形成新成分，降低了毒性；植物组织中大多数有效成分也得到了充分的溶出和转化，大幅度提高药物有效成分含量，即最大限度保留了龙胆草、积雪草、獐芽菜中龙胆苦苷、积雪草苷、獐芽菜苷含量，从而实现减毒增效。与一般的物理或化学方法相比，本发明的方法可以更大幅度地改变药性，减毒增效，扩大药物适用范围，明确药物作用机理；采用本发明的方法制备的龙胆复方酵素，可加强皮肤机能，改善皮肤状况，有很好的抗敏舒缓和抗氧化功效。
进一步地，步骤S40中，按所述灭菌液的质量计，所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌组成的菌株组合的接种量为10％，且所述酿酒酵母的接种量和所述植物乳杆菌的接种量之比为1:1。通过控制接种量以及选用特定比例的菌株组合，对接种后的灭菌液进行生物发酵处理，可以使生物发酵后获得的龙胆复方酵素的有效含量大幅提高。
具体地，发酵温度为30℃，发酵时间为72h。
步骤S10中，按重量份计，龙胆草的用量为5～10份，例如5份、5.1份、5.2份、5.3份、5.5份、5.8份、6份、6.2份、6.5份、6.8份、7份、7.5份、8份、8.5份、9份、9.5份或者10份，獐芽菜的用量为1～5份，例如1份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.8份、4份、4.3份、4.5份、4.8份或者5份，积雪草的用量为1～5份，例如1份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份、3.2份、3.5份、3.8份、4份、4.3份、4.5份、4.8份或者5份。
进一步地，步骤S10中，所述龙胆草、所述獐芽菜和所述积雪草的质量比为(5～10):(1～5):(1～5)；本发明利用龙胆草、积雪草、獐芽菜这三种原料各自的功效，并将其含量控制在最佳比例内进行搭配，通过酿酒酵母加植物乳杆菌生物发酵，最终得到的产品具有很好的抗敏舒缓和抗氧化功效。
优选地，采用80目筛对粉碎后的粉体进行过筛，过筛后的粉体采用适量的去离子水可以进行充分溶解。
进一步地，过筛后的粉体质量与溶解该粉体所用的去离子水的质量比为1:2～1:5，优选为1:3，以使过筛后的粉体充分溶解。
进一步地，步骤S20具体为：按所述溶解液的质量计，加入0.2～0.5％纤维素酶和0.2～0.5％果胶酶进行酶解处理；
优选地，酶解时间为60～120min。
进一步地，步骤S30具体为：按所述酶解液的质量计，在所述酶解液中加入1％酵母膏、2％蛋白胨和2％葡萄糖，然后进行灭菌处理。
其中，灭菌处理是指在115℃灭菌15min。
另一方面，本发明提供一种采用所述的制备方法制得的龙胆复方酵素，该龙胆复方酵素由以下原料制得：龙胆草、积雪草、獐芽菜、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、纤维素酶、果胶酶和去离子水；
其中，所述龙胆草、所述积雪草和所述獐芽菜的质量比为(5～10):(1～5):(1～5)。
再一方面。本发明提供一种采用所述的制备方法制得的龙胆复方酵素在日化产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明以新鲜的龙胆草、獐芽菜和积雪草组合作为提取原料，通过微生物发酵技术转化中草药，微生物进行自身生长繁殖等生理活动会产生丰富而强大的酶系，这些生物酶正是微生物发酵中药过程中中药发生结构改变的物质基础，酶催化反应中药成分被分解转化形成新成分，降低了毒性；植物组织中大多数有效成分也得到了充分的溶出和转化，大幅度提高药物有效成分含量，即最大限度保留了龙胆草、积雪草、獐芽菜中龙胆苦苷、积雪草苷、獐芽菜苷含量，从而实现减毒增效。与一般的物理或化学方法相比，本发明的方法可以更大幅度地改变药性，减毒增效，扩大药物适用范围，明确药物作用机理；采用本发明的方法制备的龙胆复方酵素，可加强皮肤机能，改善皮肤状况，有很好的抗敏舒缓和抗氧化功效。
附图说明
图1是本发明实施例的测试试验3所述的对透明质酸酶的抑制率的柱状图。
图2是本发明实施例的测试试验4所述的对DPPH自由基清除率的柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本技术领域的常规方法制备得到。
实施例1
本实施例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草10份、獐芽菜5份、积雪草5份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照菌株组合酿酒酵母加植物乳杆菌1:1、接种量10％接入菌种
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
实施例2
本实施例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草8份、獐芽菜4份、积雪草4份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照菌株组合酿酒酵母加植物乳杆菌1:1、接种量10％接入菌种
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
实施例3
本实施例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草6份、獐芽菜5份、积雪草5份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照菌株组合酿酒酵母加植物乳杆菌1:1、接种量10％接入菌种
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
实施例4
本实施例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草10份、獐芽菜3份、积雪草3份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照菌株组合酿酒酵母加植物乳杆菌1:1、接种量10％接入菌种
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
对比例1
本对比例采用醇提法制备龙胆复方酵素：
1、按重量份称取新鲜龙胆草10份、獐芽菜5份、积雪草5份，粉碎，过80目筛后获得粉体，并溶解于粉体质量3倍的去离子水中，获得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量的0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，搅拌均匀后，处理60-120min，获得酶解液；
3、在酶解液中加入40重量份丙二醇，加热至65℃，保温搅拌4-6小时。
对比例2
本对比例采用水提法制备龙胆复方酵素：
1、按重量份称取新鲜龙胆草10份、獐芽菜5份、积雪草5份，粉碎，过80目筛后获得粉体，并溶解于粉体质量3倍的去离子水中，获得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量的0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，搅拌均匀后，处理60-120min，获得酶解液；
3、将酶解液加热至煮沸，保持微沸2-3小时，分离煎出液，药渣依法再煎一次，将两次煎煮液混合。
对比例3
本对比例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草13份、獐芽菜7份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照菌株组合酿酒酵母加植物乳杆菌1:1、接种量10％接入菌种；
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
对比例4
本对比例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草13份、积雪草7份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照菌株组合酿酒酵母加植物乳杆菌1:1、接种量10％接入菌种；
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
对比例5：
本实施例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草10份、獐芽菜5份、积雪草5份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照接种量10％接种酿酒酵母；
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
对比例6：
本实施例的龙胆复方酵素的制备方法包括以下步骤：
1、按重量份称取新鲜龙胆草10份、獐芽菜5份、积雪草5份，粉碎，过80目筛后加入粉体质量3倍的去离子水进行溶解，制得溶解液；
2、在溶解液中加入溶解液质量0.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶，处理60～120min，制得酶解液；
3、在酶解液中加入酶解液质量的1％Yeast Extract(酵母膏)、2％Peptone(蛋白胨)、2％Dextrose(glucose)(葡萄糖)并转移至生物反应器115℃灭菌15min，制得灭菌液；
4、在灭菌液中按照接种量10％接种植物乳杆菌；
5、设置发酵温度30℃、发酵时间72h。
测试试验1：
通过龙胆苦苷含量测试，评价化学提取工艺与生物发酵工艺对有效物含量的影响。具体参照《中国药典2015版》龙胆苦苷含量测试方法进行测定，测定结果见表1。
表1.对比例1-6及实施例1-4制得的龙胆复方酵素中的龙胆苦苷含量
Figure BDA0002978660580000071
由表1可知，本发明实施例1-4及对比例3-4使用生物发酵工艺对龙胆苦苷的提取含量可高达1709mg/kg，远远高于对比例1-2等传统化学提取工艺制得的复方酵素中龙胆苦苷的提取含量。且单独采用其中一种菌株接种入灭菌液中进行生物发酵，制得的提取物中的龙胆苦苷的含量远远小于采用酿酒酵母和植物乳杆菌的复合菌进行接种发酵后制得的提取物中的龙胆苦苷含量。
测试试验2：
通过刺激性测试，评价化学提取工艺与生物发酵工艺刺激性，具体参照化妆品眼刺激/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验《SN/T 2329-2009》进行测试，结果如下表2：
表2.对比例1-6及实施例1-4制得的龙胆复方酵素的刺激性测试结果
分组 出血时间(S) 血管溶解时间(S) 凝血时间(S) 刺激性评分
阴性对照组 301 301 301 0
阳性对照组 10 38 115 16.57
对比例1 140.3 301 301 2.68
对比例2 152.7 301 301 2.47
对比例3 301 301 301 0
对比例4 301 301 301 0
对比例5 301 301 301 0
对比例6 301 301 301 0
实施例1 301 301 301 0
实施例2 301 301 301 0
实施例3 301 301 301 0
实施例4 301 301 301 0
注：阴性对照：0.9％氯化钠溶液，表示无刺激物；阳性对照：0.1mol/L氢氧化钠溶液，表示强刺激物。
由表2可知，本发明实施例1-4及对比例3-4使用生物发酵工艺通过鸡胚绒毛尿囊膜试验评价均为无刺激，使用传统醇提法和水提法制备的样品均为轻刺激。说明通过生物发酵技术转化中草药，与一般的物理或化学方法相比可以更大幅度地改变药性，减毒增效，扩大产品适用范围。
测试试验3：
采用透明质酸酶活性抑制试验来评价实施例1、实施例3-4及龙胆草酵素、獐芽菜酵素、积雪草酵素抗敏效果，测试结果见图1。由图1可知，实施例1、实施例3-4制得的龙胆复方酵素及各单方酵素均对透明质酸酶活性有抑制效果。其中实施例1在5mg/mL浓度下对透明质酸酶活性抑制达到60％以上，接近单方龙胆酵素10mg/mL浓度下对透明质酸酶活性抑制率。由龙胆草、獐芽菜、积雪草三种原料制得的龙胆复方酵素对透明质酸酶活性抑制率明显高于任一种或者两种原料制得的产品。
对实施例2-4进行试验，也得到相近的实验结果，具体不再赘述。
测试试验4：
采用DPPH自由基清除率试验来评价实施例1、实施例3-4及龙胆草酵素、獐芽菜酵素、积雪草酵素抗氧化效果，测试结果见图2。由图2可知，实施例1、实施例3-4制得的龙胆复方酵素及各单方酵素均对DPPH自由基清除有效果。其中实施例1在5mg/mL浓度下对DPPH自由基清除达到58.7％，超过其它单方龙胆酵素10mg/mL的清除效果。由龙胆草、獐芽菜、积雪草三种原料制得的龙胆复方酵素对DPPH自由基清除率明显高于由任一种或者两种原料且采用同样的生物发酵方法制得的产品。
对实施例2-4进行试验，也得到相近的实验结果，具体不再赘述。
以上实施例仅用来说明本发明的详细方法，本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、选取新鲜的龙胆草、獐芽菜和积雪草粉碎、过筛，然后加入去离子水溶解过筛后的粉体，获得溶解液；
S20、在所述溶解液中加入纤维素酶和果胶酶进行酶解处理，获得酶解液；
S30、在所述酶解液中加入酵母膏、蛋白胨和葡萄糖，然后进行灭菌处理，获得灭菌液；
S40、在所述灭菌液中接种由酿酒酵母和植物乳杆菌组成的菌株组合并进行发酵处理，获得龙胆复方酵素。
2.根据权利要求1所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，步骤S40中，按所述灭菌液的质量计，所述酿酒酵母和所述植物乳杆菌组成的菌株组合的接种量为10％，且所述酿酒酵母的接种量和所述植物乳杆菌的接种量之比为1:1。
3.根据权利要求2所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，发酵温度为30℃，发酵时间为72h。
4.根据权利要求1所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，步骤S10中，所述龙胆草、所述獐芽菜和所述积雪草的质量比为(5～10):(1～5):(1～5)；
优选地，采用80目筛对粉碎后的粉体进行过筛。
5.根据权利要求4所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，过筛后的粉体质量与溶解该粉体所用的去离子水的质量比为1:2～1:5，优选为1:3。
6.根据权利要求1所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，步骤S20具体为：按所述溶解液的质量计，加入0.2～0.5％纤维素酶和0.2～0.5％果胶酶进行酶解处理；
优选地，酶解时间为60～120min。
7.根据权利要求1所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，步骤S30具体为：按所述酶解液的质量计，在所述酶解液中加入1％酵母膏、2％蛋白胨和2％葡萄糖，然后进行灭菌处理。
8.根据权利要求7所述的龙胆复方酵素的制备方法，其特征在于，灭菌处理是指在115℃灭菌15min。
9.一种采用权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的龙胆复方酵素，其特征在于，由以下原料制得：龙胆草、积雪草、獐芽菜、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、纤维素酶、果胶酶和去离子水；
其中，所述龙胆草、所述积雪草和所述獐芽菜的质量比为(5～10):(1～5):(1～5)。
10.一种采用权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的龙胆复方酵素在日化产品中的应用。
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