CN102174621A

CN102174621A - 一种槐角异黄酮苷元提取物的制备及分析方法

Info

Publication number: CN102174621A
Application number: CN2010106198874A
Authority: CN
Inventors: 袁毅; 伍阳
Original assignee: Huabao Edible Essence and Spice Shanghai Co Ltd
Current assignee: Huabao Flavours and Fragrances Co Ltd
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明涉及一种槐角异黄酮苷元提取物，其制备方法主要通过将将洁净干燥槐角粉碎后用水浸提，向其中的滤液加入糖苷酶或果胶酶，离心过滤后向沉淀物加入乙醇溶液以去除杂质，再对静置后的溶液进行离心，对所得上清液进行浓缩、喷雾干燥，得到槐角异黄酮苷元提取物。本发明还涉及根据所述方法制备的槐角异黄酮苷元提取物，以及所述槐角异黄酮苷元提取物的分析方法。

Description

一种槐角异黄酮苷元提取物的制备及分析方法

【技术领域】

本发明涉及化合物提取领域。更具体地，本发明涉及一种槐角异黄酮苷元提取物的其制备及分析方法。

【背景技术】

异黄酮(isoflavone)是植物苯丙氨酸代谢过程中，由肉桂酰辅酶A侧链延长后环化形成以苯色酮环为基础的酚类化合物，其3-苯基衍生物即为异黄酮，属植物次生代谢产物。类黄酮属，是一种芳香族含氧杂环化合物，黄酮的异构体。又由于与女性荷尔蒙及雌激素作用类似，故也被称为植物雌激素，其母核结构为3-苯并呋喃酮，是存在于大豆等豆科植物中一类重要的生物活性物质。有些异黄酮是植保素，有些在医学上具有积极效果。异黄酮在医学上被发现具有预防骨质疏松、乳腺癌、前列腺癌，降低胆固醇以及抗氧化等多种的生理活性，同时具有调节血脂、降低胆固醇和预防心血管疾病等功能。

近年来，关于对富含异黄酮苷元提取物研究最多的是大豆植物，其提取物中异黄酮类化合物中主要的有效成分是大豆苷元和染料木素。工业上通常采用脂肪族醇醚或者采用一定浓度的脂肪族醇醚的水溶液作为溶剂进行多次浸提得到。此外，还可采用正己烷溶剂对大豆进行破碎，去除脂质类物质并浓缩得到残留物，向残留物中加入一定浓度甲醇溶液进一步浸提、过滤、减压浓缩，最后酸水解得到。

槐角，为我国常用中药材，豆科植物槐(Sophora japonica L.)的干燥花及花蕾、成熟果实。槐角剥皮后，呈棕色或者黄褐色，其种子呈棕黑色，性微苦、寒，归肝、大肠经，有清热泻火、凉血止血的功能。槐角含多种黄酮及异黄酮化合物，其中有效成分异黄酮苷元在槐角中主要和糖链以糖苷键方式存在。槐米的主要成分如芸香甙-芦丁和鞣质。花蕾中还含有与芸香甙不同的黄酮类物质-槐花米甲素，甾醇类物质-槐花米乙素和丙素，以及三萜皂甙和葡萄糖等。槐角主要成分：多种黄酮、异黄酮化合物和多种氨基酸。目前，从果皮中又分离出槐角甙、槐属双甙、染料木甙及其甙元染料木素、芦丁、槐角黄酮甙及其甙元山柰酚以及5，4’-二羟基黄酮-3，7-二糖甙。种子含有金雀花碱苦参碱及槐根碱等生物碱。

据报道，大豆中糖苷型异黄酮含量只有0.5-2.0g/kg，而槐角中糖苷型异黄酮含量达20.0-30.0g/kg。糖苷型异黄酮及其衍生物的生物活性比较低，很难被人体吸收，工业上通常将糖苷型异黄酮水解成具有较高的生理功能作用的苷元。考虑到糖苷型异黄酮降解的反应条件、安全性、生产成本等问题，本申请人首次尝试采用酶法水解异黄酮糖苷，从槐角中获得异黄酮苷元提取物。

【发明内容】

[发明要解决的问题]

本发明的目的是提供一种槐角异黄酮苷元提取物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供槐角异黄酮苷元提取物。

本发明的另一个目的是提供槐角异黄酮苷元提取物的分析方法。

[技术方案]

本发明涉及一种槐角异黄酮苷元提取物的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)将槐角清洁并干燥后进行粉碎，然后以槐角粉末重量计加入5-20倍水或30％乙醇溶液，置于90-100℃水浴中搅拌提取2-5h，获得浸提液；

(2)步骤(1)得到的浸提液冷却至50-60℃，过滤后得到滤液；

(3)往步骤(2)得到的滤液中加入酶，然后离心过滤，得到沉淀物；

(4)往步骤(3)得到的沉淀物中添加乙醇溶液，得到的混合物充分振荡20-60min后再静置120-240min，得到异黄酮苷元的醇溶液；

(5)步骤(4)得到的溶液进行离心，得到的上清液经过浓缩、喷雾干燥，得到槐角异黄酮苷元提取物。

根据本发明的一种优选实施方式，步骤(1)中槐角粉碎后过10-100目筛。

根据本发明的另一种优选实施方式，步骤(2)中，步骤(1)得到的浸提液在冷却后先用100目滤筛去除沉淀，再用200目滤筛进行过滤，得到滤液。

根据本发明的另一种优选实施方式，步骤(3)中，加入的酶是糖苷酶或果胶酶，酶的加入量是以滤液体积计0.1-1％。

根据本发明的另一种优选实施方式，步骤(3)中，酶与滤液的混合物在50-60℃温度条件下保持10-24h，再进行离心过滤。

根据本发明的另一种优选实施方式，步骤(4)中，往沉淀物中添加的乙醇溶液是以步骤(3)得到的沉淀物的重量计，5-15倍90-95％浓度的乙醇溶液。

本发明还涉及一种根据以上方法制备得到的槐角异黄酮苷元提取物。

本发明还涉及所述提取物的分析方法，它包括以下步骤：

(1)精确称取按照以上方法制备得到的产品，100％甲醇溶液定容，经稀释、过滤得到样品溶液；

(2)精确称取大豆苷元、染料木素对照品，用100％甲醇溶液配成含大豆苷元、染料木素的混合标准溶液，测定前稀释10倍，即为对照品溶液；

(3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，按色谱条件进行分析，以峰面积外标法计算步骤(1)中样品溶液中的异黄酮苷元的含量。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述分析方法的色谱条件为：Diamonsil ODS C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱；柱温30℃；流动相：0-30min，乙酸-乙腈-水(1∶20∶79)，30-70min，乙酸-乙腈-水(1∶40∶59)；流速0.70-0.95mL/min；检测波长265nm。

下面详细地说明本发明。

本发明涉及一种槐角异黄酮苷元提取物的制备方法。

所述方法的步骤包括：

(1)将槐角清洁并干燥后进行粉碎，然后以槐角粉末重量计加入5-20倍水或30％乙醇溶液，置于90-100℃水浴中搅拌提取2-5h，获得浸提液。

槐角可以是市场上销售的槐角，例如是安国市济世中药材有限公司销售的产品。槐角在购回后，先充分清洗，去除表面的灰尘、杂质，然后晾晒至干燥。然后仔细研磨，再用10-100目筛，得到粉末。滤筛可以是本技术领域中常用的滤筛，例如是上海海唐筛网滤布织造有限公司销售的系列标准筛。

精确称量得到的槐角粉末，以粉末的重量计，加入5-20倍水或30％乙醇溶液，置于90-100℃水浴中搅拌提取2-5h，获得浸提液。

(2)步骤(1)得到的浸提液冷却至50-60℃，过滤后得到滤液。

采用本技术领域常用的冷却设备，将步骤(1)得到的浸提液冷却至50-60℃。先用100目滤筛去除沉淀，再用200目滤筛进行过滤，得到滤液。

(3)往步骤(2)得到的滤液中加入酶，然后离心过滤，得到沉淀物。

精确称量步骤(2)得到的滤液，以滤液的体积计，向冷却的滤液中加入0.1-1体积％物料比的酶。

酶可以是糖苷酶或果胶酶。糖苷酶，也称为糖苷水解酶，是作用各种糖苷或寡糖使糖苷键水解的酶的总称。糖苷酶例如是高宝绿色科技集团有限公司生产销售的α-半乳糖苷酶，活力为＞300IU/mg。果胶酶，由黑曲霉经发酵精制而得，主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。果胶酶例如是上海素莱宝生物科技有限公司生产销售的果胶酶，活力为＞50000IU/mg。

离心过滤得沉淀，去除多余的酶反应液。

接着，上述酶与滤液的混合物在50-60℃温度条件下保持10-24h，然后进行离心过滤。离心时使用的是本技术领域常用的离心设备，离心速度可以是例如3000r/min。离心后过滤得到沉淀物。

(4)往步骤(3)得到的沉淀物中添加乙醇溶液，得到的混合物充分振荡20-60min后再静置120-240min，得到异黄酮苷元的醇溶液。

由于异黄酮苷元可溶于乙醇溶液，以步骤(3)得到沉淀物的重量计，向所述沉淀物中添加5-15倍的90-95％浓度乙醇溶液，以去除糖和蛋白等杂质。所述溶液经充分振荡20-60min后，再静置120-240min。

将步骤(4)中静置后的醇溶液离心，将离心后得到的上清液进行适当的浓缩，例如浓缩至原溶液体积的10-20％。

接着，将浓缩后的浸提液进行喷雾干燥，得到干燥的提取物粉末。喷雾干燥采用的设备是本技术领域常用的设备，例如是上海劲雷机械科技有限公司生产销售的SP-1500型喷雾干燥机。

本发明还涉及所述提取物的HPLC分析方法，它包括以下步骤：

(1)精确称取按照以上方法制得的产品，用100％甲醇溶液定容，经稀释、过滤得到样品溶液。

首先精确称取一定量的槐角提取物粉末，溶解在100％浓度的甲醇溶液中，然后用微孔滤膜过滤，微孔滤膜的孔隙度例如是0.45μm。由此得到样品溶液。

(2)精确称取大豆苷元、染料木素对照品，用100％甲醇溶液配成含大豆苷元、染料木素的混合标准溶液，测定前稀释10倍，即为对照品溶液。

其中，所述的大豆苷元及染料木素等标准品例如可以是美国Sigma公司生产销售的产品。

精密吸取步骤(1)得到的样品溶液，进HPLC分析仪，例如使用Diamonsil ODS C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，柱温30℃。采用梯度洗脱，初始可采用乙酸-乙腈-水(1∶20∶79)流动相，洗脱时间0-30min，然后再用乙酸-乙腈-水(1∶40∶59)流动相，洗脱时间30-70min。流动相的流速为0.70-0.95mL/min。检测波长为265nm。

然后重复以上步骤，对步骤(2)对照品溶液进行分析，以峰面积外标法计算步骤(1)中样品溶液中的异黄酮苷元的含量。

[有益效果]

目前大多数工业分离提取异黄酮苷元都是采用酸水解方法，该法存在许多不足，如异黄酮糖苷苛刻的降解反应条件、繁杂的反应步骤、低产量、高成本等；此外，酸水解得到的异黄酮苷元应用在食品医药中会带来一定程度的危害。本发明方法采用糖苷酶水解糖苷型异黄酮，在获得更具良好生物吸收性的异黄酮苷元的同时，提升了分离提取过程的安全性。本发明方法工艺简单，成本低廉，市场前景和应用价值良好。

【具体实施方式】

下面非限制性实施例用于更详细地说明本发明。

实施例1

一种槐角异黄酮苷元提取物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)将槐角清洁并干燥后称取10g进行粉碎，磨碎后过40目筛，然后加入100克水，置于100℃水浴中搅拌提取3h，获得浸提液110g；

(2)步骤(1)得到的110g浸提液冷却至55℃，用100目的滤布粗过滤后，滤液再过200目滤布，过滤后得到滤液100ml；

(3)往步骤(2)得到的100ml滤液中加入1mL糖苷酶液，55℃条件下保温反应16h，然后离心过滤，得到沉淀物2.5g；

(4)往步骤(3)得到的2.5g沉淀物中添加15ml的90％浓度乙醇溶液，得到的混合物充分振荡30min后再静置120min，得到异黄酮苷元的醇溶液16ml；

(5)步骤(4)得到的16ml溶液进行离心，得到的上清液浓缩至原溶液的10％体积，再进行喷雾干燥，得到0.27g槐角异黄酮苷元提取物粉末。

槐角提取物中异黄酮苷元含量的HPLC分析方法，其步骤如下：

首先取1mg槐角提取物粉末溶解在1mL100％浓度甲醇溶液，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，吸取10μL的过滤液进HPLC分析仪(C₁₈柱)，采用梯度洗脱，初始采用20％乙腈-1％乙酸流动相，30min后采用40％乙腈-1％乙酸流动相，流动相流速为0.85mL/min，检测波长为265nm。经HPLC分析得到槐角提取物中异黄酮含量达到857.2g/kg，其中试验所需的大豆苷元及染料木素等标准品均购自美国Sigma公司。

实施例2

一种槐角异黄酮苷元提取物的制备方法，它包括以下步骤：

(1)将槐角清洁并干燥后称取15g进行粉碎，磨碎后过60目筛，然后加入150克30％乙醇溶液，置于100℃水浴中搅拌提取5h，获得浸提液165g；

(2)步骤(1)得到的165g浸提液冷却至60℃，用100目的滤布粗过滤后，滤液再过200目滤布，过滤后得到滤液150ml；

(3)往步骤(2)得到的150ml滤液中加入1.2mL糖苷酶液，60℃条件下保温反应24h，然后离心过滤，得到沉淀物3.5g；

(4)往步骤(3)得到的3.5g沉淀物中添加35ml的95％浓度乙醇溶液，得到的混合物充分振荡60min后再静置180min，得到异黄酮苷元的醇溶液37ml；

(5)步骤(4)得到的37ml溶液进行离心，得到的上清液浓缩至原溶液的10％体积，再进行喷雾干燥，得到0.39g槐角异黄酮苷元提取物粉末。

槐角提取物中异黄酮苷元含量的HPLC分析方法，其步骤如下：

首先取1mg槐角提取物粉末溶解在1mL100％浓度甲醇溶液，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，吸取10μL的过滤液进HPLC分析仪(C₁₈柱)，采用梯度洗脱，初始采用20％乙腈-1％乙酸流动相，30min后采用40％乙腈-1％乙酸流动相，流动相流速为0.9mL/min，检测波长为265nm。经HPLC分析得到槐角提取物中异黄酮含量达到858.4g/kg，其中试验所需的大豆苷元及染料木素等标准品均购自美国Sigma公司。

Claims

1.一种槐角异黄酮苷元提取物的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(2)步骤(1)得到的浸提液冷却至50-60℃，过滤后得到滤液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中槐角粉碎后过10-100目筛。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，步骤(1)得到的浸提液在冷却后先用100目滤筛去除沉淀，再用200目滤筛进行过滤，得到滤液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，加入的酶是糖苷酶或果胶酶，酶的加入量是以滤液体积计0.1-1％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，酶与滤液的混合物在50-60℃温度条件下保持10-24h，再进行离心过滤。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中，往沉淀物中添加的乙醇溶液是以步骤(3)得到的沉淀物的重量计，5-15倍90-95％浓度的乙醇溶液。

7.一种根据权利要求1-6中任一项权利要求所述的方法制备得到的槐角异黄酮苷元提取物。

8.一种根据权利要求7所述的槐角异黄酮苷元提取物的分析方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)精确称取根据权利要求7所述的产品，100％甲醇溶液定容，经稀释、过滤得到样品溶液；

9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于该方法的色谱条件为：Diamonsil ODS C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱；柱温30℃；流动相：0-30min，乙酸-乙腈-水(1∶20∶79)，30-70min，乙酸-乙腈-水(1∶40∶59)；流速0.70-0.95mL/min；检测波长265nm。