CN101774955A - 一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法。该方法是将万寿菊干花颗粒粉碎过筛后，加入有机溶剂和碱溶液进行同时提取和皂化处理，提取皂化液经过滤去除滤渣后真空减压浓缩，然后向浓缩液中加入50％乙醇水溶液，并调pH值至7.0，离心，经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品。将反式叶黄素粗品用乙酸乙酯溶解，用去离子水冲洗，将乙酸乙酯相减压浓缩，向浓缩液中加入正己烷/丙酮混合溶剂，在室温下静置后过滤，再用冷乙醇和去离子水洗涤，经真空冷冻干燥而制得反式叶黄素晶体。本发明工艺简单，反式叶黄素得率高，适合工业化生产。

Description

一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法

技术领域

本发明涉及一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法。

背景技术

万寿菊是富含叶黄素类物质的天然原料，万寿菊提取物在国际上已商业化。叶黄素属于类胡罗卜素类的四萜类化合物，广泛存在于花卉、水果、蔬菜等植物中。纯度较高的叶黄素为橙黄色粉末，有弱的干草气味，难溶于水、甲醇等极性较高的溶剂，易溶于四氢呋喃、乙酸乙酯、石油醚等极性较低的有机溶剂中。叶黄素的潜在价值包括提高免疫功能、抑制细胞质自身氧化、保护细胞单元免受氧化剂带来的破坏，治疗癌症、以及防治老年人视黄斑退化等。目前叶黄素类物质的制备工艺，如化学合成和发酵工艺等，都面临着化学合成中不能有效除去毒性溶媒，以及得率低的问题。可行的方法就是改进叶黄素类物质的制备方法。通过改进提取工艺提高叶黄素类物质提取率已有报道，但处理过程需较高的温度(70℃)和较长的处理时间，从而导致叶黄素的降解和异构体的出现。另外，万寿菊中游离叶黄素含量非常低，大部分与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸等饱和脂肪酸结合成为叶黄素酯。游离叶黄素可被人体和禽类直接吸收利用，而以叶黄素酯形式存在的叶黄素不易被人体和动物吸收，因此提取和分离游离叶黄素已成为研究焦点之一。

由于叶黄素化学结构具有3个手性中心，理论上有8种几何异构体，实际上自然界只存在一种异构体。因合成工艺太复杂，费时费力，成本很高，工业化人工合成单一异构体的叶黄素迄今尚未成功。目前只有从羽衣甘蓝或金盏菊、万寿菊等天然植物中提取的叶黄素才含真正具有抗氧化作用的活性物质，而且比较经济，适合大规模工业化生产。叶黄素晶体的制备早已规模化生产，但是至今高含量、高纯度反式叶黄素晶体的制备的生产厂家还甚少，其中一个重要原因就是生产工艺还不够成熟，如产品不稳定、皂化不完全、反应时间长，工艺复杂、成本高、溶剂不易回收以及对环境造成污染等。

万寿菊花中叶黄素主要以酯的形式存在，在生物体内叶黄素反式构象的活性较顺式构象强很多，当其长时间在光、氧、热条件作用下时，极易转化为顺式异构体，从而失去生理活性。目前叶黄素晶体的制备技术在国内外已有相关文献和专利报道，但这些技术仍存在一些不足之处。Khachik等(U.S.Pat.No.5382714)提出了一种从皂化的万寿菊油树脂中分离、纯化和重结晶出游离态叶黄素的工艺，但由于使用了含氯有机溶剂，得到的产品不适合食品和药物上使用。U.S.Pat.No.6262284中使用四氢呋喃从万寿菊颗粒中萃取、皂化和重结晶叶黄素，但粗提和皂化时四氢呋喃用量很大，成本高，且四氢呋喃腐蚀性强，设备维护费高，不适合工业化生产。U.S.Pat.No.5648564中应用丙二醇皂化叶黄素酯，再重结晶，但丙二醇粘度大，皂化温度高，整个反应体系70℃保持10个小时，会导致叶黄素反式结构转化为顺式，随后的分离过程也比较困难，叶黄素收率只有59％。

目前生产叶黄素的方法大多采用提取、皂化、分离、纯化等步骤，其中，提取和皂化较为费时，若能将这两步同时进行，将大大缩短制备时间。U.S.Pat.No.6262284在2001年首次将叶黄素的提取和皂化同时进行，使用了大量四氢呋喃作为提取溶剂，同时纯化过程使用的硅胶柱层析，需要消耗大量溶剂，费时费力，不经济。国内王振等在2006年发表在《中国农业大学学报》期刊一文中报道了以四氢呋喃为提取剂，对常温下万寿菊中叶黄素的同时提取皂化工艺进行研究。分别考察了溶剂倍量、反应时间、氢氧化钾乙醇溶液质量浓度对叶黄素提取率的影响，结果表明溶剂倍量和反应时间对叶黄素提取率有较显著的影响。在单因素试验的基础上，采用L₉(3⁴)正交试验考察3种因素对叶黄素提取率的影响，以提取率和HPLC检测量为指标综合考虑，优化工艺参数为：溶剂倍量50毫升/克，反应时间6小时，氢氧化钾乙醇溶液质量浓度0.15克/毫升，此条件下叶黄素提取率达到90％以上。有研究表明四氢呋喃容易形成过氧化物，可能会导致叶黄素的分解。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种工艺简单、反式叶黄素含量高的叶黄素晶体的制备方法。

技术方案

本发明以万寿菊干花颗粒为原料制备高含量反式叶黄素晶体的方法，是将万寿菊干花颗粒粉碎过筛后，加入有机溶剂和碱溶液进行同时提取和皂化处理，提取皂化液经过滤去除滤渣后真空减压浓缩，然后向浓缩液中加入50％乙醇水溶液，并调pH值至7.0，离心，经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品。将反式叶黄素粗品用乙酸乙酯溶解，用去离子水冲洗，将乙酸乙酯相减压浓缩，向浓缩液中加入正己烷/丙酮混合溶剂，在室温下静置后过滤，再用冷乙醇和去离子水洗涤，经真空冷冻干燥而制得反式叶黄素晶体。一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法，包括如下步骤：

(1)将万寿菊干花颗粒粉碎后过20～40目筛，待用；

(2)将过筛后的万寿菊花粉1∶3～1∶5加入提取溶剂石油醚，再向万寿菊花粉中按料液质量体积比用量为1∶1.5～1∶2.5加入100克/升氢氧化钾乙醇溶液，40～65℃搅拌回流加热1～4小时进行同时提取皂化处理；

(3)提取皂化液过滤，将滤液进行真空减压浓缩，其真空度为-0.02～0.08Mpa，温度35～45℃，真空减压浓缩至没有馏出液；

(4)向浓缩液中加入5～7倍体积的50％乙醇水溶液，搅拌均匀，加入25％乙酸水溶液调pH值至7.0，待反式叶黄素结晶析出后，离心并经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品；

(5)用乙酸乙酯溶解反式叶黄素粗品，用去离子水冲洗去除多余的皂化物质和水溶性杂质，将乙酸乙酯相减压浓缩，回收溶剂；

(6)向浓缩物中加入正己烷/丙酮混合溶剂，正己烷/丙酮按体积比9∶1～7∶3，混合溶剂与浓缩物的质量比为为4∶1～7∶1。在室温下静置30分钟后过滤，滤饼分别用0～5℃无水乙醇和去离子水洗涤至滤液无色，经真空冷冻干燥后制得反式叶黄素晶体。

其中步骤(4)和步骤(6)所述真空冷冻干燥时的真空度15～50Pa，温度低于-40℃，干燥时间20-24小时。步骤(1)～(6)均在避光条件下进行。

有益效果

1.本发明简化了反式叶黄素晶体制备过程中的提取与皂化工艺。将万寿菊干花颗粒中反式叶黄素的提取和皂化过程同时进行，大大缩短了反应时间，节省了溶剂用量，同时使得具有生理活性的反式叶黄素的结构破坏和损失程度降到最低。为了提高反式叶黄素得率，本发明采用响应曲面法对万寿菊干花颗粒中反式叶黄素提取皂化工艺进行了优化，并根据实际情况，确定最佳工艺参数为：石油醚用量4.2升/千克，提取皂化温度为58℃，氢氧化钾乙醇质量浓度为100克/升，在此条件下获得反式叶黄素得率为1.49％。响应曲面如图1-3所示。

2.选择乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、正己烷和石油醚5种有机溶剂作为反式叶黄素的提取溶剂，研究结果表明(表1)，用石油醚作为提取溶剂，反式叶黄素得率最高，为1.447％，乙酸乙酯的得率最低，为0.255％。因此，对万寿菊干花颗粒中反式叶黄素的提取可选石油醚。而且石油醚在后续分离提纯工序中易于除去，从而也降低了成本。

表1不同提取溶剂对反式叶黄素得率的影响

3.用50％的乙醇水溶液促使反式叶黄素结晶析出，可以除去原花青素、反应生成的钾盐以及甾醇类物质等。Khachik(2001)在研究过程中采用50％的乙醇水溶液多次大量地冲洗皂化后的产物，从而使其呈中性，而不用酸调pH值。研究结果显示此处理使得反式叶黄素大量的损失，而用酸调节皂化后产物的酸碱度则可以避免类似情况。本发明采用酸性较弱的乙酸进行调节，避免了pH值波动范围过大。

4.本发明采用高效液相色谱分析检测万寿菊干花颗粒中的反式叶黄素，使用的色谱分离柱为C₃₀柱。C₃₀柱是继C₁₈柱之后又一广泛应用的反相吸附色谱固定相，在分离类胡萝卜素几何异构体方面显示出优势，可以准确地对反式叶黄素进行定性定量分析。经检测，本发明所制备的晶体中反式叶黄素含量高达90％以上，且生物活性高，有机溶剂残留量低，可应用于医药、保健食品领域。

附图说明

图1石油醚用量和温度对反式叶黄素得率影响的响应曲面图

图2石油醚用量和碱溶液浓度对反式叶黄素得率影响的响应曲面图

图3温度和碱溶液浓度对反式叶黄素得率影响的响应曲面图

图4本发明制得的反式叶黄素晶体的HPLC色谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但不因此而限制本发明。

实施例1

将万寿菊干花颗粒粉碎过20目筛，称取1千克万寿菊花粉，依次加入3升石油醚(沸程30～60℃)，100克/升氢氧化钾乙醇溶液2升，55℃回流提取皂化3小时。提取皂化液经过滤除去滤渣，将滤液于35～45℃真空减压浓缩至无馏出液，然后向浓缩液中加入0.6升50％乙醇水溶液，搅拌均匀，并加入25％醋酸水溶液调pH值至7.0，待反式叶黄素结晶析出后以5000转/分钟离心15分钟，倒掉上清液，获得含反式叶黄素的沉淀物，经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品230.4克，真空冷冻干燥时的真空度15～50Pa，温度低于-40℃，干燥时间20-24小时。经HPLC检测，反式叶黄素得率为1.416％。将反式叶黄素粗品用1.5升乙酸乙酯溶解，加入1.5升去离子水洗涤，去除水溶性杂质，将乙酸乙酯相减压浓缩。向浓缩液中加入100毫升己烷/丙酮(体积比为9∶1)，在室温下静置30分钟后过滤，去除脂溶性杂质，得到的反式叶黄素晶体分别用少量0～5℃乙醇和去离子水洗涤，经真空冷冻干燥制得反式叶黄素晶体16.1克，其中反式叶黄素含量91.15％。

反式叶黄素HPLC分析检测条件。仪器设备：美国安捷伦高效液相色谱仪HPLC1200，在线真空脱气机，四元梯度洗脱泵，柱温箱，DAD检测器；色谱柱：C₃₀柱，YMC Carotenoid S-5(4.6×250mm)；流动相：甲醇/MTBE(甲基叔丁基醚)＝95∶5。流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μl，检测波长450nm。按反式叶黄素的HPLC测定方法，以积分峰面积为纵坐标(y)，标准使用液浓度(μg/mL)为横坐标(x)，绘制标准曲线，其方程为y＝187.62x-97.07，R²＝0.9992。如图4所示。

实施例2

将万寿菊干花颗粒粉碎过40目筛，称取0.8千克万寿菊花粉，依次加入3.2升石油醚(沸程30～60℃)，100克/升氢氧化钾乙醇溶液2.5升，60℃回流提取皂化2.5小时。提取皂化液经过滤除去滤渣，将滤液于35～45℃真空减压浓缩至无馏出液，然后向浓缩液中加入0.5升50％乙醇水溶液，搅拌均匀，并加入25％醋酸水溶液调pH值至7.0，待反式叶黄素结晶析出后以5000转/分钟离心15分钟，倒掉上清液，获得含反式叶黄素的沉淀物，经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品237.4克，经HPLC检测，反式叶黄素得率为1.450％。将反式叶黄素粗品用1.5升乙酸乙酯溶解，加入1.5升去离子水洗涤，去除水溶性杂顶，将乙酸乙酯相减压浓缩。向浓缩液中加入100毫升己烷/丙酮(体积比为7∶3)，在室温下静置30分钟后过滤，去除脂溶性杂质，得到的反式叶黄素晶体分别用少量0～5℃乙醇和去离子水洗涤，经真空冷冻干燥制得反式叶黄素晶体14.8克，其中反式叶黄素含量90.06％。

实施例3

将万寿菊干花颗粒粉碎过40目筛，称取0.9千克万寿菊花粉，依次加入2.7升石油醚(沸程30～60℃)，100克/升氢氧化钾乙醇溶液1.5升，58℃回流提取皂化3小时。提取皂化液经过滤除去滤渣，将滤液于35～45℃真空减压浓缩至无馏出液，然后向浓缩液中加入0.7升50％乙醇水溶液，搅拌均匀，并加入25％醋酸水溶液调pH值至7.0，待反式叶黄素结晶析出后以5000转/分钟离心15分钟，倒掉上清液，获得含反式叶黄素的沉淀物，经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品240.5克，经HPLC检测，反式叶黄素得率为1.487％。将反式叶黄素粗品用1.5升乙酸乙酯溶解，加入1.5升去离子水洗涤，去除水溶性杂质，将乙酸乙酯相减压浓缩。向浓缩液中加入100毫升己烷/丙酮(体积比为4∶1)，在室温下静置30分钟后过滤，去除脂溶性杂质，得到的反式叶黄素晶体分别用少量0～5℃乙醇和去离子水洗涤，经真空冷冻干燥制得反式叶黄素晶体16.83克，其中反式叶黄素含量91.4％。

Claims (3)

1.一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将万寿菊干花颗粒粉碎后过20～40目筛，待用；

(2)将过筛后的万寿菊花粉1∶3～1∶5加入提取溶剂石油醚，再向万寿菊花粉中按料液质量体积比用量为1∶1.5～1∶2.5加入100克/升氢氧化钾乙醇溶液，40～65℃搅拌回流加热1～4小时进行同时提取皂化处理；

(3)提取皂化液过滤，将滤液进行真空减压浓缩，其真空度为-0.02～0.08Mpa，温度35～45℃，真空减压浓缩至没有馏出液；

(4)向浓缩液中加入5～7倍体积的体积比50％乙醇水溶液，搅拌均匀，加入体积比25％乙酸水溶液调pH值至7.0，待反式叶黄素结晶析出后，离心并经真空冷冻干燥得到反式叶黄素粗品；

(5)用乙酸乙酯溶解反式叶黄素粗品，用去离子水冲洗去除多余的皂化物质和水溶性杂质，将乙酸乙酯相减压浓缩，回收溶剂；

(6)按混合溶剂与浓缩物的质量比为为4∶1～7∶1向浓缩物中加入正己烷/丙酮混合溶剂，正己烷/丙酮按体积比9∶1～7∶3；在室温下静置30分钟后过滤，滤饼分别用0～5℃无水乙醇和去离子水洗涤至滤液无色，经真空冷冻干燥后制得反式叶黄素晶体。

2.根据权利要求1所述一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法，其特征在于步骤(4)和步骤(6)所述真空冷冻干燥时的真空度15～50Pa，温度低于-40℃，干燥时间20-24小时。述一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法，其特征在于步骤(6)所述。

3.根据权利要求1或2所述一种由万寿菊干花颗粒制备高含量反式叶黄素晶体的方法，其特征在于所述步骤(1)～(6)均在避光条件下进行。

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