CN103006794A - 一种酸模叶蓼类黄酮提取及纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能规模化生产、工艺简单、成本低、效率高的提取并纯化酸模叶蓼类黄酮的方法。向酸模叶蓼草粉中加入石油醚浸泡并在40-70℃，50-110r/min的条件下振荡2-6h，抽滤烘干后加入料液比为1：10-1:40的50-80%乙醇，在超声波作用下以40-70℃加热15-60min，过滤并将滤液浓缩至1/3体积，冷冻干燥即得类黄酮粗品，其纯度可达37%。再使用大孔树脂层析法纯化类黄酮。将前述类黄酮粗品溶于水，配成浓度为3-12mg/mL的溶液过柱，上样量25mL，流度0.5-2.5mL/min，上样液pH5-7，之后用蒸馏水冲洗大孔树脂至冲洗液无色，再用60-90%乙醇洗脱，流度0.5-2.5mL/min，至洗脱液无色，收集洗脱液浓缩至1/3体积。冷冻干燥即得纯类黄酮结晶，其纯度可达70%以上。
Description
技术领域
本发明属于一种植物活性成分的提取及纯化方法，具体地涉及一种酸模叶蓼类黄酮提取并纯化的方法。
背景技术
生物类类黄酮(bioflavonoids)是一种广泛存在于自然界中的酚类物质,又称维生素P，常与维生素C伴随存在，是植物光合作用产生的一类重要的天然有机化合物。类类黄酮是自然界药用植物中主要的活性成分之一，具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等生理活性。目前有关于从银杏叶，山楂叶，桑叶，玫瑰花等材料中提取类黄酮的报告，类黄酮在保健品、医药、食品及饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景，但目前还存在原料来源少、生产成本高、提取纯化工艺不成熟等获得类黄酮产品的种种限制因素。因此如何提取更为廉价、有效的生物类黄酮已引起国内外学者的广泛关注，并成为研究开发的热点课题。
酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium)为一年生双子叶杂草，茎直立，高30-100cm，具分枝，光滑，无毛，种子繁殖。别名旱苗蓼、大马蓼、柳叶蓉等。性温，味辛、苦，果实为利尿药，主治水肿和疮毒；用鲜茎叶混食盐后捣汁，治霍乱和日射病有效；外用可敷治疮肿和蛇毒；全草可制药。酸模叶蓼是我国农田常见的重要杂草之一，分布在全国各地，北方尤其普遍，主要分布在棉花、豆类、薯类、水稻、油菜、麦类等农作物田间，资源极为丰富。酸模叶蓼含有丰富的类黄酮化合物，但目前国内外对酸模叶蓼资源开发利用及其活性成分的相关研究极少，尚未见到关于酸模叶蓼类黄酮提取及纯化工艺方面的报道。以酸模叶蓼为原料提取类黄酮，不但能为保健品、医药、食品等行业类黄酮产品的生产提供充足且廉价的新原料，降低生产成本，同时又可有效解决其对农田的危害，变废为宝，带来更高的经济效益和生态效益。
类黄酮的提取方法有超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法、酶法、醇提法以及传统提取方法水提法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂萃取法等。其中超声波提取法使对热不稳定的生物活性成分在低温下就能实现有效的提取，避免了传统方法中高温处理可能对提取物造成的降解作用。目前此方法的使用比较广泛，该技术用于类黄酮提取具有省时、高效、节能、成本低、污染较小、容易实现产业化等优点。醇提法中以乙醇作为溶剂，价格低廉，无毒副作用，又可反复回收利用，降低生产成本。类黄酮的分离方法有柱层析法、纸层析法、薄层层析法、高效毛细管电泳法、高速逆流色谱、膜分离技术、高压液相制备色谱等，其中柱层析法中大孔树脂吸附法较好地解决了吸附选择性差、解吸再生困难和物理化学稳定性差等问题，且其成本较低，可循环利用，适合产业化生产。酸模叶蓼属于一种杂草，资源丰富，以其为原料提取类黄酮，不但能为类黄酮产品的生产提供充足廉价的新原料，还可有效解决其对农田的危害，变废为宝。
发明内容
本发明提供的技术方案包括以下工艺步骤：
（1）将风干或烘干的酸模叶蓼草粉碎，过60目筛，加入一定量的石油醚浸泡，用量以淹没原料为准，在40-70℃，50-110r/min的条件下振荡2-6h，抽滤，烘干，收集草粉，以除去脂类和叶绿素。
（2）加入10-40倍于草粉重量，浓度为50-80%的乙醇。置于超声波提取器中，将温度升高到40-70℃，以后保持恒温，开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用15-60min，在此期间进行搅拌，使草粉受力均匀；作用后以真空泵抽滤，收集滤液，得类黄酮提取液。
（3）将提取液用旋转蒸发器在40-60℃下浓缩至原体积的1/3，将浓缩物以-80~-60℃于冷冻干燥机中冷冻干燥，即得类黄酮粗品结晶，装入密封容器中保存备用。经超声波辅助醇提法所得酸模叶蓼类黄酮粗品最高产率可达10%，纯度可达37%。
（4）使用玻璃层析柱1.6cm×50cm湿法装填NKA-9大孔树脂，装填径高比1:8-1:12，之后将前述步骤制得的类黄酮溶于水，配成浓度为3-12mg/mL的类黄酮溶液，以恒流泵过柱，样液高于树脂2-3cm，上样量25mL，上样速度0.5-2.5mL/min，上样液pH为4-7。
（5）用蒸馏水冲洗吸附类类黄酮的大孔树脂，冲洗速度为0.5-2.5mL/min，至冲洗液无颜色为止。
（6）用浓度为60-90%的乙醇洗脱上述大孔树脂，洗脱速度为0.5-2.5mL/min，至洗脱液基本无色为止，收集洗脱液于旋转蒸发仪中在40-60℃下浓缩至原体积的1/3。将浓缩液以-80~-60℃于冷冻干燥机中冷冻干燥，即得纯类黄酮结晶。装入密封容器中保存。经过大孔树脂纯化后，酸模叶蓼类黄酮纯度可达70%以上。
本发明的积极效果：利用超声波的辅助作用，大幅减少了酸模叶蓼类黄酮的浸提时间，提高了提取效率。降低了提取时所用温度，节约了能源的投入。同时引入了大孔树脂吸附法纯化酸模叶蓼类黄酮的技术，大孔树脂可反复利用，降低生产成本且无污染。本工艺中采用价格较低的乙醇作为溶剂，安全无毒，可回收反复利用。类黄酮得率较高，操作较为简便易行，适合于大规模生产。以酸模叶蓼为原料不仅可以变废为宝而且还能有效减缓其对农田的危害作用，有利于酸模叶蓼类黄酮的进一步研究及作为人类保健品和畜禽饲料添加剂应用；本发明是在反复理论分析和多次试验的基础上，以酸模叶蓼类黄酮得率为指标，对提取过程中的提取液浓度，提取温度，浸提时间，料液比分别进行考察，确定了酸模叶蓼类黄酮的最佳提取条件；对纯化过程中上样液浓度，上样液pH，上样速度及洗脱剂浓度等层析条件分别进行考察，确定了酸模叶蓼类黄酮的最佳纯化条件，为酸模叶蓼类黄酮的开发和生产提供依据。
具体实施方式
下面以实施例进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不限于此。
实施例1
（1）将风干或烘干的酸模叶蓼草粉碎，过60目筛，得酸模叶蓼草粉末，称取5g酸模叶蓼草粉于具塞三角瓶，加入一定量的石油醚浸泡，用量以淹没原料为准，封口，在50℃、70r/min的条件下振荡3h，用真空抽滤泵进行抽滤，除去滤液，将草粉烘干，收集，以除去脂类和叶绿素。
（2）向上述处理过的草粉中加入20倍于草粉重量，浓度为80%的乙醇。将三角瓶置于超声波提取器中，将温度升高到70℃，以后保持恒温，开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用30min，在此期间进行搅拌，以使草粉受力均匀；作用后以真空泵抽滤，除去草粉，收集滤液，得类黄酮提取液。
（3）将提取液用旋转蒸发器在50℃下进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3，收集挥发出的酒精，将浓缩物置于--60℃的冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即得类黄酮粗品结晶，装入密封容器中保存备用。经超声波辅助醇提法所得酸模叶蓼类黄酮粗品最高产率可达10%，纯度可达37%。
（4）将NKA-9大孔树脂进行预处理后，使用玻璃层析柱1.6cm×50cm，湿法装填NKA-9大孔树脂，装填径高比1:8，装填过程中应该避免大孔树脂内产生气泡，之后将前述步骤制得的类黄酮溶于水，配成浓度为9mg/mL的类黄酮溶液，以恒流泵控制流速，将溶液过柱，维持样液高于树脂3cm，上样量25mL，在此过程中，上样速度1mL/min，上样液pH为6。
（5）上样结束后，用蒸馏水冲洗吸附类黄酮的大孔树脂，以恒流泵过柱，使蒸馏水液面高于树脂2-3cm，冲洗速度为1mL/min，至冲洗液无颜色为止。
（6）冲洗结束后，用浓度为70%的乙醇洗脱上述大孔树脂。以恒流泵过柱，使酒精液面高于树脂2-3cm，洗脱速度为1mL//min，至洗脱液基本无色为止，收集洗脱液。将洗脱液置于旋转蒸发仪中在50℃条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3，收集酒精。将浓缩液于-60℃条件下冷冻干燥机中冷冻干燥，即得纯类黄酮结晶。装入密封容器中保存。经过大孔树脂纯化后，酸模叶蓼类黄酮纯度可达70%以上。
实施例2
（1）将风干或烘干的酸模叶蓼草粉碎，过60目筛，得酸模叶蓼草粉末，称取5g酸模叶蓼草粉于具塞三角瓶，加入一定量的石油醚浸泡，用量以淹没原料为准，封口，在50℃、70r/min的条件下振荡3h，用真空抽滤泵进行抽滤，除去滤液，将草粉烘干，收集，以除去脂类和叶绿素。
（2）向上述处理过的草粉中加入30倍于草粉重量，浓度为65%的乙醇。将三角瓶置于超声波提取器中，将温度升高到60℃，以后保持恒温，开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用35min，在此期间进行搅拌，以使草粉受力均匀；作用后以真空泵抽滤，除去草粉，收集滤液，得类黄酮提取液。
（3）将提取液用旋转蒸发器在55℃下进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3，收集挥发出的酒精，将浓缩物置于--70℃的冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即得类黄酮粗品结晶，装入密封容器中保存备用。
（4）将NKA-9大孔树脂进行预处理后，使用玻璃层析柱1.6cm×50cm，湿法装填NKA-9大孔树脂，装填径高比1:10，装填过程中应该避免大孔树脂内产生气泡，之后将前述步骤制得的类黄酮溶于水，配成浓度为9mg/mL的类黄酮溶液，以恒流泵控制流速，将溶液过柱，维持样液高于树脂3cm，上样量25mL，在此过程中，上样速度1.5mL/min，上样液pH为7。
（5）上样结束后，用蒸馏水冲洗吸附类黄酮的大孔树脂，以恒流泵过柱，使蒸馏水液面高于树脂2-3cm，冲洗速度为1.5mL/min，至冲洗液无颜色为止。
（6）冲洗结束后，用浓度为80%的乙醇洗脱上述大孔树脂。以恒流泵过柱，使酒精液面高于树脂2-3cm，洗脱速度为1.5mL//min，至洗脱液基本无色为止，收集洗脱液。将洗脱液置于旋转蒸发仪中在55℃条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3，收集酒精。将浓缩液于-70℃条件下冷冻干燥机中冷冻干燥，即得纯类黄酮结晶。装入密封容器中保存。
实施例3
（1）将风干或烘干的酸模叶蓼草粉碎，过60目筛，得酸模叶蓼草粉末，称取5g酸模叶蓼草粉于具塞三角瓶，加入一定量的石油醚浸泡，用量以淹没原料为准，封口，在50℃、70r/min的条件下振荡3h，用真空抽滤泵进行抽滤，除去滤液，将草粉烘干，收集，以除去脂类和叶绿素。
（2）向上述处理过的草粉中加入40倍于草粉重量，浓度为70%的乙醇。将三角瓶置于超声波提取器中，将温度升高到70℃，以后保持恒温，开启超声波，于400W功率下，以60kHz超声波作用45min，在此期间进行搅拌，以使草粉受力均匀；作用后以真空泵抽滤，除去草粉，收集滤液，得类黄酮提取液。
（3）将提取液用旋转蒸发器在60℃下进行旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3，收集挥发出的酒精，将浓缩物置于--80℃的冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即得类黄酮粗品结晶，装入密封容器中保存备用。
（4）将NKA-9大孔树脂进行预处理后，使用玻璃层析柱1.6cm×50cm，湿法装填NKA-9大孔树脂，装填径高比1:12，装填过程中应该避免大孔树脂内产生气泡，之后将前述步骤制得的类黄酮溶于水，配成浓度为12mg/mL的类黄酮溶液，以恒流泵控制流速，将溶液过柱，维持样液高于树脂3cm，上样量25mL，在此过程中，上样速度2mL/min，上样液pH为7。
（5）上样结束后，用蒸馏水冲洗吸附类黄酮的大孔树脂，以恒流泵过柱，使蒸馏水液面高于树脂2-3cm，冲洗速度为2mL/min，至冲洗液无颜色为止。
（6）冲洗结束后，用浓度为90%的乙醇洗脱上述大孔树脂。以恒流泵过柱，使酒精液面高于树脂2-3cm，洗脱速度为2mL//min，至洗脱液基本无色为止，收集洗脱液。将洗脱液置于旋转蒸发仪中在60℃条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3，收集酒精。将浓缩液于-80℃条件下冷冻干燥机中冷冻干燥，即得纯类黄酮结晶。装入密封容器中保存。
Claims (1)
1. 一种酸模叶蓼类黄酮提取及纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将风干或烘干的酸模叶蓼草粉碎，过60目筛，加入一定量的石油醚浸泡，用量以淹没原料为准，在40-70℃，50-110r/min的条件下振荡2-5h，抽滤，40-70℃下烘干2-6h，以除去脂类和叶绿素，收集草粉；
（2）加入10-40倍于草粉重量，浓度为50-80%的乙醇，置于超声波提取器中，将温度升高到40-70℃并保持恒温，开启超声波，于240-400W功率下，以40-60kHz超声波作用15-60min，在此期间进行搅拌，作用后以真空泵抽滤，收集滤液，得类黄酮提取液；
（3）将提取液用旋转蒸发器在40-65℃下浓缩至原体积的1/3，将浓缩物以-80~-60℃于冷冻干燥机中冷冻干燥，即得类黄酮粗品结晶，采用超声波辅助乙醇提取法所得酸模叶蓼类黄酮粗品最高产率可达10%，纯度可达37%，将上述类黄酮粗品装入密封容器中保存备用；
（4）使用玻璃层析柱1.6cm×50cm，湿法装填NKA-9大孔树脂，装填径高比1:8-1:12，之后将前述步骤制得的类黄酮粗品溶于水，配成浓度为3-12mg/mL的类黄酮溶液，以恒流泵过柱，样液高于树脂2-3cm，上样量25mL，上样速度0.5-2.5mL/min，上样液pH为5-7；
（5）用蒸馏水冲洗吸附类黄酮的大孔树脂，冲洗速度为0.5-2.5mL/min，至冲洗液无色为止；
（6）用浓度为60-90%的乙醇洗脱上述大孔树脂，洗脱速度为0.5-2.5mL/min，至洗脱液基本无色为止，收集洗脱液采用旋转蒸发仪在40-60℃下浓缩至原体积的1/3，将浓缩液以-80~-60℃于冷冻干燥机中冷冻干燥，即得酸模叶蓼纯类黄酮结晶，经过大孔树脂纯化后酸模叶蓼类黄酮纯度可达70%以上。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104770568A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-07-15 | 邵素英 | 一种提高蛋鸡繁殖性能的产蛋前期料及其制备方法 |
| CN105054069A (zh) * | 2015-09-01 | 2015-11-18 | 沈阳农业大学 | 一种万寿菊花粕中黄酮的提取方法及应用 |
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