CN102626459B

CN102626459B - 一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法

Info

Publication number: CN102626459B
Application number: CN201210068436.5A
Authority: CN
Inventors: 文洪宇; 成建国; 李洪; 黄彦; 张太君; 杨娟; 张雪梅; 陈曦
Original assignee: Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital
Current assignee: Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: CN102626459A

Abstract

本发明涉及一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法，将检验合格的黄柏原生药饮片，粉碎成粗粉，备用；称取处方量黄柏，加15倍水浸润，调温度30℃～40℃,<i/>pH为3.9～4.5；另每g黄柏取相当于酶活力0.8～1万U的纤维素酶,、1.5～2.5万U的果胶酶和0.3～0.5万U的半纤维素酶，加水10倍调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温160～200min,过滤，滤液备用；黄柏药渣继续加10倍水，常规煎煮1h，过滤，滤液合并，灭酶，浓缩至规定量（相当于生药1g/ml），即得黄柏生物碱提取物。本发明与传统提取法相比，提取速度快，提高有效成分收率和利用率，大幅降低生产成本，宜于大规模生产。

Description

一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法

技术领域

本发明属于中药制药或原料加工领域，具体涉及一种复合酶法提取黄柏生物碱的方法。

背景技术

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮及芸香科植物黄薜Phellodendron amurense Rupr.的树皮。是一种用途广,用量大的中药材。黄柏临床用于湿热泻痢、黄疸、带下、热淋、脚气、痿躄、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒、湿疹瘙痒。药理研究表明，黄柏具有调整心律、降血压、抗消化道溃疡、增强免疫系统和抗病原微生物等作用。黄柏含小檗碱(berberine)、木兰花碱(magnoflorine)、黄柏碱(phellodendrine)、掌叶防己碱(palmatine)，药根碱（Jatrorrhizine）等多种生物碱及内酯、甾醇、粘液质等。黄柏生物碱作为黄柏的主要有效成分，对其应用研究越来越广泛。

目前，黄柏生物碱的提取方法主要有酸水法、石灰乳法、乙醇法、超声波提取等，生物碱为黄柏主要有效成分, 如小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、掌叶防己碱、药根碱等，均为季铵生物碱，虽都为水溶性生物碱，采用热水提法，由于黄柏皮性质坚韧，溶剂无法穿透进入纤维素内部，制剂中提取含量不高；另一方面，黄柏粘液含量7%～8%，粘液通常为具有分支结构的杂多糖, 与纤维素等同属多糖类，黄柏提取物中含粘液质制成的中药胶囊，崩解时限不合格, 现有技术采用石灰乳祛除黏液质, 但过滤的时间长，生物碱得率较低，而采用酸碱浸提、半仿生提取等可能会破坏其活性结构。

考虑黄柏中生物碱的状态和性质,特别是几种生物碱分解点都特别低，随着温度增加，小檗碱转化为小檗红碱等特性，我们认为酶处理可提高药效成分提取率，有助于保持天然产物构象，保持成分原有性质，也是仿生化提取中药有效成分的一种方式，克服传统高温煎煮对活性成分的影响，提取温度接近人体温度，水解条件温和，操作简便易行，设备简单。用复合酶澄清提取黄柏，符合中医药理论，故我们采用复合酶-热水浸提黄柏生物碱。

发明内容

本发明主要目的是提供一种简单易行，提取分离速度快，成本低，效率高，适于大规模生产的黄柏生物碱有效部位提取工艺。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法，所述方法是将黄柏药材用复合酶酶解，具体步骤如下：

（1）将检验合格的黄柏原生药饮片粉碎成粗粉，备用；

（2）称取处方量黄柏粗粉，加15倍重量的水浸润，调温度30℃～40℃, pH为3.9～4.5；

（3）另取复合酶加水10倍重量调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温160～200min, 过滤，滤液备用；所述复合酶为每g黄柏取相当于酶活力0.8～1万U的纤维素酶、1.5～2.5万U的果胶酶, 和 0.3～0.5万U的半纤维素酶的混合物；

（4）将黄柏药渣继续加10倍重量的水，煎煮1h，过滤；

（5）将步骤（3）和（4）的滤液合并，灭酶，浓缩至规定量（相当于生药1g/ml），即得黄柏生物碱提取物。

如上所述的方法，其中，所述的复合酶为纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶混合物，所述复合酶较优的可以由以下组料组成：每g黄柏取相当于酶活力0.8～1万U的纤维素酶, 1.5～2.5万U的果胶酶, 0.3～0.5万U的半纤维素酶。

如上所述的方法，其中，所述复合酶的酶活测定方法：纤维素酶在35℃、pH4条件下, 1ｈ分解羧甲基纤维素钠生成1ｍｇ还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个纤维素酶活力单位，即1U；果胶酶在35℃、pH4条件下, 1ｈ分解果胶生成1ｍｇ半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位，即1U；半纤维素酶在35℃pH4条件下, 1h分解木聚糖产生1mg还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位，即1U。

如上所述的方法，其中，pH值以0.5%稀硫酸、5%Ca(OH)₂水溶液调节。

可见，本方法包括酶促浸提和灭酶浓缩两个阶段。第一阶段主要作用是酶解细胞表面纤维、半纤维木质结构及粘液物,热水浸提利于生物碱的分离、溶出；第二阶段通过加热，既具有灭酶活的作用，同时又浓缩药材至规定量。

本发明对复合酶的选取及酶解条件的选择是一关键，申请人经大量的实验研究，选取了以纤维素酶-果胶酶-半纤维素酶的复合酶作为澄清剂，加入难滤皮类药材黄柏的水提工艺中。且筛选出最好的酶解条件为酶解温度35℃, 酶解时间200min, 酸碱度为3.9，纤维素用量为1万U/g, 果胶酶用量为2万U/g, 半纤维素酶用量为0.4万U/g。

如上所述的方法，其中，所述黄柏药材为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮及芸香科植物黄檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥树皮。

发明人是通过大量实验研究，提出复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法。其用复合酶澄清提取黄柏，符合中医药理论，其考虑到了黄柏中生物碱的状态和性质, 特别是几种生物碱分解点都特别低，随着温度增加，小檗碱转化为小檗红碱等特性，采用酶处理可提高药效成分提取率，有助于保持天然产物构象，保持成分原有性质，也是仿生化提取中药有效成分的一种方式。另外，克服传统高温煎煮对活性成分的影响，提取温度接近人体温度，水解条件温和，操作简便易行，设备简单，适宜工业化生产。

本发明的有益效果

本发明提供了一种提取制备黄柏生物碱有效部位的新方法，对难滤皮类中药黄柏增加一项酶解澄清工艺流程，破坏植物细胞壁，分解除去黏液等杂质，提高了有效成分的溶出率，同时极大加快药液滤过速度，提高药液澄清度，提高制剂的稳定性。

本发明的提取方法采用复合酶对原料进行酶解处理，对多种酶进行了筛选，并优化了酶比例，酶反应条件，提取分离速度快，提高了有效成分收率和利用率，本发明制得的黄柏生物碱提取率较通常不加酶热水浸提法提高60%以上，技术含量高，工艺简单，成本低，对环境友好，产量高，效率高，适宜工业化生产。

另外，本发明未使用石灰水等碱化措施，提取液澄清，粘度低，产品杂质少，后续处理方便。

附图说明

图1黄柏生物碱对照品的HPLC图谱

图2 黄柏生物碱未加酶提取的HPLC图谱

图3黄柏生物碱加酶提取的HPLC图谱

其中5个色谱峰为代表化合物，2、3、4、6、7号峰分别为木兰花碱、黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱。

具体实施方式

实施例1：

（1）检验合格的川黄柏（黄皮树）原生药饮片，粉碎成粗粉。

（2）称取处方量黄柏粗粉，加15倍重量的水浸润，调温度40℃, 以0.5%稀硫酸、5%Ca(OH)₂水溶液调pH为4.5。

（3）每g黄柏取相当于酶活力 0.8万U的纤维素酶、1.5万U的果胶酶, 和0.3万U的半纤维素酶，加水10倍重量调匀，缓缓加入步骤（2）得到的黄柏水浸液中，搅匀，保温160min。

（4）九号筛过滤，滤液备用。

（5）黄柏药渣继续加10倍重量的水，常规煎煮1h，九号筛过滤。

（6）滤液合并，灭酶，浓缩至规定量（相当于生药1g/ml），即得提取物。

经复合酶处理后，用复合酶提取的黄柏生物碱比单纯水浸提提高了60%。

实施例2：

（2）称取处方量黄柏粗粉，加15倍重量的水浸润，调温度30℃, 以0.5%稀硫酸、5%Ca(OH)₂水溶液调pH为4.2。

（3）每g黄柏取相当于酶活力0.9万U的纤维素酶、2.5万U的果胶酶和0.5万U的半纤维素酶，加水10倍重量调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温180min。

（4）九号筛200目过滤，滤液备用。

（5）黄柏药渣继续加10倍重量的水，常规煎煮1h，九号筛200目过滤。

经复合酶处理后，用复合酶提取的黄柏生物碱比单纯水浸提提高了70%。实施例3：

（2）称取处方量黄柏粗粉，加15倍重量的水浸润，调温度35℃, 以0.5%稀硫酸、5%Ca(OH)₂水溶液调pH为3.9。

（3）每g黄柏取相当于酶活力1万U的纤维素酶、 2万U的果胶酶和0.4万U的半纤维素酶，加水10倍重量调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温200min。

（4）九号筛200目过滤，滤液备用。

经复合酶处理后，用复合酶提取的黄柏生物碱比单纯水浸提提高了90%。

上述实施例中，复合酶的酶活测定方法如下：纤维素酶在35℃、pH4条件下, 1ｈ分解羧甲基纤维素钠生成1ｍｇ还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个纤维素酶活力单位，即1U；果胶酶在35℃、pH4条件下, 1ｈ分解果胶生成1ｍｇ半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位；半纤维素酶在35℃pH4条件下, 1h分解木聚糖产生1mg还原糖(以木糖计)的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。

黄柏生物碱的含量检测

分别精密称取木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品，采用高效液相色谱法检测。

色谱条件

色谱柱：菲罗门Gimini C₁₈（250×4.6mm，110A）

流动相：乙腈（A）-0.025mol/L NaH₂PO₄(含0.0125 mol/L的十二烷基硫酸钠（B），梯度洗脱，梯度洗脱程序为35（A）/65（B）0 15min, 50（A）/50（B）15 35 min；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：265nm；进样量：20μl。

黄柏生物碱对照品的HPLC图谱，见图1。

黄柏生物碱未加酶提取的HPLC图谱，见图2。

黄柏生物碱加酶提取的HPLC图谱，见图3。

黄柏未加酶提取和加酶提取生物碱结果，见表1。

表1

黄柏生物碱以木兰花碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱之和计。

本研究选择的小檗碱、黄柏碱、木兰碱、药根碱及巴马汀是黄柏生物碱的主要组成成分，5种生物碱含量之和占黄柏总生物碱含量的90%以上。可以认为，从化学成分的角度看，在评价川黄柏药材及其提取液的质量时以该5种成分含量为指标是较为合理、客观的。

结论

采用本发明酶解提取黄柏生物碱的含量较未加酶的黄柏生物碱的含量有较大提高, 提取分离时间大幅缩短,效率提高明显。

Claims

1.一种复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法，其特征在于，所述方法是将黄柏药材用复合酶酶解提取黄柏生物碱，包括如下步骤：

（1）将检验合格的黄柏原生药饮片粉碎成粗粉；

（2）称取黄柏粗粉，加15倍重量的水浸润，调温度30℃～40℃, pH为3.9～4.5；

（3）另取复合酶加水10倍重量调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温160～200min, 过滤，滤液备用；所述复合酶为每g黄柏取相当于酶活力0.8～1万U的纤维素酶、1.5～2.5万U的果胶酶和 0.3～0.5万U的半纤维素酶的混合物；复合酶的酶活力测定方法为：纤维素酶在35℃、pH4条件下, 1ｈ分解羧甲基纤维素钠生成以葡萄糖计1ｍｇ还原糖所需的酶量为一个纤维素酶活力单位，即1U；果胶酶在35℃、pH4条件下, 1ｈ分解果胶生成1ｍｇ半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位，即1U；半纤维素酶在35℃、pH4条件下, 1h分解木聚糖产生以木糖计1mg还原糖的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位，即1U；

（4）将黄柏药渣继续加10倍重量的水，煎煮1h，过滤；

（5）将步骤（3）和（4）的滤液合并，灭酶，浓缩至生药1g/ml，即得黄柏生物碱提取物。

2.权利要求1所述的复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法，其特征在于，

所述步骤（2）中，调温度35℃, pH为3.9；

所述步骤（3）每g黄柏取相当于酶活力 1万U的纤维素酶, 2万U的果胶酶, 0.4万U的半纤维素酶的混合物为复合酶，加水10倍调匀，缓缓加入黄柏水浸液中，搅匀，保温200min。

3.权利要求1所述的复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法，其特征在于，

所述步骤（4）中，用200目筛过滤；

所述步骤（3）中，用200目筛过滤。

4.根据权利要求1或2所述的复合酶-热水浸提黄柏生物碱的方法，其特征在于，所述黄柏药材为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮或芸香科植物黄檗Phellodendron amurense Rupr.的干燥树皮。