CN101607997B - 中药决明子多糖类化合物的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种决明子多糖类化合物的提取方法，该方法主要包括原料预处理；除脂；脉冲超声处理；复合酶酶解及热水浸提；醇沉、洗涤、干燥；脱色和脱蛋白；纳滤沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖。本发明提取决明子多糖化合物在得率和多糖品质上均优于单纯热提取方法，而且大大提高了提取效率，有效降低了能源消耗，适合工业级制备。
Description
技术领域
本发明属于中药功能性成分提取技术领域，具体地，是涉及一种从中药决明子中提取多糖类化合物的方法。
背景技术
决明子(Semen Cassiae)又名草决明、还瞳子，是国家卫生部公布的既是食品又是药品的药食同源植物。其基原为豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)的成熟种子。决明子具有清肝、明目、利水、通便、降压、抗菌之功(中药大辞典(上册)[M]上海科学出版社.1986.949.)。近年来，关于决明子的研究逐渐成为热点，但多集中在对决明子蛋白质及蒽醌类成分的研究，如提取分离以及活性测定等。多糖是由多个相同或不相同的单糖以糖苷键相连而形成的高聚物，在自然界分布极广。60年代以来人们逐渐发现其具有复杂的、多方面的生物活性和功能，如免疫调节功能、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖等，且其在医药上是一种很好的佐剂(方积年.多糖研究的现状.药学学报，1986，21(12)：944-950.)。决明子多糖也是决明子中具有医疗保健作用的主要成分之一，对细胞的生长和衰老具有一定的调控作用(方一苇.具有药理活性多糖的研究现况，分析化学，1994，22(9)：955；VliegehthartJFG，KamerlingJP，VeldinkGA.Abstraetofthe12thInternational CarbohydrateSymPosium，Netherlands，VonkPublishers，1984：566)而决明子多糖的提取分离等研究较少，邓泽元等采用热水浸提法提取决明子水溶性多糖(邓泽元等，决明子水溶性多糖提取的研究.食品科学.2002.23(1)：72)，但高温水煮容易使决明子多糖结构改变，提取方法的不足限制了决明子多糖类化合物的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有研究的不足，提供一种高效提纯决明子多糖类化合物的方法，这对决明子多糖的进一步开发利用具有重要的意义。
为了达到本发明的目的，本方法采用脉冲超声辅助酶解法。具体措施如下：
一种决明子多糖类化合物的提取方法，主要包括以下步骤：
(1)原料预处理：将决明子烘干，粉碎，得决明子粉末；
(2)除脂：用乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3)脉冲超声处理：按固液的质量比为1∶25-40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，处理25-40min；
(4)复合酶制剂酶解及热水浸提：调节处理后的浆液的pH值为5.5-6.5，加入浆液质量的0.8％-1.5％的复合酶制剂酶解决明子中的纤维素、果胶及半纤维素等成分，充分酶解后迅速升温至70-90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5-1.5h，收集上清液；离心后残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；所述复合酶制剂由纤维素酶和果胶酶制成；
(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥：将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入3.5-4.5倍体积的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50-70℃下真空干燥得决明子粗多糖；
(6)脱色和脱蛋白：将粗多糖配制成水溶液，调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色，纳滤除去H2O2并浓缩，脱色后的多糖溶液中加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；或者将粗多糖配制成水溶液，加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，然后离心，取上清，调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
优选地，所述复合酶制剂由质量比为2-4∶2的纤维素酶和果胶酶制成；更优选为质量比为3∶2的纤维素酶和果胶酶制成。
优选地，步骤(3)为：按固液的质量比1∶30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、22-28℃处理25-40min。
所述决明子多糖类化合物的提取方法，优选为，主要包括以下步骤：
(1)原料预处理：将决明子65-80℃烘干，并于120-150℃下烘烤5-20min，以增加其多糖含量，粉碎，得决明子粉末；
(2)除脂：用体积比1-2∶1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3)脉冲超声处理：按固液的质量比1∶30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、25℃处理30min；
(4)复合酶酶解及热水浸提：调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1％-1.5％的复合酶制剂，35-40℃下反应1-2h，充分酶解后迅速升温至70-90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5-1.5h，离心收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；
(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥：将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入其体积3.5-4.5倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50-70℃下真空干燥得决明子粗多糖；
(6)脱色和脱蛋白：将粗多糖配制成浓度为10wt％水溶液，用氨水调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色，纳滤除去H2O2并浓缩至一半体积，脱色后的多糖溶液中加入其体积的15-30％的、浓度为8wt％的三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
本发明具有如下优点：
(1)在方法学上，首次将超声波辅助酶解的方法应用于决明子多糖成分的提取中，这为高效提取决明子多糖提供了方法学依据。
(2)本发明提取决明子多糖化合物在得率和多糖品质上均优于单纯热提取方法，而且大大提高了提取效率，有效降低了能源消耗，适合工业级制备。
附图说明
图1为本发明提取分离决明子多糖类化合物的总流程图；
图2为本发明多糖提取物DEAE-纤维素柱层析洗脱曲线图。
具体的实施方式
如图1所示，本发明的方法包括步骤——决明子粗多糖提取流程图，步骤——决明子多糖混合物脱色除蛋白流程图等两大步骤。
实施例1：
本实施例所用决明子购于药房，安徽产。
一种决明子多糖类物质的提取方法，包括以下骤(可参见图1-3)：
(1)决明子原料500g经70℃烘干水分后，于140℃下烘烤10min，粉碎；
(2)用乙醇和乙醚(体积比1∶1)混合溶剂浸泡24h脱脂，分2次进行，回收溶剂，残渣风干，即用乙醇和乙醚混合溶剂溶解原料粉末中的脂类物质从而去除其中的脂类；
(3)按固液比1∶30(w/w)将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、室温(25℃)处理30min；依靠(脉冲)超声波的空化及其它次级效应可加速原料内有效成分的溶出、扩散释放并使其充分与溶剂混合，以便于提取；
(4)调浆液pH6.0，加入浆液质量的1.0％的复合酶制剂，40℃下反应1.5h，迅速升温至80℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提约1h；离心收集上清液，离心后的残渣以相同条件再浸提一次，该复合酶制剂由质量比为3∶2的纤维素酶和果胶酶制成；用复合酶制剂降解决明子中的纤维素、果胶和半纤维素等成分使多糖更容易释放溶解；
(5)合并上清液，透过反渗透膜，即纳滤浓缩后，加入其体积4倍的无水乙醇，置于4℃中过夜，使多糖沉淀下来，离心收集沉淀，沉淀物依次用丙酮、乙醚洗涤后，于60℃下真空干燥得含大量杂质的决明子粗多糖；
(6)将粗多糖配制成质量百分比为8wt％的水溶液，用氨水调节pH值至7.8-8.2，加入H2O2进行氧化脱色纳滤除去H2O2并浓缩至一半体积；脱色后的多糖溶液中加入其体积的20％的8wt％的三氯乙酸，搅拌均匀，室温静置25min，4000r/min离心10min，取上清，
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加4倍体积的无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)
(8)DEAE-纤维素柱层析方法鉴定多糖的组分：分离鉴定决明子多糖的组分及含量。
将制得的多糖样品上DEAE-纤维素柱。洗脱程序如下：首先用400ml pH6.0的磷酸盐缓冲液洗脱；再进行梯度洗脱，梯度混合器的混合池中为400ml pH 6.0的磷酸盐缓冲液，贮存池中为等体积含1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液；最后用1mol/L NaCl溶液进行洗脱。洗脱流速2ml/min，每10ml(5min)收集一管。用蒽酮-硫酸比色法隔管测定其中的多糖含量，再通过糖醛酸的含量较正为中性糖含量，以吸光度A为纵坐标，管号为横坐标，作出决明子多糖的洗脱曲线图(见图2)。分析洗脱曲线可知，决明子多糖提取物绝大多数为中性多糖(管号：14-32)，其余为酸性多糖(管号：56-104)。通过转换后的结果可以发现，提取得到的决明子多糖绝大多数为中性糖(14～32管)其吸光度值较大，而少部分为酸性多糖(56～104)，其吸光度值较小。
实施例2
本实施例所述的决明子多糖类物质的提取方法，基本与实施例1相同，但得到粗多糖后先进行除蛋白操作再进行脱色操作，具体如下：
(1)原料预处理：将决明子80℃烘干，并于150℃下烘烤8min，以增加其多糖含量，粉碎，得决明子粉末；
(2)除脂：用体积比2∶1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3)脉冲超声处理：按固液的质量比1∶40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、25℃处理40min；
(4)复合酶酶解及热水浸提：调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1.5％的复合酶制剂，于35℃下反应1.5h，充分酶解后迅速升温至90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.8h，离心收集上清液；离心后残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；该复合酶制剂由质量比为4∶2的纤维素酶和果胶酶制成；
(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥：将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入其体积3.5倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50℃下真空干燥得决明子粗多糖；
(6)将粗多糖配制成质量百分比为8wt％的水溶液，加入加入水溶液体积的30％的浓度为8wt％的三氯乙酸溶液，搅拌均匀，室温静置25min，使蛋白质变性后4000r/min离心10min，取上清，用氨水调节pH值至7.8-8.2，加入H2O2进行氧化脱色(37℃下保温12h)；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
按实施例1所述方法分离鉴定决明子多糖的组分及含量，结果基本相同，数据省略。
实施例3
本实施例所述的决明子多糖类物质的提取方法，具体如下：
(1)原料预处理：将决明子65℃烘干，并于120℃下烘烤20min，以增加其多糖含量，粉碎，得决明子粉末；
(2)除脂：用体积比2∶1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3)脉冲超声处理：按固液的质量比1∶40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、25℃处理25min；
(4)复合酶酶解及热水浸提：调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1％复合酶制剂，于40℃下反应2h，充分酶解后迅速升温至704℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提1.5，离心收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；该复合酶制剂由质量比为2∶2的纤维素酶和果胶酶制成；
(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥：将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入其体积3.5倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，60℃下真空干燥得决明子粗多糖；
(6)脱色和脱蛋白：将粗多糖配制成浓度为10wt％水溶液，用氨水调节pH值至7.8，加入H2O2进行氧化脱色，纳滤除去H2O2并浓缩至一半体积，脱色后的多糖溶液中加入其体积的15％的、浓度为8wt％的三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖(决明子多糖)。
按实施例1所述方法分离鉴定决明子多糖的组分及含量，结果基本相同，数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
Claims (5)
1.一种决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，主要包括以下步骤：
(1)原料预处理：将决明子烘干，粉碎，得决明子粉末；
(2)除脂：用乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3)脉冲超声处理：按固液的质量比为1∶25-40将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，处理25-40min；
(4)复合酶酶解及热水浸提：调节处理后的浆液的pH值为5.5-6.5，加入浆液质量的0.8％-1.5％的复合酶制剂，充分酶解后迅速升温至70-90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5-1.5h，离心并收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；所述复合酶制剂由质量比为2-4∶2的纤维素酶和果胶酶制成；
(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥：将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入3.5-4.5倍体积的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50-70℃下真空干燥得决明子粗多糖；
(6)脱色和脱蛋白：将粗多糖配制成水溶液，调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色，纳滤除去H2O2并浓缩，脱色后的多糖溶液中加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清液；或者将粗多糖配制成水溶液，加入三氯乙酸溶液使蛋白质变性，然后离心，取上清液，调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色；
(7)纳滤除去溶液中的有机溶剂与小分子杂质并浓缩，加无水乙醇并离心收集沉淀，经丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得目的多糖类化合物。
2.根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，所述复合酶制剂由质量比为3∶2的纤维素酶和果胶酶制成。
3.根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，步骤(3)为：按固液的质量比1∶30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、22-28℃处理25-40min。
4.根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，步骤(4)为：调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1％-1.5％的复合酶制剂，35-40℃下反应1-2h，充分酶解后迅速升温至70-90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5-1.5h，离心收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液。
5.根据权利要求1所述的决明子多糖类化合物的提取方法，其特征是，主要包括以下步骤：
(1)原料预处理：将决明子65-80℃烘干，并于120-150℃下烘烤5-20min，以增加其多糖含量，粉碎，得决明子粉末；
(2)除脂：用体积比1-2∶1的乙醇和乙醚混合溶剂浸泡决明子粉末24h，脱脂，回收溶剂，残渣风干；
(3)脉冲超声处理：按固液的质量比1∶30将残渣溶解于水中，得到浆液，将超声探头插入浆液的固定深度，以20kHz、1300W，脉冲工作时间4s、间歇时间2s、25℃处理30min；
(4)复合酶酶解及热水浸提：调节处理后的浆液pH值为6.0，加入浆液质量的1％-1.5％的复合酶制剂，充分酶解后迅速升温至70-90℃，使复合酶制剂钝化，并保温浸提0.5-1.5h，离心并收集上清液；离心后的残渣以相同条件再浸提一次，合并上清液；
(5)纳滤浓缩、醇沉、洗涤、干燥：将合并后的上清液纳滤浓缩，然后加入其体积3.5-4.5倍的无水乙醇使多糖沉淀下来，沉淀依次经丙酮、乙醚洗涤后，50-70℃下真空干燥得决明子粗多糖；
(6)脱色和脱蛋白：将粗多糖配制成浓度为10wt％水溶液，用氨水调节pH值至7.8-9.2，加入H2O2进行氧化脱色，纳滤除去H2O2并浓缩至一半体积，脱色后的多糖溶液中加入其体积的15-30％的、浓度为8wt％的三氯乙酸溶液使蛋白质变性，离心，取上清液；
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