CN101955548B - 酶法辅助提取蒺藜多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，采用酶法(纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶)辅助提取蒺藜多糖，选用的酶不破坏蒺藜多糖的结构而能破坏蒺藜原料中的纤维素、半纤维素及果胶等多糖的结构，从而多糖的得率比传统的水提醇沉法有较大的提高，获得的样品中多糖的含量也大大高于水提醇沉法的样品，这既提高了多糖的得率，又提高了多糖的纯度，为蒺藜多糖产品的进一步开发提供高质量的原料。本发明添加酶可提高蒺藜多糖的提取率及纯度，可使多糖的提取率比不加酶处理的提高18-40.67％，纯度提高15-42％。与热水浸提法、酸浸提法及碱浸提法提取相比，酶法提取条件温和，易除去杂质，且能保持蒺藜多糖的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用酶法从可用于保健食品的中草药--蒺藜中提取多糖的方法。
背景技术
蒺藜(Fructus Tribuli)为蒺藜科(Zygophyllaceae)蒺藜属草本植物，又名刺蒺藜，硬蒺藜或白蒺藜，为一年或多年生的草本植物，为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestrisL.的干燥成熟果实，为国家2005版药典收录和国家卫生部规定可用于保健食品的药物，具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒的功效，主治头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风疹瘙痒等症。
蒺藜的化学成分主要有甾体皂甙类、黄酮类化合物、多糖类、生物碱、醌类化合物、氨基酸等。但目前对蒺藜的研究主要集中在蒺藜皂苷的提取及利用，如国内以蒺藜的茎叶为原料开发的“心脑舒通”以及国外以刺蒺藜为原料开发的用于增强性功能的“Tribustan”和“Vitanone”以及软化血管的“Tribusaponin”，这些药物都是以蒺藜皂苷为主要药效成分。
研究表明蒺藜多糖有抗遗传损伤的作用(刘启福，陈裕明，王健梅，等.刺蒺藜多糖对遗传损伤防护作用的研究.中国中药杂志，1995，20(7)：427-429)，还有较强的免疫抑制作用(师勤，马果玉，徐珞珊，等.比色法测定蒺藜中多糖的含量.中国药科大学学报，1997，28(5)：291-293)，但关于蒺藜多糖提取方面的研究未见报道，
多糖因具有多种生物活性而成为当今生物医药研究和开发的一大热点。传统的多糖提取方法主要是采用热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法提取。热水浸提法时间长、耗能高、杂质含量高、收率低；酸或碱浸提法虽能提高提取率，但酸能破坏多糖的苷键而形成较多的单糖和低聚糖，降低多糖含量，稀碱提取也会对多糖结构造成破坏。此外，酸、碱浸提对设备有一定的影响，且需经中和反应，操作程序较为繁琐，难以在工业化生产中得以广泛应用。
中国专利CN1144847A“酶处理提取中药材中皂苷成分的方法”中提及了酶法提取人参皂武，CN02158188.6“酶处理提取黄芪多糖”中提及了使用纤维素酶、半纤维素酶及蛋白酶提取黄芪多糖，但尚未见到酶法辅助处理提取蒺藜多糖的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，该方法可提高蒺藜多糖提取率和所得多糖的纯度，而不破坏蒺藜多糖结构。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5份过筛后的蒺藜粉末浸泡于100-150份的蒸馏水中并调节pH值至4.6-7.0，然后水浴锅升至50-55℃，再添加蒺藜粉末质量0.5-3.3％的单一或复合酶，并50-55℃保温酶解2.0-4.5h；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温10-20min，使加入的酶制剂变性失活，然后过滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至原蒺藜粉末相同的质量体积，然后再加入3-4倍浓缩液体积的无水乙醇，在冰箱中静置10-20h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物抽滤后得到粗多糖，并用75-85％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，即获得蒺藜多糖。
本发明的酶采用活性为8000U/g的纤维素酶、活性为10000U/g的木聚糖酶(购自肇东国科北方酶制剂有限公司)、活性为30000U/g的果胶酶(购自肇东国科北方酶制剂有限公司)中的一种或几种。
所述的纤维素酶采用绿色木霉(编号30048购自中国科学院微生物研究所)固态发酵后经PEG4000/(NH4)2SO4双水相萃取制备而成，纤维素酶的添加量为0.5-2.5％。
所述的木聚糖酶的添加量为0.75-3.0％。
所述的果胶酶的添加量为0.5-2.0％。
本发明采用酶法(纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶的一种或多种)辅助提取蒺藜多糖，选用的酶不破坏蒺藜多糖的结构而能破坏蒺藜原料中的纤维素、半纤维素及果胶等多糖的结构，从而多糖的得率比传统的水提醇沉法有较大的提高，获得的样品中多糖的含量也大大高于水提醇沉法的样品，这既提高了多糖的得率，又提高了多糖的纯度，为蒺藜多糖产品的进一步开发提供高质量的原料。
本发明添加酶可提高蒺藜多糖的提取率及纯度，可使多糖的提取率比不加酶处理的提高18-40.67％，纯度提高15-42％。
与热水浸提法、酸浸提法及碱浸提法提取相比，酶法提取条件温和，易除去杂质，且能保持蒺藜多糖的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5g过筛后的蒺藜粉末浸泡于120ml的蒸馏水中，用1.0mol/L的NaOH或1.0mol/L的HCl将添加蒺藜粉末的蒸馏水的pH值调至4.6，然后在50℃水浴保温5分钟再添加蒺藜粉末质量2.0％的纤维素酶保温酶解4.0h；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温15min，使加入的酶制剂变性失活，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至5ml，然后再浓缩液中加入15ml的无水乙醇，在冰箱中静置16h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物经抽滤后得到粗多糖，并用80％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，获得蒺藜多糖0.314g，多糖含量为61.73％，而对照(热水浸提法)获得的蒺藜多糖为0.256g，多糖含量为43.51％。
实施例2：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5g过筛后的蒺藜粉末浸泡于100ml的蒸馏水中，用1.0mol/L的NaOH或1.0mol/L的HCl将添加蒺藜粉末的蒸馏水的pH值调至7.0，然后在50℃水浴保温5分钟再添加蒺藜粉末质量2.5％的木聚糖酶保温酶解3.0h；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温12min，使加入的酶制剂变性失活，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至5ml，然后再向浓缩液中加入20ml的无水乙醇，在冰箱中静置12h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物经抽滤后得到粗多糖，并用80％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，获得蒺藜多糖0.298g，多糖含量为61.21％，而对照(热水浸提法)获得的蒺藜多糖为0.248g，多糖含量为42.71％。
实施例3：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5g过筛后的蒺藜粉末浸泡于150ml的蒸馏水中，用1.0mol/L的NaOH或1.0mol/L的HCl将添加蒺藜粉末的蒸馏水的pH值调至5.6，然后在55℃水浴保温5min再添加蒺藜粉末质量1.5％的果胶酶保温酶解3.5h；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温10min，使加入的酶制剂变性失活，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至5.0mL，然后再向浓缩液中加入18ml的无水乙醇，在冰箱中静置10h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物经抽滤后得到粗多糖，并用80％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，获得蒺藜多糖0.288g，多糖含量为60.52％，而对照(热水浸提法)获得的蒺藜多糖为0.243g，多糖含量为43.68％。
实施例4：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5g过筛后的蒺藜粉末浸泡于125ml的蒸馏水中，用1.0mol/L的NaOH或1.0mol/L的HCl将添加蒺藜粉末的蒸馏水的pH值调至5.0，然后在53℃水浴保温5分钟再添加蒺藜粉末质量2.0％的纤维素酶和1.3％的果胶酶保温酶解2.0h；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温10min，使加入的酶制剂变性失活，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至5.0mL，然后再向浓缩液中加入20ml的无水乙醇，在冰箱中静置14h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物经抽滤后得到粗多糖，并用75％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，获得蒺藜多糖0.325g，多糖含量为62.82％，而对照(热水浸提法)获得的蒺藜多糖为0.251g，多糖含量为43.12％。
实施例5：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5g过筛后的蒺藜粉末浸泡于140ml的蒸馏水中，用1.0mol/L的NaOH或1.0mol/L的HCl将添加蒺藜粉末的蒸馏水的pH值调至6.5，然后在51℃水浴保温5分钟再添加蒺藜粉末质量0.5％的果胶酶保温酶解4.5h；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温20min，使加入的酶制剂变性失活，然后用布氏漏斗抽滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至5.0mL，然后再向浓缩液中加入16ml的无水乙醇，在冰箱中静置20h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物经抽滤后得到粗多糖，并用85％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，即获得蒺藜多糖。
Claims (4)
1.酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于：
1)粉碎过筛：将干燥的蒺藜粉碎后过40目筛；
2)酶处理：按质量份数取5份过筛后的蒺藜粉末浸泡于100-150份的蒸馏水中并调节pH值至4.6-7.0，然后水浴锅升至50-55℃，再添加蒺藜粉末质量0.5-3.3％的复合酶，并50-55℃保温酶解2.0-4.5h；
所述的复合酶采用活性为8000U/g的纤维素酶、活性为10000U/g的木聚糖酶、活性为30000U/g的果胶酶中的一种或几种；
3)灭酶过滤：将浸泡液加热至95℃，并保温10-20min，使加入的酶制剂变性失活，然后过滤，收集滤液为蒺藜多糖提取液；
4)浓缩及醇沉：将步骤3)得到的蒺藜多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩至原蒺藜粉末相同的质量体积，然后再加入3-4倍浓缩液体积的无水乙醇，在冰箱中静置10-20h；
5)抽滤及洗涤：将步骤4)静置的乙醇沉淀物抽滤后得到粗多糖，并用75-85％的乙醇液进行洗涤，再用氯仿及正丁醇进行洗涤；
6)干燥及粉碎：将步骤5)得到的沉淀在45-60℃烘干至恒重，然后粉碎，即获得蒺藜多糖。
2.根据权利要求1所述的酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于：所述的纤维素酶采用绿色木霉固态发酵后经PEG4000/(NH4)2SO4双水相萃取制备而成，纤维素酶的添加量为0.5-2.5％。
3.根据权利要求1所述的酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于：所述的木聚糖酶的添加量为0.75-3.0％。
4.根据权利要求1所述的酶法辅助提取蒺藜多糖的方法，其特征在于：所述的果胶酶的添加量为0.5-2.0％。
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