CN110652005A - 一种酶解法制备枳椇子提取物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶解法制备枳椇子提取物的方法。包括枳椇子粉加入去离子水搅拌，加入复合酶，50‑60℃提取，过滤；滤液于60℃经高速离心机过滤，于58‑60℃下，真空浓缩；浓缩液真空烘干，即得溶化性较好的枳椇子提取物。本发明采用生物酶解技术，能选择性地破坏植物细胞壁，有利于有效成分的溶出，极大地改善了提取物的澄清度，显著提高枳椇子总黄酮的回收率。枳椇子提取物产品可广泛应用于食品、饮料及保健食品，实用性强。本发明方法操作简单、工艺条件温和，极大地节约成本，易于工业化生产，有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体地，涉及一种酶解法制备枳椇子提取物的方法。
背景技术
枳椇子为鼠李科枳椇属植物北枳椇Hovenia dulcis Thunnb.枳椇Hoveniaacerba Lindl.和毛果枳椇Hovenia trichocarpa Chun et Tsiang的成熟种子。亦有用带花序轴的果实。植物北枳椇，分布于中国华北、西北、华东、中南、西南及台湾。植物枳椇，分布于华北、华东、中南、西南及陕西、甘肃等地。植物毛果枳椇，分布于浙江、江西、湖北、湖南、广东及贵州。具有解酒毒，止渴除烦，止呕，利大小便之功效。主治醉酒，烦渴，呕吐，二便不利。枳椇子含有大量的黄酮类成分，如槲皮素(quecetin)、杨梅素(myricitin)、双氢槲皮素(dihydroquercetin)、(2R,3R)-二氢杨梅素[(2R,3R)-dihydromyricitin]、(-)-没食子儿茶素[(-)-gallocatechin]、斯皮诺素(spinosin)、异牡荆素2″-O-β-D-葡萄糖苷(isovitexin 2″-O-β-D-glucopyranoside)等，研究表明，黄酮类物质可作用于肝代谢酶系，加速乙醇及其代谢产物的消除速率，减轻其对组织的细胞损害，还能抑制酒精的胃肠吸收，加强乙醇在胃肠道的首过效应，降低血中的乙醇浓度从而起到解酒醒酒的功效。
由于黄酮类物质在纯水中溶解性较差，而易溶于乙醇、甲醇或者氢氧化钠溶液，因此现有技术中对枳椇子的提取主要采用乙醇提取法或酸碱提取法。但是这些方法在提取黄酮类物质的同时，也将大量其他水不溶性成分溶出，如皂苷、油脂等。另外，得到的枳椇子提取物的水溶解性较差，水溶液浑浊，很难直接应用到饮料行业；并且操作步骤繁琐、成本较高。CN200810226063.3公开了一种枳椇子提取物及其制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。该方法是用水和/或有机溶剂作为提取剂，从枳椇子中提取得到。所用有机溶剂为甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯。回流提取时的温度为60-100℃；提取次数至少为1次，每次提取时间为1-4小时。而该方法使用了大量的有机溶剂，成本高，工艺复杂，得到的枳椇子提取物的水溶解性较差，水溶液浑浊，很难直接应用到食品饮料行业。CN201310617256.2公开了一种半仿生提取技术制备枳椇子提取物的方法，其制备方法为：一、净制枳椇子药材；二、称量药材及提取溶剂、酸碱；三、粉碎药材；四：配制提取溶液；五、采用半仿生技术提取枳椇子；六、浓缩药液；七、烘干提取流浸膏；八、气流粉碎干浸膏，过120目筛；九、混匀干浸膏粉，即得。该发明使用了酸碱，环境不友好，成本较高，无法直接应用于食品饮料行业。而且，大部分药用植物的有效成分都是包裹在细胞壁内，植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木脂素等物质构成的致密结构。在提取药用植物有效成分过程中，有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。
生物酶是由活细胞产生，并可在细胞内或细胞外起催化作用的一类蛋白质，能选择性地破坏植物细胞壁，从而使植物细胞内的成分更容易溶解、扩散。如纤维素酶可以水解纤维素，果胶酶可以水解果胶质。通过酶解反应，温和地分解细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等成分，破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩解等变化，减小细胞壁及细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而有利于有效成分的溶出。而木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、葡萄糖苷酶等可以将淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，改善提取澄清度。生物酶解技术，具有成分浸出率高、减少热敏成分降解、成本低廉，无需特殊设备就能完成等优势，且有大规模工业化生产的潜力。该技术已经广泛用于多糖、生物碱、黄酮、皂苷、蛋白质、有机酸等中药有效成分的提取中，与传统提取技术相比具有明显的优势。
因而，需要进一步改进枳椇子提取物的制备方法，具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计具有高澄清度水溶性的枳椇子提取物制备方法。
本发明提供了一种酶解法制备枳椇子提取物的方法。
该方法包括下列步骤：
(1)取枳椇子，打粗粉，过10目-40目筛；优选过10目筛
(2)加入药材总重量的10倍量的去离子水于室温搅拌0.5h，加入药材总重量0.01-0.2％的复合酶，各种酶的活力单位在
4000-300000U/g之间，升温至50-60℃，提取5h；
(3)200目滤袋过滤；
(4)将所述步骤(3)得到的滤液于60℃经高速离心机过滤，离心速率为8000r/min；
(5)离心液于58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，浓缩成含固率20-30％的浓缩液，取出。
(6)浓缩液在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，真空烘干(温度保持在58-60℃)，得到黄色块状固体，取出，粉碎、过80目筛，即得溶化性较好的枳椇子提取物。
本发明方法，步骤(2)所述复合酶选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或葡萄糖苷酶的组合；优选纤维素酶和木瓜蛋白酶、果胶酶和菠萝蛋白酶或半纤维素酶和葡萄糖苷酶的组合。
所述步骤(2)复合酶中，各种酶的活力单位在4000-300000U/g之间；优选在7000-100000U/g之间。
所述步骤(2)提取温度为50-60℃。
所述步骤(2)提取时间为5h。
所述步骤(4)高速离心机可以选用管式离心机、碟式离心机、卧式离心机等，离心速率7000-12000r/min；
所述步骤(5)浓缩温度为58-60℃；
所述步骤(5)浓缩真空度为-0.09-0.095Mpa；
所述步骤(5)固体粉碎后粉末过80目筛网；
本文中，所述室温是指16℃～25℃。
本文中，所述倍量是指液料之比为V/W。
本发明方法得到的枳椇子提取物产品的技术指标如下表：
(1)本发明采用了生物酶解技术，能选择性地破坏植物细胞壁，从而使植物细胞内的成分更容易溶解、扩散，有利于有效成分的溶出，可以显著提高枳椇子总黄酮的回收率。
(2)本发明采取的生物酶可以将淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，极大地改善了提取物的澄清度。
(3)本发明方法操作简单、可行，工艺条件温和，不会破坏产品有效成分，不仅能极大地节约成本，易于工业化生产，有较大的应用价值。
(4)采用本发明方法可以获得澄清度和水溶解性非常好的枳椇子提取物产品，可以广泛应用于食品、饮料及保健食品行业，实用性更好。
附图说明
图1实施例6提取溶剂用量对提取得率的影响
纵坐标 提取得率
横坐标 溶剂用量
溶剂 去离子水
图2实施例6提取温度对提取得率的影响
纵坐标 提取得率
横坐标 温度
溶剂 去离子水
图3实施例5提取时间对提取得率的影响
纵坐标 提取得率
横坐标 提取时间
溶剂 去离子水
具体实施方式
本实施例所用原料和试剂，除另有说明外，均可市售得到。
说明：本发明所用的反渗透饮用纯净水，是通过设备型号为KYRO025TH-1的反渗透饮用纯净水机制得，设备符合(中国国家行业标准)HY/T068-2002“饮用水制备系统SRO系列反渗透设备”标准，水质量符合(中国国家标准)GB17324-2003“瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准”规定的要求。
其总黄酮检测方法按2015版药典中规定。
实施例1
取1kg枳椇子(购自湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经检测，总黄酮含量为2.4％)，打粗粉(过10目筛)，置于提取罐中，加入10L反渗透饮用纯净水，开启搅拌，升温至48-52℃，加入0.2g纤维素酶+0.1g木瓜蛋白酶(购自上海如吉生物科技发展有限公司，纤维素酶活性30万IU/g,木瓜蛋白酶活性20万IU/g)，提取5h。提取结束后，过200目滤袋，滤去大部分残渣，滤液进高速管式离心机(型号：博盛GQ75RS)离心，转速调整为7000r/min，得到离心清液，离心液在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，浓缩到含固率25％料液608g，取出，在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，真空烘干，得到152g黄色枳椇子提取物，提取得率为15.20％，经检测，总黄酮含量达到14.8％，总黄酮回收率为93.73％。同时对产品进行了澄清度的评价，结果如下：
其中产品浊度、透光率的测定方法：
浊度用浊度计(哈希US61M/2100AN)进行检测，透光率用紫外分光光度计(UNICOUV/VIS 2800)于680nm处测透光率。浊度越低，透光率越高，说明澄清度越好。
本实施例制得的枳椇子提取物具有良好的水溶性，水溶液澄清度高，总黄酮含量高，符合质量要求，同时工艺简单，提取物收率和总黄酮回收率较好，适合工业化生产。
实施例2
取5kg枳椇子(购自湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经检测，总黄酮含量为2.4％)，打粗粉(过10目筛)，置于提取罐中，加入50L反渗透饮用纯净水，开启搅拌，升温至48-52℃，加入1g果胶酶+0.5g菠萝蛋白酶(购自上海如吉生物科技发展有限公司，果胶酶活性30万IU/g,菠萝蛋白酶活性5万IU/g)，提取5h。提取结束后，过200目滤袋，滤去大部分残渣，滤液进高速管式离心机(型号：博盛GQ75RS)离心，转速调整为8000r/min，得到离心清液，离心液在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，浓缩到含固率29.8％料液2480g，取出，在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，真空烘干，得到740g黄色枳椇子提取物，提取得率为14.8％，经检测，总黄酮含量达到14.5％，总黄酮回收率为89.42％。同时对产品进行了澄清度的评价，结果如下：
其中产品浊度、透光率的测定方法：
浊度用浊度计(哈希US61M/2100AN)进行检测，透光率用紫外分光光度计(UNICOUV/VIS 2800)于680nm处测透光率。浊度越低，透光率越高，说明澄清度越好。
本实施例制得的枳椇子提取物具有良好的水溶性，水溶液澄清度高，总黄酮含量高，符合质量要求，同时工艺简单，提取物收率和总黄酮回收率较好，适合工业化生产。
实施例3
取10kg枳椇子(购自湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经检测，总黄酮含量为2.4％)，打粗粉(过10目筛)，置于提取罐中，加入100L反渗透饮用纯净水，开启搅拌，升温至48-52℃，加入2g半纤维素酶+1g葡萄糖苷酶(购自上海如吉生物科技发展有限公司，半纤维素酶活性20万IU/g,菠萝蛋白酶活性10万IU/g)，提取5h。提取结束后，过200目滤袋，滤去大部分残渣，滤液进高速管式离心机离心(型号：博盛GQ75RS)，转速调整为10000r/min，得到离心清液，离心液在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，浓缩到含固率32.2％料液4560g，取出，在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，真空烘干至恒重，得到1470g黄色枳椇子提取物，提取得率为14.7％，经检测，总黄酮含量达到15.8％，总黄酮回收率为96.8％。同时对产品进行了澄清度的评价，结果如下：
其中产品浊度、透光率的测定方法：
浊度用浊度计(哈希US61M/2100AN)进行检测，透光率用紫外分光光度计(UNICOUV/VIS 2800)于680nm处测透光率。浊度越低，透光率越高，说明澄清度越好。
本实施例制得的枳椇子提取物具有良好的水溶性，水溶液澄清度高，总黄酮含量高，符合质量要求，同时工艺简单，提取物收率和总黄酮回收率较好，适合工业化生产。
实施例4对比例1
取200g枳椇子(购自湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经检测，总黄酮含量为2.4％)，加入600mL 95％乙醇(乙醇：水＝95：5，体积比)混合，在60℃条件下回流提取3h，抽滤，收集第一次回流提取液1和滤渣1；将得到的所有滤渣1与95％乙醇混合，95％乙醇的量与第一次相同，在60℃条件下提取3h，收集第二次回流提取液2和滤渣2，并将提取液2与提取液1合并；将得到的所有滤渣2与95％乙醇混合，95％乙醇的量与第一次相同，60℃回流提取3h，抽滤，收集第三次回流提取液3；将提取液1、提取液2和提取液3合并，将所得的提取液于58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，进行真空减压浓缩、真空干燥(去除乙醇和水)至恒重，得到8.46g枳椇子提取物。提取得率为4.23％，经检测，总黄酮含量达到21.86％，总黄酮回收率为54.07％。同时对产品进行了澄清度的评价，结果如下：
其中产品浊度、透光率的测定方法：
浊度用浊度计(哈希US61M/2100AN)进行检测，透光率用紫外分光光度计(UNICOUV/VIS 2800)于680nm处测透光率。浊度越低，透光率越高，说明澄清度越好。
本实施例制得的枳椇子提取物水溶性较差，水溶液不澄清，不适合在饮料行业中直接应用，产品总黄酮含量符合质量要求，但工艺复杂，提取物收率和总黄酮回收率较低，成本偏高，不适合工业化生产。
实施例5对比例2
取1kg枳椇子(购自湖南省松龄堂中药饮片有限公司，经检测，总黄酮含量为2.4％)，加入3L 95％乙醇(乙醇：水＝95：5，体积比)混合，置于提取罐中，在60℃条件下回流提取3h，抽滤，收集第一次回流提取液1和滤渣1；将得到的所有滤渣1与95％乙醇混合，95％乙醇的量与第一次相同，在60℃条件下提取3h，收集第二次回流提取液2和滤渣2，并将提取液2与提取液1合并；将得到的所有滤渣2与95％乙醇混合，95％乙醇的量与第一次相同，置于提取罐中，60℃回流提取3h，抽滤，收集第三次回流提取液3；将提取液1、提取液2和提取液3合并，将所得的提取液于58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，进行真空减压浓缩、真空干燥(去除乙醇和水)至恒重，得到50.8g枳椇子提取物。提取得率为4.58％，经检测，总黄酮含量达到19.38％，总黄酮回收率为41.02％。同时对产品进行了澄清度的评价，结果如下：
其中产品浊度、透光率的测定方法：
浊度用浊度计(哈希US61M/2100AN)进行检测，透光率用紫外分光光度计(UNICOUV/VIS 2800)于680nm处测透光率。浊度越低，透光率越高，说明澄清度越好。
本实施例制得的枳椇子提取物水溶性较差，水溶液不澄清，不适合在饮料行业中直接应用，产品总黄酮含量符合质量要求，但工艺复杂，提取物收率和总黄酮回收率较低，成本偏高，不适合工业化生产。
实施例6
为了得到最佳工艺条件，发明人做了大量的实验，对提取溶剂用量、提取温度和提取时间分别做了考察，结果如下：
1.溶剂用量考察
精密称取枳椇子粉末100g，放入提取瓶中，用去离子水作为提取溶剂，加入复合酶(0.02g纤维素酶+0.01g木瓜蛋白酶)(购自上海如吉生物科技发展有限公司，纤维素酶活性30万IU/g,木瓜蛋白酶活性20万IU/g)，50℃下，搅拌提取5h，分别过200目滤袋，GL-21M高速离心机(转速7000r/min)，其中去离子水用量水平如下：
实验结果如图1所示：
可见，随着溶剂用量的增加，提取得率在不断上升，但在10ml/g物料以上的水平，其上升变得非常缓慢，从工业化生产和节约能源的角度，选择10ml/g物料的水平可以达到较好的效果。
2.提取温度考察
精密称取枳椇子粉末100g，放入提取瓶中，加1000ml去离子水作为提取溶剂，加入复合酶(0.02g纤维素酶+0.01g木瓜蛋白酶)(购自上海如吉生物科技发展有限公司，纤维素酶活性30万IU/g,木瓜蛋白酶活性20万IU/g)，在一定温度下，搅拌提取5h，分别过200目滤袋，GL-21M高速离心机(转速7000r/min)，其中提取温度水平如下：
| 实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 提取温度 | 30℃ | 40℃ | 50℃ | 60℃ | 70℃ |
实验结果如图2所示：
可见，随着温度的增加，提取得率先是增加，在50℃时达到一个最高得率，温度继续增加，得率反而下降，这是由于生物酶在50℃左右具有最佳的生物活性，温度过低会抑制酶的活性，温度过高则会造成酶的失活，因此，我们选择50℃作为最佳提取温度。
3.提取时间考察
精密称取枳椇子粉末100g，放入提取瓶中，加1000ml去离子水作为提取溶剂，加入复合酶(0.02g纤维素酶+0.01g木瓜蛋白酶)(购自上海如吉生物科技发展有限公司，纤维素酶活性30万IU/g,木瓜蛋白酶活性20万IU/g)，在50℃下，搅拌提取一定时间，分别过200目滤袋，GL-21M高速离心机(转速7000r/min)，其中提取温度水平如下：
| 实验编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 提取时间 | 3h | 4h | 5h | 6h | 7h |
实验结果如图3所示：
可见，随着提取时间的延长，提取得率在不断上升，但在5h以后，其上升变得非常缓慢，从工业化生产和节约能源的角度，选择5h的提取时间可以达到较好的效果。
综合以上实验，我们选择的提取条件为：提取溶剂量10ml/g，提取温度50℃，提取时间5h，提取1次，可以达到满意的提取得率。
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
其总黄酮检测方法按2015版药典中规定。
Claims (9)
1.一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)取枳椇子，打粗粉，过10目-40目筛；
(2)加入药材总重量的10倍量的去离子水于室温搅拌0.5h，加入药材总重量0.01-0.2％的复合酶，各种酶的活力单位在4000-300000U/g之间，升温至50-60℃，提取5h；
(3)200目滤袋过滤；
(4)将所述步骤(3)得到的滤液于60℃经高速离心机过滤，离心速率为8000r/min；
(5)离心液于58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，浓缩成含固率20-30％的浓缩液，取出。
(6)浓缩液在58-60℃下，保持真空度为-0.09-0.095Mpa，真空烘干，温度保持在58-60℃，得到黄色块状固体，取出，粉碎、过80目筛，即得溶化性较好的枳椇子提取物。
2.根据权利要求1所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，步骤(1)所述取枳椇子，打粗粉过10目筛。
3.根据权利要求1所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，步骤(2)所述复合酶选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或葡萄糖苷酶的组合。
4.根据权利要求3所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，步骤(2)所述复合酶选自纤维素酶和木瓜蛋白酶、果胶酶和菠萝蛋白酶或半纤维素酶和葡萄糖苷酶的组合。
5.根据权利要求1所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)复合酶中，各种酶的活力单位在4000-300000U/g之间。
6.根据权利要求5所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)复合酶中，各种酶的活力单位在7000-10000U/g之间。
7.根据权利要求1所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)提取温度为50-60℃；提取时间为5h。
8.根据权利要求1所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，所述步骤(4)高速离心机可以选用管式离心机、碟式离心机、卧式离心机等，离心速率7000-12000r/min。
9.根据权利要求1所述一种酶解法制备枳椇子提取物的方法，其特征在于，所述步骤(5)浓缩温度为58-60℃；浓缩真空度为-0.09-0.095Mpa；固体粉碎后粉末过80目筛网。
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