CN104372045A - 一种高纯度萝卜硫素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度萝卜硫素的制备方法，是将西兰花种子或西兰花花球粉碎，经酶解、高压均质、过滤、离子液体萃取等过程得到高纯度的萝卜硫素。本发明方法步骤简单、易于操作，加入萝卜汁，增加黑芥子硫酸苷酶的含量，VC催化显著活化芥子酶的活性，提高了萝卜硫素的转化率；高压均质提取，提高了萝卜硫素的提取率，缩短了提取时间；离子液体萃取，提高了萃取效率，经济环保，最终萝卜硫素的纯度高达95％以上，整个工艺时间不超过4个小时，提高了生产效率，且整个提取工艺过程中无需其他有机试剂，无污染，低温操作，属于典型的绿色环保工艺。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种提取纯化方法，具体地说是一种高纯度萝卜硫素的制备方法，属于农业产品深加工领域。
二、背景技术
萝卜硫素是迄今为止蔬菜中发现的防癌抗癌能力最强的天然产物之一，对多种癌细胞有明显的阻断作用，并且具有抗菌、提高机体抗氧化能力和增强免疫力等药理作用，对人体无明显的不良反应，具有被开发成新型抗癌药或保健品的潜力，具有广阔的市场前景。
化学合成的萝卜硫素的药理活性明显偏低，目前萝卜硫素主要来源于西兰花种子。现有的大多数方法都是从十字花科蔬菜中直接提取萝卜硫素前体，经水解获得萝卜硫素。CN102898341 A公开了一种高纯度萝卜硫素的提取纯化方法，该方法将西兰花种子粉碎水解8小时，无水乙醇超声浸提半小时，利用大孔树脂和氧化铝柱柱层析纯化，极性液体萃取得到萝卜硫素纯品。该工艺纯化过程中需经大孔树脂梯度洗脱，耗时长，步骤繁琐，成本高，难以进行工业化生产。CN 101544995 A和CN 101143842 A采用丙酮浸提得到萝卜硫素粗品，经过硅胶柱纯化，正己烷、丙酮或甲醇水梯度洗脱得到高纯度的萝卜硫素。该工艺生产过程复杂，丙酮、正己烷及甲醇等有机试剂的消耗量大且存在一定的毒性，硅胶柱展开剂中使用有毒试剂洗脱，生产过程中存在易燃易爆等问题，柱层析材料再生难，也不适宜于工业化生产。
三、发明内容
本发明旨在提供一种高纯度萝卜硫素的制备方法，是以西兰花种子或西兰花花球为原料，粉碎过筛后加入富含黑芥子硫酸苷酶的新鲜萝卜汁和少量的VC(提高芥子酶活性)，在室温下酶解一定时间后高压均质提取萝卜硫素，再利用高萃取率的离子液体萃取技术对萝卜硫素进行纯化。本发明制备工艺简单易行、效率高、产品纯度高，整个操作过程无需加热，适宜于工业化生产。
本发明高纯度萝卜硫素的制备方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的萝卜洗净，加入0.1-1倍质量的水，粉碎后得到萝卜汁；
2)将干燥的西兰花种子或西兰花花球粉碎过30-60目筛，加入步骤1)制备的萝卜汁和VC室温下催化酶解30-60分钟，得到固液混合物；萝卜汁的质量是西兰花种子质量的1-2倍，VC的质量是西兰花种子质量的0.001-0.005倍，VC可提高芥子酶活性100倍以上。
3)向步骤2)得到的固液混合物中加入4-5倍质量的水，混合均匀，高压均质提取，过滤收集滤液；高压均质提取相对于其他离心式分散乳化设备，细化作用更为强烈。高压均质提取的压力为40-60MPa，均质液抽滤或双层纱布过滤。
4)向步骤3)得到的滤液中加入离子液体萃取2-3次，合并有机相，向有机相中加入1-3倍体积的无水乙醇反萃出萝卜硫素，回收离子液体；所述离子液体为[BMIM][PF6]，离子液体与滤液的体积比为1:1-3。离子液体无味、无污染、稳定性强，其对有机物和无机物都有良好的溶解性能，作用快，比常规的有机溶剂的粘度大，能极大的提高萃取率，具有简单、快速、灵敏、绿色环保等特点，而且具有良好的热稳定性和化学稳定性，易与其他物质分离，可循环利用。
5)将步骤4)反萃得到的萝卜硫素与乙醇的混合液真空浓缩，即得到纯度大于95％的萝卜硫素。
本发明使用的萝卜可为白萝卜、红心萝卜及胡萝卜等十字花科萝卜属植物，因为几乎所有的十字花科植物中都含有大量的黑芥子硫酸苷酶，与西兰花种子混合后，可增加黑芥子硫酸苷酶的含量，明显提高萝卜硫素的转化率，减少酶解时间。
本发明以西兰花种子或西兰花花球为原料，加入萝卜汁，丰富了黑芥子硫酸苷酶的含量，高压均质技术使物料在高压下产生强烈的剪切、撞击和空穴作用，使液态物质或以液体为载体的固体颗粒得到超微细化，增加了萝卜硫素的转化率；纯化过程中直接使用离子液体萃取，离子液体不易挥发、性质稳定，比常用的有机溶剂的粘度大，可以悬挂较大的体积，萃取率高，可回收利用，经济环保，整个过程无需加热，保证了萝卜硫素的生物活性。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、萝卜硫素的提取大多单独以西兰花种子或萝卜系为原料，本发明在以西兰花种子或西兰花花球为原料的基础上，加入萝卜汁，萝卜组织中含有丰富的芥子酶，可增加酶解体系中黑芥子硫酸苷酶的含量，VC可提高芥子酶的活性100倍以上，整个反应体系在提高萝卜硫素转化率的基础上可节约成本。
2、目前常规的萝卜硫素的纯化方法多以有机溶剂萃取，柱层析纯化，萃取时间长且溶剂有残留，柱层析纯化过程中使用有毒有机试剂洗脱，层析材料再生难，成本高，对萝卜硫素的纯度和生物活性都造成一定的影响，本发明在对萝卜硫素纯化过程中首次使用离子液体萃取，萃取率高，制备简单。
离子液体是指由有机阳离子和阴离子构成的在室温下呈液态的盐类化合物，蒸汽压非常小，不挥发，性质稳定，在使用和储存中不会蒸发散失，可以循环使用，消除了挥发性有机化合物环境污染问题，比常用的有机溶剂的粘度大，可以悬挂较大的体积，萃取率高，制备简单，无残留，经济环保。
3、高压均质技术使物料在高压下产生强烈的剪切、撞击和空穴作用，从而使液态物质或以液体为载体的固体颗粒得到超微细化，打破了硫苷和黑芥子硫酸苷酶之间的物理隔离，缩短了酶解时间,增加了萝卜硫素的转化率；它比常规的分散乳化设备如胶体磨、高剪切混合乳化机等的细化作用更为强烈，细化作用主要是利用物料间的相互作用，所以物料的发热量较小，能保持物料的性能基本不变。
4、传统的提取纯化工艺需要50小时左右，本发明整个制备工艺完成时间不超过4个小时，操作过程中无需加热，保证了萝卜硫素的生物活性，提高了生产效率，降低了能耗，属于典型的绿色环保工艺，适宜于工业化生产。
四、附图说明
图1是本发明实施例3制备的萝卜硫素的高效液相色谱图。色谱条件：分析柱Shim-packVP-ODS C18(10μm；Shimadzu，Tokyo，Japan)；柱温30℃；流动相：乙腈：水＝7：3；流速：0.8mL/min；上样量为20μL。检测出此样品的萝卜硫素纯度为98.96％。
五、具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
1)称取洗净的红心萝卜1kg，加入200mL的水，用组织捣碎机捣碎得到萝卜汁；
2)将干燥的西兰花种子100g粉碎过60目筛，加入200mL步骤1)制备的萝卜汁和0.1gVC室温下催化酶解30分钟，得到固液混合物；
3)向步骤2)得到的固液混合物中加入2000mL水，混合均匀，40MPa高压均质循环提取，过滤收集滤液；
4)向步骤3)得到的滤液中加入2000mL离子液体[BMIM][PF6]萃取3次，合并有机相，向有机相中加入2000mL无水乙醇反萃出萝卜硫素，回收离子液体；
5)将步骤4)反萃得到的萝卜硫素与乙醇的混合液真空浓缩至油状浸膏，即得萝卜硫素提取物。称取5mg的油状浸膏加入10mL甲醇溶解，再用HPLC检测，所得萝卜硫素提取物的纯度大于96％。
实施例2：
1)称取洗净的胡萝卜1kg，加入400mL的水，用组织捣碎机捣碎得到萝卜汁；
2)将干燥的西兰花种子300g粉碎过60目筛，加入400mL步骤1)制备的萝卜汁和0.3gVC室温下催化酶解50分钟，得到固液混合物；
3)向步骤2)得到的固液混合物中加入4000mL水，混合均匀，60MPa高压均质循环提取，过滤收集滤液；
4)向步骤3)得到的滤液中加入3000mL离子液体[BMIM][PF6]萃取3次，合并有机相，向有机相中加入3000mL无水乙醇反萃出萝卜硫素，回收离子液体；
5)将步骤4)反萃得到的萝卜硫素与乙醇的混合液真空浓缩至油状浸膏，即得萝卜硫素提取物。称取5mg的油状浸膏加入10mL甲醇溶解，再用HPLC检测，所得萝卜硫素提取物的纯度大于97％。
实施例3：
1)称取洗净的白萝卜1kg，加入300mL的水，用组织捣碎机捣碎得到萝卜汁；
2)将干燥的西兰花种子200g粉碎过60目筛，加入300mL步骤1)制备的萝卜汁和0.2gVC室温下催化酶解40分钟，得到固液混合物；
3)向步骤2)得到的固液混合物中加入3000mL水，混合均匀，50MPa高压均质循环提取，过滤收集滤液；
4)向步骤3)得到的滤液中加入4000mL离子液体[BMIM][PF6]萃取3次，合并有机相，向有机相中加入3000mL无水乙醇反萃出萝卜硫素，回收离子液体；
5)将步骤4)反萃得到的萝卜硫素与乙醇的混合液真空浓缩至油状浸膏，即得萝卜硫素提取物。称取5mg的油状浸膏加入10mL甲醇溶解，再用HPLC检测，所得萝卜硫素提取物的纯度大于98％。
Claims (5)
1.一种高纯度萝卜硫素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将新鲜的萝卜洗净，加入0.1-1倍质量的水，粉碎后得到萝卜汁；
2)将干燥的西兰花种子或西兰花花球粉碎过30-60目筛，加入步骤1)制备的萝卜汁和VC室温下催化酶解30-60分钟，得到固液混合物；
3)向步骤2)得到的固液混合物中加入4-5倍质量的水，混合均匀，高压均质提取，过滤收集滤液；
4)向步骤3)得到的滤液中加入离子液体萃取2-3次，合并有机相，向有机相中加入1-3倍体积的无水乙醇反萃出萝卜硫素，回收离子液体；
5)将步骤4)反萃得到的萝卜硫素与乙醇的混合液真空浓缩，即得到纯度大于95％的萝卜硫素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
萝卜汁的质量是西兰花种子质量的1-2倍。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
VC的质量是西兰花种子质量的0.001-0.005倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
高压均质提取的压力为40-60MPa。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述离子液体为[BMIM][PF6]，离子液体与滤液的体积比为1:1-3。
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