CN107630051A - 一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法：新鲜萝卜芽苗烘干，粉碎，正己烷提取，得除杂的萝卜芽苗微粉；加入正己烷预分散；完成后加入磷酸盐缓冲溶液，酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素；调节溶液pH值，静置；加入无水硫酸钠，脱水处理；减压蒸馏，得还原型萝卜硫素提取物。本发明的方法不仅可快速高得率的酶解获得还原型萝卜硫素提取物，而且具有高萃取率、高稳定性的特点，显著提高还原型萝卜硫素提取物的总体制备工艺收率，大幅降低还原型萝卜硫素的生产成本，避免了二氯甲烷、氯仿等高毒性有机溶剂的使用，对环境无污染，特别适合工业化生产制备还原型萝卜硫素提取物。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法。
背景技术
研究表明，萝卜具有很好的抗癌、防癌效果，长期大量食用萝卜的人群的癌症发病率明显低于不食用或少量食用萝卜的人群，原因在于萝卜中富含硫代葡萄糖苷类化合物。其能被萝卜自身的黑芥子酶催化酶解，再经分子内重排，最终生成具有显著抗癌、防癌效果的异硫氰酸酯类化合物。萝卜中主要富含两种硫代葡萄糖苷类化合物（氧化型萝卜硫苷，Glucoraphenin；还原型萝卜硫苷，Glucoraphasatin），其中，萝卜芽苗中主要富含的硫代葡萄糖苷类化合物为还原型萝卜硫苷，其经萝卜芽苗自身富含的黑芥子酶催化酶解，再经分子内重排反应，最终转化生成还原型萝卜硫素（Raphasatin，分子式为C6H9NS2）。还原型萝卜硫素的化学结构式如下：
据相关研究报道，还原型萝卜硫素具有很好的抗癌、防癌效果，其抗癌与防癌作用机制为：（1）显著诱导Ⅱ相解毒酶的表达，促使人体快速代谢并排泄机体内积聚的大量致癌物质；（2）显著诱导多种癌细胞的快速凋亡；（3）显著诱导多种癌细胞增殖周期的停滞；（4）有效抑制多种癌细胞的增殖，并杀死癌细胞；（5）有效抑制幽门螺杆菌的增殖，并杀死幽门螺杆菌，从而高效预防胃癌的形成。另外，还原型萝卜硫素还具有很好的抗氧化、抗菌、抗突变等药理活性。
近几年来，随着国内外对还原型萝卜硫素抗癌防癌及其它药理活性研究的不断深入，富含还原型萝卜硫素相关产品越来越受到人们的关注，对还原型萝卜硫素提取物的需求也在不断增加，现有的还原型萝卜硫素生产制备方法已经难以满足市场的需求。现有的还原型萝卜硫素制备方法有化学合成法和黑芥子酶酶解法。化学合成法可以大量获得还原型萝卜硫素，且为外消旋体，但从萝卜芽苗中制备获得的天然还原型萝卜硫素为左旋体，且产品中高毒性的有机溶剂残留量较高，很难满足保健食品和药品的要求。黑芥子酶酶解法可以从萝卜根茎和萝卜芽苗中制备获得还原型萝卜硫素，但现有的制备方法效率低、还原型萝卜硫素得率低、生产成本高，不适合工业化生产。另外，现有的黑芥子酶酶解法需要大量的水溶液反应体系，但还原型萝卜硫素对水分子非常敏感，水分子可快速攻击还原型萝卜硫素分子中的异硫氰酸基团，导致酶解生成的还原型萝卜硫素快速降解，进一步增加了还原型萝卜硫素的生产制备难度。
发明内容
本发明提供了一种高萃取率、高稳定性的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，是由以下步骤制得的：
1）取新鲜萝卜芽苗，烘干，得干燥萝卜芽苗；将干燥萝卜芽苗粉碎，得萝卜芽苗微粉；
本发明的烘干温度可显著降低新鲜萝卜芽苗的水含量，并显著提高萝卜芽苗中还原型萝卜硫素的酶解底物还原型萝卜硫苷的保留率至96.5%以上，有效避免萝卜芽苗干燥过程中还原型萝卜硫苷的降解。
2）将萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取，加入正己烷，在提取温度15-55℃和分散盘转速50-500rpm条件下，分散提取0.5-3h；提取完成后静置8-12h，减压过滤或离心，得微粉；重复分散提取1-5次，得除杂的萝卜芽苗微粉；
正己烷分散提取可脱除萝卜芽苗微粉中叶绿素和油脂等弱极性杂质组分，脱除率达到98.5%以上，避免该弱极性杂质组分掺杂在还原型萝卜硫素中，显著提高产品中还原型萝卜硫素的纯度。静置8-12h的目的是使萝卜芽苗微粉充分沉降。
3）将除杂的萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中，加入正己烷，在温度15-35℃和分散盘转速50-500rpm条件下，预分散5-30min；预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液，酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素30-180min；反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至1.0-2.5，静置1-5h；充分收集正己烷相，加入无水硫酸钠，在转速为50-500rpm条件下，脱水处理1-5h；在温度为30-50℃条件下，减压蒸馏回收正己烷，得还原型萝卜硫素提取物。
静置的目的是使正己烷相与磷酸盐缓冲溶液相充分分层，利于正己烷相的充分收集。
所述步骤1）中，新鲜萝卜芽苗的发芽和生长总时间为7-15天，培养大棚温度为15-35℃，湿度为65-85%。
所述步骤1）中，烘干的温度为40-60℃；干燥萝卜芽苗的含水量为0.5-5%；萝卜芽苗微粉的粒径为150-550μm。
所述步骤2）中，萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：5-30L。
所述步骤3）中，除杂的萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：3-25L；除杂的萝卜芽苗微粉质量：磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg：3-25L；无水硫酸钠质量：正己烷体积之比为0.01-0.15kg：1L；
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02-0.2mol/L、pH值为3.0-7.0、维生素C含量为0-1.5mmoL/L。
本发明采用正己烷相-磷酸盐缓冲溶液相两相体系实现酶解与萃取偶联，即磷酸盐缓冲溶液相为酶解体系，使萝卜芽苗微粉自身的黑芥子酶快速酶解其含有的还原型萝卜硫苷，以获得不稳定的中间体，该不稳定的中间体再经分子内重排生成还原型萝卜硫素，还原型萝卜硫素的酶解得率提高至35%以上；正己烷相快速萃取磷酸盐缓冲溶液相中新生成的还原型萝卜硫素，显著降低磷酸盐缓冲溶液相中还原型萝卜硫素浓度，从而显著阻断磷酸盐缓冲溶液相中水分子攻击还原型萝卜硫素分子中的异硫氰酸基团，防止还原型萝卜硫素快速降解，提高酶解体系中还原型萝卜硫素的稳定性，显著提高还原型萝卜硫素的制备得率，所得还原型萝卜硫素提取物中还原型萝卜硫素的含量为25%以上。
本发明的方法不仅可快速高得率的酶解获得还原型萝卜硫素提取物，而且具有高萃取率、高稳定性的特点，显著提高还原型萝卜硫素提取物的总体制备工艺收率，大幅降低还原型萝卜硫素的生产成本，避免了二氯甲烷、氯仿等高毒性有机溶剂的使用，对环境无污染，特别适合工业化生产制备还原型萝卜硫素提取物。
附图说明
图1为本发明的制备工艺流程图。
图2为本发明制得的萝卜芽苗微粉中还原型萝卜硫苷液相色谱图。
图3为本发明实施例1制备的还原型萝卜硫素提取物的气相色谱-质谱图。
图4为本发明实施例2制备的还原型萝卜硫素提取物的气相色谱-质谱图。
图5为本发明实施例3制备的还原型萝卜硫素提取物的气相色谱-质谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的工艺技术方案作进一步的描述。
实施例1
一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，是由以下步骤制得的：
1）取20kg新鲜萝卜芽苗，烘干，得1.31kg干燥萝卜芽苗；将干燥萝卜芽苗粉碎，得萝卜芽苗微粉；
所述步骤1）中，新鲜萝卜芽苗的发芽和生长总时间为10天，培养大棚温度为15℃，湿度为65%。
所述步骤1）中，烘干的温度为40℃；干燥萝卜芽苗的含水量为5%；萝卜芽苗微粉的粒径为550μm。
2）将萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取，加入正己烷，在提取温度15℃和分散盘转速500rpm条件下，分散提取3h；提取完成后静置10h，减压过滤，得微粉；重复分散提取5次，得除杂的萝卜芽苗微粉；
所述步骤2）中，萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：5L。
3）将除杂的萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中，加入正己烷，在温度15℃和分散盘转速50rpm条件下，预分散30min；预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液，酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素180min；反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至2.5，静置1h；充分收集正己烷相，加入无水硫酸钠，在转速为500rpm条件下，脱水处理1h；在温度为30℃条件下，减压蒸馏回收正己烷，得21.6g还原型萝卜硫素提取物，其中，还原型萝卜硫素含量为26.5%，还原型萝卜硫素的酶解得率为35.3%。
所述步骤3）中，除杂的萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：3L；除杂的萝卜芽苗微粉质量：磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg：3L；无水硫酸钠质量：正己烷体积之比为0.15kg：1L；
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02mol/L、pH值为7.0、维生素C含量为0mmoL/L。
实施例2
一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，是由以下步骤制得的：
1）取20kg新鲜萝卜芽苗，烘干，得1.27kg干燥萝卜芽苗；将干燥萝卜芽苗粉碎，得萝卜芽苗微粉；
所述步骤1）中，新鲜萝卜芽苗的发芽和生长总时间为15天，培养大棚温度为35℃，湿度为75%。
所述步骤1）中，烘干的温度为50℃；干燥萝卜芽苗的含水量为3.5%；萝卜芽苗微粉的粒径为350μm。
2）将萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取，加入正己烷，在提取温度55℃和分散盘转速200rpm条件下，分散提取0.5h；提取完成后静置12h，离心，得微粉；重复分散提取1次，得除杂的萝卜芽苗微粉；
所述步骤2）中，萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：30L。
3）将除杂的萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中，加入正己烷，在温度35℃和分散盘转速500rpm条件下，预分散5min；预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液，酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素90min；反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至1.0，静置3h；充分收集正己烷相，加入无水硫酸钠，在转速为300rpm条件下，脱水处理5h；在温度为50℃条件下，减压蒸馏回收正己烷，得20.5g还原型萝卜硫素提取物，其中，还原型萝卜硫素含量为28.6%，还原型萝卜硫素的酶解得率为36.2%。
所述步骤3）中，除杂的萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：25L；除杂的萝卜芽苗微粉质量：磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg：25L；无水硫酸钠质量：正己烷体积之比为0.01kg：1L；
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.2mol/L、pH值为3.0、维生素C含量为1.5mmoL/L。
实施例3
一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，是由以下步骤制得的：
1）取20kg新鲜萝卜芽苗，烘干，得1.30kg干燥萝卜芽苗；将干燥萝卜芽苗粉碎，得萝卜芽苗微粉；
所述步骤1）中，新鲜萝卜芽苗的发芽和生长总时间为7天，培养大棚温度为25℃，湿度为85%。
所述步骤1）中，烘干的温度为60℃；干燥萝卜芽苗的含水量为0.5%；萝卜芽苗微粉的粒径为150μm。
2）将萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取，加入正己烷，在提取温度25℃和分散盘转速50rpm条件下，分散提取2.5h；提取完成后静置8h，减压过滤，得微粉；重复分散提取3次，得除杂的萝卜芽苗微粉；
所述步骤2）中，萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：15L。
3）将除杂的萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中，加入正己烷，在温度20℃和分散盘转速300rpm条件下，预分散20min；预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液，酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素30min；反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至2.0，静置5h；充分收集正己烷相，加入无水硫酸钠，在转速为50rpm条件下，脱水处理4h；在温度为40℃条件下，减压蒸馏回收正己烷，得20.5g还原型萝卜硫素提取物，其中，还原型萝卜硫素含量为28.5%，还原型萝卜硫素的酶解得率为36.1%。
所述步骤3）中，除杂的萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：15L；除杂的萝卜芽苗微粉质量：磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg：15L；无水硫酸钠质量：正己烷体积之比为0.1kg：1L；
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1mol/L、pH值为5.5、维生素C含量为0.5mmoL/L。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，其特征在于，是由以下步骤制得的：
1）取新鲜萝卜芽苗，烘干，得干燥萝卜芽苗；将干燥萝卜芽苗粉碎，得萝卜芽苗微粉；
2）将萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中分散提取，加入正己烷，在提取温度15-55℃和分散盘转速50-500rpm条件下，分散提取0.5-3h；提取完成后静置8-12h，减压过滤或离心，得微粉；重复分散提取1-5次，得除杂的萝卜芽苗微粉；
3）将除杂的萝卜芽苗微粉置于高速剪切分散提取罐中，加入正己烷，在温度15-35℃和分散盘转速50-500rpm条件下，预分散5-30min；预分散完成后加入磷酸盐缓冲溶液，酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素30-180min；反应完成后用5mol/L盐酸调节溶液pH值至1.0-2.5，静置1-5h；充分收集正己烷相，加入无水硫酸钠，在转速为50-500rpm条件下，脱水处理1-5h；在温度为30-50℃条件下，减压蒸馏回收正己烷，得还原型萝卜硫素提取物。
2.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，其特征在于，所述步骤1）中，新鲜萝卜芽苗的发芽和生长总时间为7-15天，培养大棚温度为15-35℃，湿度为65-85%。
3.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，其特征在于，所述步骤1）中，烘干的温度为40-60℃；干燥萝卜芽苗的含水量为0.5-5%；萝卜芽苗微粉的粒径为150-550μm。
4.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，其特征在于，所述步骤2）中，萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：5-30L。
5.根据权利要求1所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，其特征在于，所述步骤3）中，除杂的萝卜芽苗微粉质量：正己烷体积之比为1kg：3-25L；除杂的萝卜芽苗微粉质量：磷酸盐缓冲溶液体积之比为1kg：3-25L；无水硫酸钠质量：正己烷体积之比为0.01-0.15kg：1L。
6.根据权利要求5所述的利用两相体系酶解与萃取偶联制备还原型萝卜硫素提取物的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02-0.2mol/L、pH值为3.0-7.0、维生素C含量为0-1.5mmoL/L。
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| GR01 | Patent grant | ||
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