CN113699192A

CN113699192A - 一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法

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Publication number: CN113699192A
Application number: CN202110964825.5A
Authority: CN
Inventors: 王春国; 李慧; 陈成彬
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2041-08-23
Also published as: CN113699192B

Abstract

本发明涉及一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法。包括以下步骤：青花菜胁迫处理；青花菜组织材料破碎及酶解；青花菜酶解产物中萝卜硫素的萃取；旋转蒸发获得萝卜硫素粗提取物浸膏；制备液相色谱法获得高纯度萝卜硫素。与现有技术相比本发明充分利用青花菜受到逆境胁迫会激发体内硫代葡萄糖苷‑黑芥子酶系统，产生萝卜硫素等硫苷水解产物的特征，通过胁迫诱导及施加高活性外源黑芥子酶的方式大幅度提高原材料中萝卜硫素的含量，并采用单一有机溶剂循环使用，实现对原材料中萝卜硫素的提取。提取方法简单、效率高、环境友好，可直接用于工业化生产。提取的萝卜硫素纯度达90%‑98%，可被广泛用于药品、食品、化妆品等各个领域，具有极高的经济价值。

Description

一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法

技术领域

本发明属于植物天然产物提取技术领域。涉及一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法。通过本发明可以实现高效、快速、环境友好、高质量的从青花菜中对生物活性物质萝卜硫素进行提取。

背景技术

萝卜硫素(Sulforaphane，SFN)是硫代葡萄糖苷水解后的一种小分子异硫氰酸盐，分子式为C₆H₁₁NOS₂，具有C=N=S结构，相对分子质量为177.29。萝卜硫素广泛存在于青花菜、花椰菜、甘蓝、芥菜、卷心菜等十字花科植物，在青花菜中的含量最高。已有大量研究表明萝卜硫素是目前在蔬菜中发现的抗癌活性最强的活性物质之一，在肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤治疗中显出处巨大的应用潜力，也已有研究表明萝卜硫素在抑制、杀灭细菌、真菌等方面具有显著效果，特别是其已被证实可显著抑制幽门螺旋杆菌。采用萝卜硫素治疗幽门螺旋杆菌感染的药物已进入四期临床试验。此外，萝卜硫素被证实在神经系统疾病如自闭症等治疗，预防及肥胖症的治疗中发挥积极疗效。因此，萝卜硫素是一种极具开发及利用价值的天然活性物质。

在植物体内，萝卜硫素由其直接前体萝卜硫苷(glucoraphanin，GRA)，即4-甲基硫氧丁基硫代葡萄糖苷水解产生。萝卜硫苷是脂肪族硫代葡萄糖苷中的一种，在黑芥子酶的催化作用下水解为萝卜硫素。但是在正常生长情况下，包括脂肪族硫代葡萄糖苷在内的硫代葡萄糖苷和黑芥子酶分别稳定存在于植物组织内的不同细胞中，只有当植物组织受到胁迫或破坏时，二者才能接触，水解产生萝卜硫素。但是萝卜硫素只是硫代葡萄糖苷水解产物中的一种，目前已知道的硫代葡萄糖苷水解产物至少有上百种，因此，如何激发植物体水解硫代葡萄糖苷产生萝卜硫素，并从众多水解产物中高效、经济的对萝卜硫素进行提取、制备，是对萝卜硫素进行综合开发与利用首先要解决的关键技术瓶颈。

已报道的萝卜硫素提取方法，主要采用溶剂萃取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析、制备液相色谱、高速逆流色谱及CO₂超临界萃取等方法从硫苷酶解混合物中对萝卜硫素进行富集分离及纯化。其技术特征更多关注的是对原材料酶解产生的萝卜硫素如何进行分离，而对如何最大限度的提高原材料中萝卜硫素的产生量，关注较少。与现有技术相比，本发明综合考虑了影响原材料中萝卜硫素形成所需要的理化因素和对原材料中萝卜硫素进行高效富集分离的影响因素，提供了一种可以从青花菜中对萝卜硫素进行提取的方法。该方法具有如下优势：1.提取材料不受限制，可以是青花菜地上部分叶、茎、花球、花、果荚、种子等任意一种或几种，经过胁迫诱导，可以大幅提高提取用材料中萝卜硫素的产生量；2. 提取所用黑芥子酶由表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母菌株发酵产生，纯度高、活性强，能达到现有技术采用黑芥子酶粗体物所不能达到的酶解效果，进一步大幅提高了原料中萝卜硫素的产生量；3. 提取过程采用控温萃取，降低二氯甲烷的挥发，同时实现二氯甲烷的循环使用，循环使用效率可以达到90%以上，实现最大程度上降低对环境的影响，是真正的绿色提取工艺方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，通过该方法可充分利用青花菜受到逆境胁迫条件下自身会激发硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统，产生萝卜硫素等硫苷水解产物的特征，通过胁迫诱导及施加高活性外源黑芥子酶的方式大幅度提高原材料中萝卜硫素的含量，并采用单一有机溶剂循环使用实现对原材料中萝卜硫素的提取。提取方法简单、效率高、环境友好，可直接用于工业化生产，具有极高的经济价值。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）青花菜植物材料胁迫处理：收集用于提取萝卜硫素的青花菜新鲜地上部分进行盐胁迫和/或机械创伤胁迫和/或紫外照射胁迫，胁迫处理4-6小时。

（2）青花菜组织材料破碎及酶解：将经过胁迫处理的青花菜新鲜地上部分材料采用搅拌机或榨汁机打碎，形成组织匀浆，将匀浆液收集于适当容器中加入2-5倍体积的灭菌蒸馏水，同时按照100份加水组织匀浆液：1份黑芥子酶酵母提取液：0.2份维生素C的比例加入黑芥子酵母提取液及维生素C，混匀，35℃-37℃酶解处理6-12小时，期间不断搅拌。酶解结束后，利用过滤网或筛对酶解处理液进行过滤处理或利用离心机对酶解液进行离心处理，除去酶解处理液中的植物组织碎片，获得澄清的酶解处理液。所述的黑芥子酶酵母提取液指的是表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物，表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌通过克隆青花菜中黑芥子基因、构建基因表达载体，表达载体电转化毕赤酵母细胞相关常规基因工程操作方法获得。

（3）青花菜组织材料酶解产物中萝卜硫素的萃取：将经过过滤或离心处理获得的酶解处理液中加入二氯甲烷进行萃取，萃取4次，每次萃取20 min, 合并萃取液，在萃取液中加入适量的氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙，震荡处理10-30 min。离心或过滤，收集上清。

（4）旋转蒸发获得萝卜硫素粗提取物浸膏：将萃取液置于旋转蒸发瓶中，35℃-40℃旋转蒸发，获得萝卜硫素粗提取物浸膏，回收经冷凝处理收集的二氯甲烷，将其循环用于酶解液的萃取。

（5）制备液相色谱法获得高纯度萝卜硫素：将萝卜硫素提取物浸膏溶于甲醇或乙腈中，按常规方法，采用制备型液相色谱获得高纯度萝卜硫素，纯度可达90%-98%以上。

本发明所述步骤（1）中青花菜新鲜地上部分指的是地上部分的叶、花球、茎、种子、种荚和花蕾中的一种或几种的组合；

本发明所述步骤（1）中对青花菜新鲜地上部分进行盐胁迫处理的盐浓度为0.4%-1%的NaCl溶液，处理方式为将NaCl溶液喷洒在处理材料表面，处理时间为4-6小时；对青花菜新鲜地上部分进行机械创伤胁迫指的是通过机械切割、挤压、剪切等方式对青花菜新鲜地上部分进行有限强度的处理，确保处理的材料不会立刻失去活性，处理时间4-6小时。

本发明所述步骤（2）中黑芥子酶酵母提取液为表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物，该工程菌通过克隆青花菜中黑芥子基因、构建基因表达载体，表达载体电转化毕赤酵母细胞相关常规基因工程操作方法获得，对获得的表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌进行液体培养，即可获得含有黑芥子酶的培养产物，其活性是通过芥菜或青花菜种子或幼苗中制备的黑芥子酶粗提物活性的上百倍

本发明所述步骤（3）中在萃取液中加入适量的氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙的质量比例为1：0.78：0.5。

本发明所述步骤（3）中将经过过滤或离心处理获得的酶解处理液中加入二氯甲烷进行萃取，萃取温度为20℃-30℃。

本发明所述步骤（4）中回收经冷凝处理收集的二氯甲烷，回收效率在90%以上，回收后的二氯甲烷可循环用于酶解液的萃取。

本发明所述一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，同样适用于花椰菜、芥菜、甘蓝、卷心菜等含有硫代葡糖苷代谢途径的十字花科植物中萝卜硫素的高效提取。

本发明中用到的维生素C、氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙、二氯甲烷等试剂均可从市场购得。

本发明提供一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法。包括青花菜胁迫处理；青花菜组织材料破碎及酶解；青花菜组织材料酶解产物中萝卜硫素的萃取；旋转蒸发获得萝卜硫素粗提取物浸膏；制备液相色谱法获得高纯度萝卜硫素。本发明对青花菜中萝卜硫素进行提取，采用的是新鲜植物地上部分包括叶、花球、茎、种子、种荚和花蕾中的一种或几种的组合，进一步扩大了提取所用材料的来源。此外，采用新鲜地上部分，并对其进行盐胁迫和/或机械创伤胁迫和/或紫外照射胁迫处理，可以激发植物体内的硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系统，动员更多的硫代葡糖糖苷进行水解产生萝卜硫素等水解产物。在充分发挥植物组织内黑芥子酶活性同时，本发明在酶解过程中添加源于表达青花菜黑芥子酶基因酵母工程菌培养发酵产生的高活性、高纯度黑芥子酶，进一步提高了由硫代葡萄糖苷水解产生萝卜硫素的效率。本发明对通过胁迫诱导及施加高活性外源黑芥子酶处理的青花菜地上部分酶解产物，采用单一有机溶剂萃取，并实现对有机萃取剂的循环使用，循环使用率高达90%以上，实现最大程度上降低对环境的影响，是真正的绿色提取工艺方法。

本发明主要解决了青花菜材料中萝卜硫素含量低，提取效率低，环境不友好等制约萝卜硫素规模化提取的技术难题，重点关注了如何提高青花菜材料中萝卜硫素的产生量和环境有好式提取策略，主要的难点在于攻克青花菜体内萝卜硫素产生率低，提取过程环境不友好对萝卜硫素大规模提取的制约。

本发明公开的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明公开的提取材料不受限制，可以是青花菜地上部分叶、茎、花球、花、果荚、种子等任意一种或几种，经过胁迫诱导，可以大幅提高提取用材料中萝卜硫素的产生量，其是提高萝卜硫素提取效率的重要物质基础。

（2）本发明公开的提取所用黑芥子酶由表达青花菜黑芥子酶基因的酵母菌株发酵产生，纯度高、活性强，能达到现有技术采用黑芥子酶粗体物所不能达到的酶解效果，进一步大幅提高了原料中萝卜硫素的产生量，萝卜硫素纯度可达90%-98%。

（3）本发明公开的提取过程采用控温萃取，降低二氯甲烷的挥发，同时实现二氯甲烷的循环使用，循环使用效率可以达到90%以上，实现最大程度上降低对环境的影响，是真正的绿色提取工艺方法。

附图说明

图1为采用制备型液相色谱获得萝卜硫素的检测结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

黑芥子酶酵母提取液制备：

从NCBI中下载青花菜黑芥子酶基因编码序列（基因序列号：XM_013764720.1）,利用Primer Premier 5软件，根据上述基因序列设计扩增编码区全长且带有EcoR I和NotⅠ酶切位点的引物对XM_013764720.1-F:

5’CTGAAGCTTACGTAGAATTCATGAAGCTTCTTCATGGACTCGC3’（下划线显示EcoR I酶切位点）和XM_013764720.1-R:

5’TAATTCGCGGCCGCCCTAGCGGCCGCTCATGCATCAGCGAGCCTCTT3’（下划线显示NotⅠ酶切位点），上述引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；采用植物RNA提取试剂盒（购于大连宝生物生物工程有限公司），从青花菜幼苗中提取RNA,采用M-MLV反转录酶（SIGMA公司），以RNA为模板反转录合成cDNA，具体操作参照说明书要求；以合成的cDNA为模板采用RT-PCR方法扩增获得青花菜黑芥子酶基因编码序列；将扩增产物连接到 TA克隆载体上（购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司），具体操作参照说明书，随后采用热激法将TA克隆载体转入大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α感受态细胞（购于大连宝生物生物工程有限公司）；用 EcoR I、NotⅠ对连接在 TA 载体上的青花菜黑芥子酶基因和pPIC9K载体分别进行酶切（pPIC9K载体购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；凝胶电泳后，回收长度约 1600bp 左右的青花菜黑芥子酶基因基因片段和9000 bp的载体片段；利用T4连接酶（购于大连宝生物生物工程有限公司）对回收片段进行连接，具体过程参照T4连接酶使用说明书；连接产物采用电激法转入大肠杆菌JM109感受态细胞（购于北京鼎国生物技术有限公司）；挑取单一阳性克隆进行扩大培养，随后采用质粒提取试剂盒（购于北京擎科生物科技公司）进行重组质粒提取，用Sac I线性化处理重组质粒，电击法将重组质粒转入受体酵母菌GS115（购于北京擎科生物科技公司），取100-200µL转化菌液涂布在MD培养平板上，30℃温箱培养2-3d；挑取MD平板上的酵母单菌落溶于MD液体培养基中摇床培养6-8h至菌液浑浊；取 3µL 于 0.03moL/L 的NaOH中，轻轻混匀，放于100℃处理 15 min左右以裂解酵母细胞释放DNA；以此作为模板利用组合引物（5AOX-F:5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’和3AOX -R: 5’GGCAAATGGCATTCTGACAT 3’进行PCR鉴定，上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鉴定成功的阳性菌液用80%甘油保存；取保存的上述酵母菌株在YPD培养基上划线，待长出克隆后，挑单克隆加入到20mL BMGY 液体培养液中，30℃，230rpm 摇床培养至菌液变浑；取浑浊的菌液接种到50mL BMGY培养液中，30℃，230rpm 摇床培养24h；将菌液转移至50ml离心管中，3000rpm离心5min，收集菌体；用BMMY培养液重悬细胞，30℃，230rpm 摇床培养；培养液中加入2%甲醇进行黑芥子酶诱导表达培养；连续培养72h，6000rpm 离心 5 min，收集发酵上清液，该上清液即为黑芥子酶酵母提取液。

主要培养基配制如下：

MD培养基

按照上述比例分别加入母液，115℃灭菌15 min后4℃备用。

YPD培养基

将以上成分于蒸馏水中完全溶解，115℃灭菌15 min后4℃备用。

BMGY培养基

将上述比例对应质量的酵母抽提物、蛋白胨及甘油加入一部分蒸馏水后121℃高温高压灭菌20 min，冷至室温后加入剩余成分对应的母液，4℃保存。

BMMY培养基

将上述比例对应质量的酵母抽提物、蛋白胨加入一部分蒸馏水后121℃高温高压灭菌20 min，冷至室温后加入剩余成分对应的母液，4℃保存。

实施例2

收集用于提取萝卜硫素的青花菜的新鲜地上部分，包括叶、花球、茎、种子、种荚和花蕾中的一种或几种的组合，对收集的新鲜地上部分采用0.4%的NaCl盐溶液进行处理，处理方式为采用喷雾装置对收集的新鲜地上部分进行喷洒处理，确保材料表面被盐溶液覆盖，处理时间为5小时。

将经过胁迫处理的青花菜的新鲜地上部分材料采用搅拌机或榨汁机打碎，形成组织匀浆，将匀浆液收集于适当容器中加入2-5倍体积的灭菌蒸馏水，同时按照100份加水组织匀浆液：1份黑芥子酶酵母提取液，该提取液为表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物，该工程菌通过克隆青花菜中黑芥子基因、构建基因表达载体，表达载体电转化毕赤酵母细胞相关常规基因工程操作方法获得：0.2份维生素C的比例加入黑芥子酵母提取液及维生素C，混匀， 37℃酶解处理10小时，期间不断搅拌。酶解结束后，利用过滤网或筛对酶解处理液进行过滤处理或利用离心机对酶解液进行离心处理，除去酶解处理液中的植物组织碎片，获得澄清的酶解处理液。这其中加入维生素C的目的是提高黑芥子酶的活性。黑芥子酶酵母提取液为表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物，该工程菌通过克隆青花菜中黑芥子基因、构建基因表达载体，表达载体电转化毕赤酵母细胞相关常规基因工程操作方法获得，对获得的表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌进行液体培养，即可获得含有黑芥子酶的培养产物，其活性是通过芥菜或青花菜种子或幼苗中制备的黑芥子酶粗提取物活性的上百倍。

将经过过滤或离心处理获得的酶解处理液中加入等体积的二氯甲烷进行萃取，萃取温度为25℃，萃取4次，每次萃取20 min, 合并萃取液，在萃取液中加入适量的氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙，震荡处理20 min。离心或过滤，收集上清。氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙的质量比例为1：0.78：0.5。

将萃取液置于旋转蒸发瓶中，40℃旋转蒸发，获得萝卜硫素粗提取物浸膏，回收经冷凝处理收集的二氯甲烷，回收效率在90%以上，将回收后的二氯甲烷循环用于酶解液的萃取。

将萝卜硫素提取物浸膏溶于甲醇或乙腈中，按常规方法，采用制备型液相色谱获得高纯度萝卜硫素（图1）萝卜硫素纯度为92%。

实施例3

收集用于提取萝卜硫素的青花菜的新鲜地上部分，包括叶、花球、茎、种子、种荚和花蕾中的一种或几种的组合，对收集的新鲜地上部分利用剪刀、铡刀及搅拌机器、压力机等进行有限强度的机械创伤胁迫，处理时间4小时。

将经过胁迫处理的青花菜新鲜地上部分材料进一步采用搅拌机或榨汁机或匀浆机打碎，形成组织匀浆，将匀浆液收集于适当容器中加入2-5倍体积的灭菌蒸馏水，同时按照100份加水组织匀浆液：1份黑芥子酶酵母提取液：0.2份维生素C的比例加入黑芥子酵母提取液及维生素C，混匀， 33℃酶解处理12小时，期间不断搅拌。酶解结束后，利用离心机对酶解液进行离心处理，除去酶解处理液中的植物组织碎片，获得澄清的酶解处理液。这其中加入维生素C的目的是提高黑芥子酶的活性。黑芥子酶酵母提取液为表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物，其活性是通过芥菜或青花菜种子或幼苗中制备的黑芥子酶粗提取物活性的上百倍。

将经过过滤或离心处理获得的酶解处理液中加入0.6体积的二氯甲烷进行萃取，萃取温度为25℃，萃取4次，每次萃取20 min, 合并萃取液，在萃取液中加入适量的氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙，震荡处理20 min。离心或过滤，收集上清。氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙的质量比例为1：0.78：0.5。

将萃取液置于旋转蒸发瓶中，37℃旋转蒸发，获得萝卜硫素粗提取物浸膏，回收经冷凝处理收集的二氯甲烷，回收效率在90%以上，将回收后的二氯甲烷循环用于酶解液的萃取。

将萝卜硫素提取物浸膏溶于甲醇或乙腈中，按常规方法，采用制备型液相色谱获得高纯度萝卜硫素萝卜硫素纯度为98%。

Claims

1.一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）青花菜材料胁迫处理：收集用于提取萝卜硫素的青花菜的新鲜地上部分进行盐胁迫和/或机械创伤胁迫和/或紫外照射胁迫，胁迫处理4-6小时;

（2）青花菜组织材料破碎及酶解：将经过胁迫处理的青花菜新鲜地上部分材料采用搅拌机或榨汁机打碎，形成组织匀浆，将匀浆液收集于适当容器中加入2-5倍体积的灭菌蒸馏水，同时按照100份加水组织匀浆液：1份黑芥子酶酵母提取液：0.2份维生素C的比例加入黑芥子酵母提取液及维生素C，混匀，35℃-37℃酶解处理6-12小时，期间不断搅拌，酶解结束后，利用过滤网或筛对酶解处理液进行过滤处理或利用离心机对酶解液进行离心处理，除去酶解处理液中的植物组织碎片，获得澄清的酶解处理液；所述的黑芥子酶酵母提取液指的是表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物；

（3）青花菜组织材料酶解产物中萝卜硫素的萃取：将经过过滤或离心处理获得的酶解处理液中加入二氯甲烷进行萃取，萃取4次，每次萃取20 min, 合并萃取液，在萃取液中加入氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙，震荡处理10-30 min，离心或过滤，收集上清；所述的氯化钠、无水硫酸钠、无水碳酸钙的质量比例为1：0.78：0.5；

（4）旋转蒸发获得萝卜硫素粗提取物浸膏：将萃取液置于旋转蒸发瓶中，35℃-40℃旋转蒸发，获得萝卜硫素粗提取物浸膏，回收经冷凝处理收集的二氯甲烷，将其循环用于酶解液的萃取；

（5）制备液相色谱法获得高纯度萝卜硫素：将萝卜硫素提取物浸膏溶于甲醇或乙腈中，按常规方法，采用制备型液相色谱获得高纯度萝卜硫素。

2.权利要求1所述的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤（1）中青花菜新鲜地上部分指的是地上部分的叶、花球、茎、种子、种荚和花蕾中的一种或几种的组合。

3.权利要求1所述的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤（1）中对青花菜新鲜地上部分进行盐胁迫处理的盐浓度为0.4%-1%的NaCl溶液，处理方式为将NaCl溶液喷洒在处理材料的表面，处理时间为4-6小时；对青花菜新鲜地上部分进行机械创伤胁迫指的是通过机械切割、挤压、剪切方式对青花菜的新鲜地上部分进行有限强度的处理，确保处理的材料不会立刻失去活性，处理时间4-6小时。

4.权利要求1所述的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤（2）中黑芥子酶酵母提取液为表达青花菜黑芥子酶基因的毕赤酵母工程菌经过培养形成的产物，其活性是通过芥菜或青花菜种子或幼苗中制备的黑芥子酶粗提取物活性的上百倍。

5.权利要求1所述的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤（3）中将经过过滤或离心处理获得的酶解处理液中加入二氯甲烷进行萃取，萃取温度为20℃-30℃。

6.权利要求1所述的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤（4）中回收经冷凝处理收集的二氯甲烷，回收效率在90%以上，回收后的二氯甲烷可循环用于酶解液的萃取。

7.权利要求1所述的一种从青花菜中提取萝卜硫素的方法在制备不同纯度萝卜硫素中的应用。