CN106928314A - 一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，具体步骤包括闪提、闪提后的粗提液离心、对离心后的上清进行干燥获得天然多肽，对离心后的沉淀进行蚯蚓水解多肽提取，实现了蚯蚓资源的利用。该方法生产效率高，并在提取过程中大大缩短了提取时间，降低了生产成本，适用于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物活性成分的提取分离技术领域，具体涉及一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法。
背景技术
蚯蚓（earthworm）在传统医药中具有解热、活络、平喘、抗癌等多种药理作用，目前已从蚯蚓中分离得到了纤溶酶、抗肿瘤活性蛋白质、抗菌肽等多种具有生物药理作用的活性蛋白质，并将其应用到溶血、凝血、抗肿瘤、抗菌等治疗中。蚯蚓体内富含蛋白质，以干蚯蚓计算高达56%-66%，其中包括了抗氧化酶为代表的活性蛋白质以及各种多肽。
蚯蚓多肽是蚯蚓体内小分子多肽的总称，种类繁多，生物功能复杂多样。天然多肽，即蚯蚓未经诱导天然存在的多肽，我们发现蚯蚓含大量天然多肽，并形成规模化生产。实验证明，对风湿性关节炎及其引起的疼痛、变态反应性疾病，如过敏性鼻炎、阳痿等症有特效。水解多肽为机体合成代谢提供必需的氨基酸，以维持体内氮的平衡。用于营养不良、因蛋白质消化吸收不良或过度消耗所致蛋白质缺乏、严重胃肠炎及烫伤或外科手术后的蛋白质补充等。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提出一种从蚯蚓中联合提取蚯蚓多肽的方法，该方法以蚯蚓为原料，对其进行综合利用，从中提取出天然多肽和水解多肽，该方法实现了蚯蚓原材料的综合利用，具有提取时间短、提取率高、适用于工业化生产的特点。采用闪式提取技术（简称闪提）能够在室温及溶剂存在下数秒钟内把蚯蚓组织破碎至细微颗粒，使组织内的有效成分迅速溶出，极大地提高了提取效率。
本发明提出的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，具体包括以下步骤：
第一步：材料预处理：
称量冷冻蚯蚓冻品，剪刀绞碎，按照料液比为1:4g/ml加入体积分数为66%的乙醇溶液；
第二步：破碎后的蚯蚓进行闪提，得到蚯蚓粗提液；
第三步：将粗提液离心；
将闪提后的粗提液进行离心，天然多肽存在于上清液A中；
第四步：上清液A中提取天然多肽；
第五步：沉淀A中提取水解多肽。
2、根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：第一步中所述的蚯蚓为-20℃冷冻保存的蚯蚓，料液比为1:4g/ml，液体为体积分数为66%的乙醇溶液。
3、根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的第二步采用的闪提，按照闪提时间1min，闪提转速3500~4000rpm的条件进行提取，得到蚯蚓粗提液。
4、根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的第三步中离心的条件为转速为5000rpm，离心15min。
5、根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：第四步具体包括如下步骤：
步骤4.1：上清液A加入活性炭吸附；
步骤4.2：抽滤分离活性炭与上清A；
步骤4.3：浓缩上清液A，得到浓缩液；
步骤4.4：真空干燥，得到蚯蚓天然多肽。
6、根据权利要求5所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的活性炭吸附具体为：上清A中加入活性炭，在磁力搅拌器上搅拌2h。
7、根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的第五步具体包括如下步骤：
将第三步中对粗提液离心得到的沉淀A中加入纯水，按照初始样品质量0.24%加入木瓜蛋白酶，调节pH 5.5，在50℃下磁力搅拌2h；完成后，将反应液煮沸并保持沸腾3min；然后离心，转速5000rpm，时间15min，蚯蚓水解多肽存在于离心后的上清液C中，真空干燥得到蚯蚓水解多肽。
本发明具有的优点在于：
1、本发明提出一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，通过闪式提取仪提取蚯蚓有效成分，与传统的方法相比，该方法提取条件温和，提取时间短，仅1-3分钟，溶剂用量少，提取效率高。
2、本发明提出的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，在闪式提取条件的优化中，采用了正交试验设计的方法，优化了实验条件，提高了提取率。
3、本发明提出的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，实现了蚯蚓活性成分和水解多肽的联合提取工艺，通过酶解实验残渣得到水解多肽，实现了蚯蚓的充分利用。
附图说明
图 1：本发明提出的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明。
本发明提供一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，所述的多种活性成分包括活性蛋白质、天然多肽和水解多肽，如图1所示，具体方法步骤如下：
第一步：材料预处理：
称量冷冻蚯蚓冻品，剪刀绞碎，按照料液比为1:4g/ml加入体积分数为66%的乙醇溶液；
第二步：破碎后的蚯蚓进行闪提；
按照闪提时间30s，闪提转速3500~4000rpm的条件进行提取，得到蚯蚓粗提液。
第三步：将粗提液离心：
将闪提后的粗提液进行离心，转速为5000rpm，离心15min；天然多肽存在于上清液A中，活性蛋白质等存在于沉淀A中；
对于所述的上清液Ａ，转第四步进行天然多肽提取；对于所述的沉淀A，转第五步进行水解多肽提取。
第四步：上清液Ａ中提取天然多肽，具体步骤如下：
步骤4.1：上清液A加入活性炭吸附；
上清A中加入活性炭，在磁力搅拌器上搅拌2h。
步骤4.2：抽滤分离活性炭与上清A；
步骤4.3：浓缩上清液A，得到浓缩液；
步骤4.4：真空干燥，得到蚯蚓天然多肽。
第五步：沉淀A中提取水解多肽。具体包括如下步骤：
将第三步中对粗提液离心得到的沉淀A中加入纯水，按照初始样品质量0.24%加入木瓜蛋白酶，调节pH 5.5，在50℃下磁力搅拌2h；完成后，将反应液煮沸并保持沸腾3min；然后离心，转速5000rpm，时间15min，蚯蚓水解多肽存在于离心后的上清液C中，真空干燥得到蚯蚓水解多肽。
利用本发明提出的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法所得到的天然多肽粉末提取率为3.29%，其中多肽含量2.54%；获得的蚯蚓水解多肽粉末提取率为5.83%，其中多肽含量29.83%。
实施例1：
一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，具体包括以下步骤：
第一步：材料预处理。
称量-20℃冷冻蚯蚓冻品60.25g（含水量84.3%，固形物9.46g），剪刀绞碎，按照料液比为1:4g/ml加入体积分数为66%的乙醇溶液241ml。
第二步：绞碎后的蚯蚓进行闪提。
按照闪提时间30s，闪提转速3500~4000rpm的条件进行提取，得到蚯蚓粗提液。
第三步：将粗提液离心。
将闪提后的粗提液进行离心，使用常温离心机，转速为5000rpm，离心15min，天然多肽存在于上清液A中，活性蛋白质等存在于沉淀A中。
第四步：活性炭吸附：上清A中加入液体量2.5%的活性炭，在磁力搅拌器上搅拌2h。
第五步：抽滤分离活性炭与上清A。
第六步：浓缩。
抽滤后的上清液Ａ体积较大，需要进行浓缩。将上清液Ａ放在圆底烧瓶中，利用旋转蒸发器进行蒸发浓缩，直到体积约为20ml。
第六步：真空干燥。
将浓缩后的液体转入玻璃皿中，放入正空干燥机中干燥3h，温度60℃。得到天然多肽粉末1.98g，其中蛋白含量2.54%。
实施例2：
一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，具体包括以下步骤：
第一步：材料预处理。
称量-20℃冷冻蚯蚓冻品60.00g（含水量84.3%，固形物9.42g），剪刀绞碎，按照料液比为1:4g/ml加入体积分数为66%的乙醇溶液240ml。
第二步：绞碎后的蚯蚓进行闪提。
按照闪提时间30s，闪提转速3500~4000rpm的条件进行提取，得到蚯蚓粗提液。
第三步：将粗提液离心。
将闪提后的粗提液进行离心，使用常温离心机，转速为5000rpm，离心15min，天然多肽存在于上清液A中，蚯蚓多肽提取自沉淀A中。
第四步：酶解。
向沉淀A中按照样品量料液比为1:4g/ml加入pH 5.5的水溶液240ml，混匀后加入按照样品量0.24%的木瓜蛋白酶，在50摄氏度下磁力搅拌2小时。搅拌过程中要不断地调节pH，控制pH在5.5-6之间。
第五步：高温煮沸。
酶解完成后，快速加热将反应液煮沸并保持沸腾3min。
第六步：离心。
将煮沸过后的酶解液冷却后倒入离心容器，配平后使用低速离心机离心，离心的条件是5000r/min，时间为15min。
第七步：真空干燥。
离心完成后，取上清液，测量上清液体积265ml，倒入培养皿中，放入真空干燥机，温度设定为80摄氏度，待水分完全被干燥，得到水解多肽3.50g，其中多肽含量29.38%。
Claims (7)
1.一种从蚯蚓中提取蚯蚓活多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：材料预处理：
称量冷冻蚯蚓冻品，剪刀绞碎，按照料液比为1:4g/ml加入体积分数为66%的乙醇溶液；
第二步：破碎后的蚯蚓进行闪提，得到蚯蚓粗提液；
第三步：将粗提液离心；
将闪提后的粗提液进行离心，天然多肽存在于上清液A中；
第四步：上清液A中提取天然多肽；
第五步：沉淀A中提取水解多肽。
2.根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：第一步中所述的蚯蚓为-20℃冷冻保存的蚯蚓，料液比为1:4g/ml，液体为体积分数为66%的乙醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的第二步采用的闪提，按照闪提时间1min，闪提转速3500~4000rpm的条件进行提取，得到蚯蚓粗提液。
4.根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的第三步中离心的条件为转速为5000rpm，离心15min。
5.根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：第四步具体包括如下步骤：
步骤4.1：上清液A加入活性炭吸附；
步骤4.2：抽滤分离活性炭与上清A；
步骤4.3：浓缩上清液A，得到浓缩液；
步骤4.4：真空干燥，得到蚯蚓天然多肽。
6.根据权利要求5所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的活性炭吸附具体为：上清A中加入活性炭，在磁力搅拌器上搅拌2h。
7.根据权利要求1所述的一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法，其特征在于：所述的第五步具体包括如下步骤：
将第三步中对粗提液离心得到的沉淀A中加入纯水，按照初始样品质量0.24%加入木瓜蛋白酶，调节pH 5.5，在50℃下磁力搅拌2h；完成后，将反应液煮沸并保持沸腾3min；然后离心，转速5000rpm，时间15min，蚯蚓水解多肽存在于离心后的上清液C中，真空干燥得到蚯蚓水解多肽。
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| CN201511004055.0A Pending CN106928314A (zh) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | 一种从蚯蚓中提取蚯蚓多肽的方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN106928314A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110250208A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-09-20 | 冯良山 | 一种植物免疫力增强剂及其制备方法 |
| CN110684629A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-14 | 江西沐恩堂生物科技有限公司 | 一种地龙保健酒及其制备方法 |
| CN112430532A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-03-02 | 唐山市蚓领生物科技有限公司 | 一种应用二氧化碳厌氧环境发酵制取蚯蚓原液的方法及系统 |
| CN115976143A (zh) * | 2023-02-01 | 2023-04-18 | 海南华研胶原科技股份有限公司 | 一种地龙肽及其制备方法 |
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-
2015
- 2015-12-29 CN CN201511004055.0A patent/CN106928314A/zh active Pending
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