CN112175098A - 一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其包括如下步骤：1)将绣球菌菌柄切块；2)加入提取液，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；3)将绣球菌匀浆液进行微波提取；4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心得上清液、提取液为聚乙二醇200与氯化钾溶于水的混合溶液；5)调节上清液pH值，使pH值等于绣球菌蛋白的等电点，然后进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜，将悬浮液离心除去蛋白；6)取上清液进行醇沉，离心干燥后得到绣球菌多糖。本发明方法去除蛋白更绿色安全，并能提高绣球菌多糖提取率。
Description
技术领域
本发明涉及绣球菌加工领域，具体涉及一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法。
背景技术
绣球菌(Sparassis crispa)是非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属，又称绣球蕈。子实体中等至大形，有肉质，由一个粗壮的柄基上发出许多的分支，枝端会形成一个由许多曲折的瓣片形成的巨大绣球，孢子无色、光滑、卵圆形至球形。绣球菌是一种珍稀名贵的药食兼用的食用菌，香脆可口，回味无穷，似茴香味，营养特别丰富，在日本和欧美一些国家特别畅销，价格昂贵。绣球菌不仅营养十分丰富，而且具有广泛的药理活性。其中主要的活性物质为绣球菌多糖，尤以绣球菌β-葡聚糖含量最高。天然的β-葡聚糖主要有2种存在形式：一种是β-(1→3)-葡聚糖，另一种是β-(1→6)-葡聚糖。其中β-(1→3)-葡聚糖具有广泛的生物学活性，存在的结构形式为β-(1→3)糖苷键链接的线性主链并带有β-(1→6)糖苷键链接的分支结构。目前对β-(1→3)-葡聚糖生物活性研究和应用较多，包括免疫药理学活性、造血功能等，广泛应用于化妆品、保健品等领域。
中国专利文献CN104448014A公开了一种绣球菌碱溶多糖的提取方法，包括以下步骤：(1)碱溶粗多糖提取：将绣球菌子实体粉末经加水溶胀过夜、水浴提取3次每次2h后离心，所得残渣经细胞破碎仪破壁10min、0.1mol/mL氢氧化钠提取3次每次2h后再次离心，合并上清液，用0.1mol/mL盐酸中和后浓缩至10mL，将浓缩液用3倍体积无水乙醇进行醇沉过夜离心，向沉淀中添加无水乙醇、乙醚进行洗涤，离心后将沉淀进行干燥，即得碱溶粗多糖；(2)碱溶粗多糖纯化：精确称量碱溶粗多糖，用蒸馏水配制成5％糖液，加入10％三氯乙酸调节其pH值至3，静置过夜，以5000r/min离心10min，在上清液中加入4倍体积的95％乙醇再静置过夜，离心，向沉淀中添加无水乙醇、乙醚洗涤，洗涤过后于真空干燥器中干燥，即得去蛋白碱溶多糖。该发明采用碱提取法，主要提取在碱液中含有较高提取率的多糖。
中国专利文献CN104958314A公开了一种具有神经保护作用的绣球菌SC031多糖提取物的制备方法，其由以下步骤制备：将绣球菌SC031经发酵罐得到发酵液，以4000-5000转/分钟离心5-10分钟，弃上清，沉淀冻干，得到绣球菌伞菌粉，菌粉按照100倍量80℃热水提取2次，每次3小时，过滤并回收提取液并浓缩至室温相对密度为1.15-1.20，真空干燥，即得绣球菌多糖提取物。该发明采用冻溶法，采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂，从而使细胞内活性物质的溶出。
中国专利文献CN106188333A公开了一种绣球菌多糖的提取方法，包括以下步骤：(1)原料预处理：将绣球菌干燥为水分百分含量为10～11％，将绣球菌进行超微粉为粒径为5～10μm的超微粉；(2)超声波热水提取：向绣球菌超微中加入10～15倍质量份的水，在40～65℃下，进行超声波萃取30～40min，离心固液分离，得绣球菌提取液；(3)膜分离纯化多糖：将提取液通过超滤膜，收集分子量在8KDa～100KDa的产品即得绣球菌多糖。该发明采用超声波热水提取法，利用超声波的机械效应、空化效应、热效应，可加速绣球菌细胞的劈裂，增大介质分子的的运动速度和穿透力，使得活性物质快速溶出，从而提高提取率。
中国专利文献CN110606899A公开了一种绣球菌多糖酶解提取的方法，该方法包括以下步骤：1)原料脱脂预处理：取适量干燥的绣球菌，将其粉碎至300目；将粉末置于5倍体积的80～100％乙醇溶液(v/w)中浸泡；将浸泡液进行蒸馏冷凝回流、过滤得到残渣，并将残渣置于阴凉处风干；2)热水酶解浸提：在步骤1得到的残渣中加入1～15％的酶(w/w)、20～60倍体积的蒸馏水(v/w)并搅拌均匀得到混合液，将混合液在20～60℃温度下静置2～10h进行酶解，将酶解液离心处理使固液分离，将固体残渣过滤得到滤液；重复浸提2-3次，并将上述滤液合并得到绣球菌提取液；3)乙醇沉淀离心：将步骤2中得到的绣球菌提取液浓缩、灭活、冷却；加入5倍体积的95％乙醇溶液，搅拌均匀，置于-4℃温度下沉淀8～12h，离心处理后，弃上清液，收集沉淀；4)真空冷冻干燥：将步骤3中收集到的沉淀在真空环境下冻干，得到绣球菌粗多糖。其中步骤2)中的酶包括淀粉酶、果胶酶、糖化酶及木瓜蛋白酶中的一种或多种。该发明是将绣球菌经乙醇提取脱脂后，再经水酶解浸提、乙醇沉淀、真空冻干得到绣球菌粗多糖。
申请人在中国专利文献CN111040046A公开了一种绣球菌多糖的高效制备方法，包括如下步骤：S1.绣球菌预处理：绣球菌子实体干燥，粉碎备用；S2.取预处理后的绣球菌粉末，加入二甲基亚砜水溶液，置于双极性方波高压脉冲电场中提取，其中脉冲电场强度为10-50Kv/cm,频率为200-1000Hz,收集提取液；S3.将提取液进行微波提取，微波功率为300-500W,提取温度为100-120℃；S4.将微波提取后的提取液进行离心，上清液减压浓缩后，用无水乙醇醇沉得粗多糖沉淀；粗多糖沉淀用有机溶剂洗涤，干燥，即得绣球菌多糖。该发明采用高压脉冲电场与微波提取相结合，以二甲基亚砜溶液为提取溶剂能够高效提取绣球菌多糖，提高绣球菌多糖的提取率和纯度。
在绣球菌中作为商品出售的是子实体，菌柄作为绣球菌生产的副产物约占绣球菌整个子实体的三分之一，一般作为农业废弃物处理。但是研究发现绣球菌菌柄中含有大量的多糖类物质。一方面，现有的多糖提取方法一般都是把样品干燥成粉进行提取，用水为提取溶剂，除了本申请人曾用二甲基亚砜溶液为提取溶剂外，然后采用浸提，超声、酶法等方法进行提取，采用乙醇进行沉淀。在去除蛋白上，采用蛋白酶或Sevag法除蛋白。另一方面，大都针对的是绣球菌子实体，而不是从绣球菌菌柄中提取。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，该方法去除蛋白更绿色安全，并能提高绣球菌多糖提取率。
所采用的技术方案为：
一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，包括如下步骤：
1)将绣球菌菌柄切块；
2)加入提取液，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；
3)将绣球菌匀浆液进行微波提取；
4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心得上清液、提取液为聚乙二醇200与氯化钾溶于水的混合溶液；并将该混合溶液称为聚乙二醇200-氯化钾溶液；
5)调节上清液pH值，使pH值等于绣球菌蛋白的等电点，然后进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜，将悬浮液离心除去蛋白；
6)取上清液进行醇沉，离心干燥后得到绣球菌多糖。
进一步地，步骤2)中，提取液中的聚乙二醇200的质量浓度为4％-6％，氯化钾的质量浓度为1-3％。
进一步地，步骤3)中，微波提取的微波功率300-500W,提取温度80-120℃，时间3-10分钟。
进一步地，步骤4)中，提取液离心的转速为8000转/分，离心15分钟。
进一步地，步骤5)中，上清液调节pH值3.8，磁力搅拌2小时，4℃静置过夜，提取液离心的转速为5000转/分，离心15分钟，除去绣球菌蛋白。
进一步地，步骤5)中，用盐酸溶液调节pH值3.8。
进一步地，步骤6)中，离心的转速为5000转/分，离心15分钟，干燥的方法为冷冻干燥。
进一步地，步骤1)中，绣球菌菌柄来自农业废弃物绣球菌菌柄。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现如下：
1)提取液中的聚乙二醇200在高温高压下安全稳定，有助于穿透细胞膜，提高多糖的提取率；氯化钾中的钾离子和氯离子能够促进微波加热和能量的传递，提高多糖的提取率。
2)采用等电点的方法去蛋白比Sevag方法更绿色，更安全。
具体实施方式
以下通过实施例和对比例形式对本发明的上述内容再做进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的保护范围。
实施例1
一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，包括如下步骤：
1)将农业废弃物绣球菌菌柄250g切块；
2)加入聚乙二醇200-氯化钾溶液500ml，其中聚乙二醇200质量浓度为5％，氯化钾质量浓度为1％，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；
3)将绣球菌匀浆液进行微波提取，微波功率为300W,提取温度为80℃，时间为3min；
4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心，离心转速为8000rpm,离心时间为15min，得上清液；
5)用HCl调节上清液pH＝3.8，进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜后，将悬浮液离心，离心转速为5000rpm,离心时间为15min，除去蛋白；
6)取上清液进行醇沉，5000转/分转速离心15min,冷冻干燥后得到绣球菌多糖3.69克。
实施例2
一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，包括如下步骤：
1)将农业废弃物绣球菌菌柄250g切块；
2)加入聚乙二醇200-氯化钾溶液500ml，其中聚乙二醇200质量浓度为5％，氯化钾质量浓度为1％，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；
3)将绣球菌匀浆液进行微波提取，微波功率为400W,提取温度为100℃，时间为5min；
4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心，离心转速为8000rpm，时间为15min，得上清液；
5)用HCl调节上清液pH＝3.8，进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜后，将悬浮液离心，离心转速为5000rpm,时间为15min，除去蛋白；
6)取上清液进行醇沉，5000转/分转速离心15min,冷冻干燥后得到绣球菌多糖4.18克。
实施例3
一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，包括如下步骤：
1)将鲜绣球菌菌柄250g切块；
2)加入聚乙二醇200-氯化钾溶液1000ml，其中聚乙二醇200质量浓度为5％，氯化钾质量浓度为1％，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；
3)将绣球菌匀浆液进行微波提取，微波功率为400W,提取温度为120℃，时间为7min；
4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心，离心转速为8000rpm,时间为15min，得上清液；
5)用HCl调节上清液pH＝3.8，进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜后，将悬浮液离心，离心转速为5000rpm,时间为15min，除去蛋白；
6)取上清液进行醇沉，5000转/分转速离心15min,冷冻干燥后得到绣球菌多糖4.96克。
实施例4
一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，包括如下步骤：
1)将鲜绣球菌菌柄250g切块；
2)加入聚乙二醇200-氯化钾溶液1250ml，其中聚乙二醇200的质量浓度为5％，氯化钾的质量浓度为1％，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；
3)将绣球菌匀浆液进行微波提取，微波功率为500W,提取温度为120℃，时间为10min；
4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心，离心转速为8000rpm,离心时间为15min，得上清液；
5)用HCl调节上清液pH＝3.8，进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜后，将悬浮液离心，离心转速为5000rpm,时间为15min，除去蛋白；
6)取上清液进行醇沉，5000转/分转速离心15min,冷冻干燥后得到绣球菌多糖5.75克。
对比例1
参照实施例1，与实施例1不同的是，不加入氯化钾，具体步骤2)为：2)加入聚乙二醇200溶液500ml，其中聚乙二醇200质量浓度为5％，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液。其他步骤相同。得到绣球菌多糖3.04克。与实施例1相比，说明加入氯化钾有助于提高绣球菌多糖的提取率。
对比例2
参照实施例1，与实施例1不同的是，不加入聚乙二醇200，具体步骤2)为：加入氯化钾溶液500ml，其中氯化钾的质量浓度为1％，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液。其他步骤相同。得到绣球菌多糖1.58克。与实施例1相比，说明聚乙二醇200对绣球菌多糖的提取具有重要作用，加入聚乙二醇200-氯化钾溶液能够提高绣球菌多糖的提取率。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将绣球菌菌柄切块；
2)加入提取液，进行匀浆，获得绣球菌匀浆液；
3)将绣球菌匀浆液进行微波提取；
4)提取结束后，提取液进行压滤，滤液进一步离心得上清液、提取液为聚乙二醇200与氯化钾溶于水的混合溶液；
5)调节上清液pH值，使pH值等于绣球菌蛋白的等电点，然后进行磁力搅拌，获得悬浮液，静置过夜，将悬浮液离心除去蛋白；
6)取上清液进行醇沉，离心干燥后得到绣球菌多糖。
2.根据权利要求1所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤2)中，提取液中的聚乙二醇200的质量浓度为4％-6％，氯化钾的质量浓度为1-3％。
3.根据权利要求1所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤3)中，微波提取的微波功率300-500W,提取温度80-120℃，时间3-10分钟。
4.根据权利要求1所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤4)中，提取液离心的转速为8000转/分，离心15分钟。
5.根据权利要求1所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤5)中，上清液调节pH值3.8，磁力搅拌2小时，4℃静置过夜，提取液离心的转速为5000转/分，离心15分钟，除去绣球菌蛋白。
6.根据权利要求5所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤5)中，用盐酸溶液调节pH值3.8。
7.根据权利要求1所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤6)中，离心的转速为5000转/分，离心15分钟，干燥的方法为冷冻干燥。
8.根据权利要求1所述的从绣球菌菌柄中高效制备多糖的方法，其特征在于，步骤1)中，绣球菌菌柄来自农业废弃物绣球菌菌柄。
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