CN112125949A - 一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法 - Google Patents

一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,将酵母原料与上述低共熔溶剂混合,超声;然后将混合物在恒温摇床中提取,经离心,得到酵母多肽浸提液;向酵母多肽浸提液中加入溶剂,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心、冻干,得到酵母多肽。所述低共熔溶剂包括氢键供体、氢键受体及去离子水,所述氢键供体为草酸,所述氢键受体为氯化胆碱。本发明利用溶剂法提取多肽,溶剂合成方法是氯化胆碱和草酸经过加热后,以氢键结合到一起形成低共熔溶剂,作为一种溶剂用于萃取产朊假丝酵母中的多肽蛋白,能够很好地从产朊假丝酵母中萃取出多肽,并且所得产品有较高的纯度。

Description

一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法
技术领域
本发明涉及一种酵母多肽的制备方法,属于食品加工技术领域。
背景技术
产朊假丝酵母,作为一种安全的微生物,被美国食品及药物管理局(FDA)认证为可作为食品添加剂的酵母,也是我国卫生部规定的可用于保健食品的真菌菌种。产朊假丝酵母的菌体蛋白质约占菌体干物质的32%~75%,其含量因菌种、培养条件不同而差异较大。产朊假丝酵母的细胞壁约占整体重量的20%,成分主要有内壁的β-葡聚糖57%、外壁的甘露寡糖6.6%和糖蛋白22%等。其中,β-葡聚糖的主要生理功能是维持细胞壁的结构,保持细胞正常的生理形态;而甘露聚糖则主要负责细胞识别和与环境的交互作用。甘露糖和β-葡聚糖具有免疫促进剂的功能,能够激发或增强机体免疫功能。
酵母蛋白氨基酸比例协调,用蛋白酶酶解酵母蛋白可以获得具有高生物活性的多肽制品;β-葡聚糖位于细胞壁的最内层,而甘露聚糖存在于酵母细胞壁外层,二者通过蛋白质连接构成酵母细胞壁的基本组成。Β-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖组成(葡萄糖残基通过β-1,3-糖苷键和β-1,6-糖苷键组成,两者比例为85:15,以β-1,3-糖苷键为骨架,β-1,6-糖苷键为支链,并且β-1,6-葡聚糖的还原端连接到β-1,3-葡聚糖非还原端的末端葡萄糖上,在氢键作用下共同形成一个三维网络结构。
酵母多肽的制备方法主要采用酸水解法、碱水解法和酶法等。其中,蛋白质酸水解会造成某些氨基酸的损失,产生的蛋白质衍生物包含非天然结构,或不能被人体代谢,甚至可能产生抑制作用和毒性;而蛋白质经碱水解处理,会导致其中的氨基酸发生消旋作用,使必需氨基酸的L-对映体减少和消化率降低,并产生有毒的D-氨基酸。而酶法制备酿酒酵母短肽主要采用碱性蛋白酶,其在调节pH的过程会大量引入盐离子,影响产品纯度;为提高产品纯度需对肽产品进行脱盐处理,操作周期长且需要增加设备投入。
DESs作为传统离子液体(ILs)和有机溶剂的替代品,以其独特的优势在许多领域引起了广泛的关注。其优点包括蒸汽压低、不燃、制备简单、易于提纯、成本低等。DES(即低共熔混合物)由两种或三种廉价且环保的成分组成,它们能够通过氢键相互作用相互结合。因此尝试利用这些能够显著破坏细胞壁、释放产物、提高蛋白质溶解度的新型溶剂提取多肽具有重要意义。
近年来,超声波能量在天然产物提取方面更绿色、更具成本效益而受到研究者的极大关注。当超声波通过介质时,它会产生空化等物理现象,从而增加原料和溶剂之间的传质和接触面积,从而提高所需化合物的提取效率。
三氯乙酸(TCA)可以有效的去除溶液中的大分子的蛋白质。双缩脲是两分子脲(NH3CONH3)在高温下反应脱去一分子氨以后得到的产物。双缩脲和硫酸铜在碱性条件下,形成紫色络合物的反应,称作双缩脲反应。酶解液中存在的含两个或更多肽键的肽类物质,都能与溶液中的Cu2+结合,发生双缩脲反应,其中,反应液颜色的深浅与溶液中多肽的浓度成正比。紫色络合物被认为在540nm处具有最大吸收波长,因此,可以通过检测这一波长下的吸光值,根据标准曲线得出溶液中的多肽浓度。
近年来,超声波能量在天然产物提取方面更绿色、更具成本效益而受到研究者的极大关注。当超声波通过介质时,它会产生空化等物理现象,从而增加原料和溶剂之间的传质和接触面积,从而提高所需化合物的提取效率。
酵母多肽因很好地保留了酵母原有的营养和功能成分,而且还具有较好的活性功能可应用于食品、医药、饲料和化妆品行业。发明一种快速绿色的酵母多肽制备技术,不仅可以充分利用我国的酵母资源,还可以进一步开发具备高功能活性的酵母多肽产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:现有提取酵母活性多肽的方法效率低,操作不便,易产生三废排放等问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种低共熔溶剂,其特征在于,包括氢键供体、氢键受体及去离子水,所述氢键供体为草酸,所述氢键受体为氯化胆碱。
优选地,所述氢键受体、氢键供体与水的摩尔比为1:(1~3):(20~80)。不同比例合成的低共熔溶剂更澄清、透明且粘度小,则更适合用于酵母多肽的提取。
本发明还提供了上述低共熔溶剂的制备方法,其特征在于,将所述氢键受体、氢键供体与去离子水混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂。
本发明还提供了一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1):将酵母原料与上述低共熔溶剂混合,超声;然后将混合物在80℃恒温摇床中提取,经离心,得到酵母多肽浸提液;
步骤2):向酵母多肽浸提液中加入溶剂,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心、冻干,得到酵母多肽。减少低共熔溶剂的用量,不仅使得多肽提取效果较优,且不会造成浪费,并且减少了蛋白析出过程中所需要的乙醇的量。
优选地,所述步骤1)中酵母原料与低共熔溶剂的比例为(1~5)g:(10~50)mL;所述超声的功率为200~1000W,时间为20~120min;所述恒温摇床的转速为150r/min,提取时间为4h。
优选地,所述步骤2)中的溶剂采用乙醇。
优选地,所述步骤2)中酵母多肽浸提液与溶剂的体积比为1:(1~4)。
优选地,所述步骤2)中离心后得到的上清液,将其旋蒸收集低共熔溶剂和溶剂,所得收集低共熔溶剂和溶剂可循环利用。
更优选地,所述旋蒸的工艺参数为:温度40℃,转速30rpm,时间50min。
本发明利用溶剂法提取多肽,溶剂合成方法是氯化胆碱和草酸经过加热后,以氢键结合到一起形成低共熔溶剂,作为一种溶剂用于萃取产朊假丝酵母中的多肽蛋白,原理是根据低共熔溶剂对生物大分子具有高度溶解和特异性作用的能力。本发明利用氯化胆碱-草酸低共熔体系,能够很好地从产朊假丝酵母中萃取出多肽,并且所得产品有较高的纯度。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
1、本发明首次提出了一种用低共熔溶剂从产朊假丝酵母中提取酵母肽的方法。低共熔溶剂具有很好的生物活性物质萃取效果,而本发明,首次利用氯化胆碱~草酸体系提取产朊假丝酵母中的酵母肽,提取条件温和,而且溶剂均可回收利用,达到了废物、废液零排放的效果。同时也拓展了低共熔溶剂在生物活性分子萃取方面的应用前景。
2、与传统的碱溶酸沉法相比,利用低共熔溶剂提取酵母中的酵母肽,不需要使用大量的强酸、强碱或盐溶液,并且溶剂可回收利用,不会造成浪费。本方法利用低共熔溶剂提取酵母肽,使其有效的溶解于溶剂中,然后利用乙醇进行析出,以达到肽的高效提取并能得到较高纯度肽的效果。与传统的自溶和酶解相比,可以有效缩短提取时间。
3、低共熔溶剂提取酵母多肽后得到浸提液后,可利用乙醇进行多肽析出,多肽的析出率较高,特别的,本发明制备的氯化胆碱~草酸体系可利用旋蒸的方式进行回收重复利用,并且该体系在数次操作循环后仍可继续用于多肽提取。另外,本发明制备和操作方法简单,溶剂绿色环保可重复利用,无废液、废物排放,不需要操作复杂或大功率的仪器,且具有较好的提取效果。
综上,本发明制备的低共熔溶剂可以有效的提取酵母中的多肽,并且可利用乙醇析出多肽,同时,本发明在制备低共熔溶剂的过程中,调控了氯化胆碱和草酸的摩尔比,合成了性能优良的低共熔溶剂用于酵母肽的提取;在提取酵母肽的过程中,通过液固比、超声功率和时间等条件,更有效的提高了酵母肽的提取率。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,作详细说明如下。
本发明提供了一种低共熔溶剂,其由氢键供体、氢键受和去离子水三部分组成,所述氢键供体为草酸,所述氢键受体为氯化胆碱。
所述氢键受体、氢键供体和水的摩尔比为1:(1~3):(20~80),即所述氯化胆碱、草酸和去离子水的摩尔比为1:(1~3):(20~80)。
上述低共熔溶剂的制备方法,包括:将所述氢键受体、氢键供体和去离子水按照摩尔比1:(1~3):(20~80)混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂。
一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,步骤如下:
1、将酵母原料及低共熔溶剂按照(1~5)g:(10~50)mL混合,在200~1000W下超声20~120min,在80℃、150r/min的恒温摇床中提取4h,经离心,得到酵母多肽浸提液;
2、向所述酵母多肽浸提液中加入体积比乙醇,酵母多肽浸提液与乙醇的体积比为1:(1~4)乙醇,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心、冻干,得到酵母多肽。减少低共熔溶剂的用量,不仅使得多肽提取效果较优,且不会造成浪费,并且减少了蛋白析出过程中所需要的乙醇的量。
实施例1
一种利用低共熔溶剂提取产朊假丝酵母中多肽的方法:
(1)将氯化胆碱、草酸和去离子水按照摩尔比1:1:20混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂;
(2)称取产朊假丝酵母泥1.00g置于烧杯中,向其中加入10mL低共熔溶剂,在功率为200W的超声条件下提取100min,在80℃、150r/min的恒温摇床中提取4h,将浸提液于8000rpm离心10min,得到酵母沉淀和酵母肽浸提液。
利用双缩脲法测定酵母肽浸提液中多肽的含量,多肽提取率计算公式如下:
多肽提取率(%)=样品(TCA)多肽浓度×样品溶液体积/原料中蛋白含量×100
(注:该多肽提取率为溶剂中提取多肽的含量,且以酵母干基计。)
根据上式计算得出,酵母肽浸提液中多肽提取率为6.02%。
实施例2
一种利用低共熔溶剂提取产朊假丝酵母中多肽的方法:
(1)将氯化胆碱、草酸和去离子水按照摩尔比1:2:20混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂;
(2)称取产朊假丝酵母泥2.00g置于烧杯中,,向其中加入30mL低共熔溶剂,在功率为400W的超声条件下提取80min,在80℃、150r/min的恒温摇床中提取4h,将浸提液8000rpm离心10min,得到酵母沉淀和酵母肽浸提液。
利用双缩脲法测定酵母肽浸提液中多肽的含量,多肽提取率计算公式如下:
多肽提取率(%)=样品(TCA)多肽浓度×样品溶液体积/原料中蛋白含量×100
(注:该多肽提取率为溶剂中提取多肽的含量,且以酵母干基计。)
根据上式计算得出,酵母肽浸提液中多肽提取率为11.84%。
实施例3
一种利用低共熔溶剂提取产朊假丝酵母中多肽的方法:
(1)将氯化胆碱、草酸和去离子水按照摩尔比1:2:40混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂;
(2)称取产朊假丝酵母泥3.00g置于烧杯中,,向其中加入50mL低共熔溶剂,在功率为600W的超声条件下提取60min,在80℃、150r/min的恒温摇床中提取4h,将浸提液8000rpm离心10min,得到酵母沉淀和酵母肽浸提液。
利用双缩脲法测定酵母肽浸提液中多肽的含量,多肽提取率计算公式如下:
多肽提取率(%)=样品(TCA)多肽浓度×样品溶液体积/原料中蛋白含量×100
(注:该多肽提取率为溶剂中提取多肽的含量,且以酵母干基计。)
根据上式计算得出,酵母肽浸提液中多肽提取率为14.24%。
实施例4
一种利用低共熔溶剂提取产朊假丝酵母中多肽的方法:
(1)将氯化胆碱、草酸和去离子水按照摩尔比1:3:20混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂;
(2)称取产朊假丝酵母泥4.00g置于烧杯中,,向其中加入30mL低共熔溶剂,在功率为800W的超声条件下提取40min,在80℃、150r/min的恒温摇床中提取4h,将浸提液8000rpm离心10min,得到酵母沉淀和酵母肽浸提液。
利用双缩脲法测定酵母肽浸提液中多肽的含量,多肽提取率计算公式如下:
多肽提取率(%)=样品(TCA)多肽浓度×样品溶液体积/原料中蛋白含量×100
(注:该多肽提取率为溶剂中提取多肽的含量,且以酵母干基计。)
根据上式计算得出,酵母肽浸提液中多肽提取率为16.10%。
实施例5
一种利用低共熔溶剂提取产朊假丝酵母中多肽的方法:
(1)将氯化胆碱、草酸和去离子水按照摩尔比1:3:60混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂;
(2)称取产朊假丝酵母泥5.00g置于烧杯中,向其中加入20mL低共熔溶剂,在功率为1000W的超声条件下提取20min,在80℃、150r/min的恒温摇床中提取4h,将浸提液8000rpm离心10min,得到酵母沉淀和酵母肽浸提液。
利用双缩脲法测定酵母肽浸提液中多肽的含量,多肽提取率计算公式如下:
多肽提取率(%)=样品(TCA)多肽浓度×样品溶液体积/原料中蛋白含量×100
(注:该多肽提取率为溶剂中提取多肽的含量,且以酵母干基计。)
根据上式计算得出,酵母肽浸提液中多肽提取率为5.54%。

Claims (9)

1.一种低共熔溶剂,其特征在于,包括氢键供体、氢键受体及去离子水,所述氢键供体为草酸,所述氢键受体为氯化胆碱。
2.如权利要求1所述的低共熔溶剂,其特征在于,所述氢键受体、氢键供体与水的摩尔比为1:(1~3):(20~80)。
3.权利要求1或2所述的低共熔溶剂的制备方法,其特征在于,将所述氢键受体、氢键供体与去离子水混合,于80℃搅拌至澄清,得到低共熔溶剂。
4.一种利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1):将酵母原料与权利要求1或2所述的低共熔溶剂混合,超声;然后将混合物在80℃恒温摇床中提取,经离心,得到酵母多肽浸提液;
步骤2):向酵母多肽浸提液中加入溶剂,经混匀、静置、离心,取沉淀物经洗涤、离心、冻干,得到酵母多肽。
5.如权利要求4所述的利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,所述步骤1)中酵母原料与低共熔溶剂的比例为(1~5)g:(10~50)mL;所述超声的功率为200~1000W,时间为20~120min;所述恒温摇床的转速为150r/min,提取时间为4h。
6.如权利要求4所述的利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,所述步骤2)中的溶剂采用乙醇。
7.如权利要求4或6所述的利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,所述步骤2)中酵母多肽浸提液与溶剂的体积比为1:(1~4)。
8.如权利要求4或6所述的利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,所述步骤2)中离心后得到的上清液,将其旋蒸收集低共熔溶剂和溶剂,所得收集低共熔溶剂和溶剂可循环利用。
9.如权利要求8所述的利用低共熔溶剂提取酵母多肽的方法,其特征在于,所述旋蒸的工艺参数为:温度40℃,转速30rpm,时间50min。
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