CN114560959B - 一种菌菇类提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菌菇类提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：S1、将菌菇类子实体原料、第一复合酶和溶剂混合后，依次进行微波辅助酶提取和微波灭酶，制得提取液；S2、将步骤S1制得的提取液和第二复合酶混合后酶解，制得酶解液；S3、将步骤S2制得的酶解液采用大孔树脂柱层析后，得β‑葡聚糖提取物；将所述柱层析后的大孔树脂洗脱后制得菌菇类核苷提取物；所述第一复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶；所述第二复合酶包括α‑淀粉酶和转化酶。本发明不仅能制备高含量的水溶性β‑葡聚糖提取物，且其α‑葡聚糖含量极低(≤1％)，还综合利用了菌菇类核苷类有效成分。

Description

一种菌菇类提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，具体涉及一种菌菇类提取物的制备方法。

背景技术

食用菌中含有多种功效成分，如多糖类、核苷类、多肽氨基酸类、矿物质、维生素、三萜类和脂肪类等。β-葡聚糖作为多糖研究领域中的一个重要分支，广泛分布于真菌(香菇、灰树花和猴头菇等)、细菌和植物体内，食用菌多糖主要是由以下类型的多糖组成：几丁质(纤维素)、α-葡聚糖、β-葡聚糖和糖蛋白；食用菌多糖是构筑多种生物细胞壁的材料；食用菌中的β-葡聚糖主要是β-(1-3)-D葡聚糖和β-(1-6)-D葡聚糖，而多糖的β型结构，也被认为是其发挥生物活性的主要原因。正因为其独特的生物活性而引起越来越多的关注，同时也因其多种生物活性作为功能性原料应用到保健品及制药工程中。

β-葡聚糖(β-Glucan)是一种提取的天然多糖，分子量在6500以上，形态大多数为水溶性或胶质状颗粒，分水溶性和非水溶性两种，大多数易溶于水，溶解度大于70％(70g/100g水)，质量分数为10％的β-葡聚糖水溶液的pH值为2.5～7.0，无特殊气味。β-葡聚糖不同于一般常见糖类(如淀粉、肝糖原和糊精等)，其与常见糖类的最主要的差别在于键连接方式不同，一般糖类为以α-1,4-糖苷键结合而成为线形分子，而β-葡聚糖以β-1,3-糖苷键为主体，且含有一些β-1,6-糖苷键的支链。β-葡聚糖因其特殊的键连接方式和分子内氢键的存在，造成螺旋形的分子结构，这种独特的构型很容易被免疫系统接受，从而具有独特的生理活性。

相关技术中对菌菇类水溶性β-葡聚糖的制备研究较少，较多的都是食用菌多糖的提取，而针对β-葡聚糖制备较多的研究主要集中在谷物类或酵母类，且大部分制备的β-葡聚糖水溶性均较差。相关技术中公开了一种食用菌β-葡聚糖的制备方法，食用菌(香菇、猴头菇、灰树花、灵芝和姬松茸)子实体采用超声处理，复合酶(中性纤维素酶、半纤维素酶和中性蛋白酶)、高温淀粉酶依次酶解后灭酶，醇沉，超滤浓缩干燥，得到食用菌β-葡聚糖成品(荧光检测，香菇：质量纯度为65.6％，提取率4.63％，灰树花：质量纯度为68.5％，提取率为3.60％)。但该方法未充分利用菌菇类中的核苷类成分，且水溶性β-葡聚糖提取率较低。

相关技术中还公开了一种从猴头菇子实体中提取水溶性β-葡聚糖的方法及其产品，的制备方法，原料粉碎，0.1mol/L～1mol/L碱水浸提，滤液加入乙醇醇沉，沉淀物加水分散，加α淀粉酶酶解，弃去滤液，残渣再加碱水提取，调至中性，加热水解，水解液过滤，醇沉，沉淀物干燥得到产品，硫酸苯酚法测定多糖含量大于50％。该方法工艺复杂，且使用碱液和酸液，不仅对设备腐蚀损耗大，还增加了产品潜在的安全性风险，且未充分利用原料中的核苷类成分。

相关技术中还公开了一种高纯度灰树花多糖的制备与纯化方法，灰树花子实体热水提取，超滤，阴阳离子交换串联树脂柱脱蛋白，溶液干燥得到多糖成品，水分小于15％。多糖含量平均为83.27％。该方法只对其中的蛋白质进行了去除，对其中的纤维素、淀粉类物质没有针对性脱除，且使用阴阳离子串联树脂柱，需使用到大量酸碱，对环境不友好，且其多糖成品中成分复杂，还未合理利用原料中的核苷类成分。

因此，需要开发一种菌菇类提取物的制备方法，该方法对水溶性β-葡聚糖的提取效率高。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种菌菇类提取物的制备方法，该方法对水溶性β-葡聚糖的提取效率高。

具体如下：本发明提供了一种菌菇类提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将菌菇类子实体原料、第一复合酶和溶剂混合后，依次进行微波辅助酶提取和微波灭酶，制得提取液；

S2、将步骤S1制得的提取液和第二复合酶混合后酶解，制得酶解液；

S3、将步骤S2制得的酶解液采用大孔树脂柱层析后，收集上样流出液，得β-葡聚糖提取物；

S4、将所述柱层析后的大孔树脂洗脱，得菌菇类核苷提取物；

所述第一复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的混合酶；

所述第二复合酶为α-淀粉酶和转化酶的混合酶。

根据本发明制备方法技术方案中的一种技术方案，至少具备如下有益效果：

本发明的制备方法，先通过采用微波辅助酶提取，再利用微波灭酶改性，显著提高了水溶性β-葡聚糖的提取率；其原因在于：菌菇类子实体原料细胞内外均含有水溶性β-葡聚糖；对于细胞内的水溶性β-葡聚糖，通过微波辅助酶提取，第一复合酶有针对性的对菌菇类原料的细胞壁进行破坏；而在微波的协同作用下，使细胞内的水溶性β-葡聚糖被释放出来；同时再通过微波灭酶，在微波的作用下，形成的空泡效应，进一步破坏细胞壁结构，将细胞壁上不溶性β-葡聚糖(水中溶解度小)等成分转移到提取液中，再被微波破坏分解成水溶性β-葡聚糖；从而提高水溶性β-葡聚糖的提取率。

通过第一复合酶和第二复合酶的分步酶解，将菌菇类子实体原料中的纤维素、半纤维素、蛋白质和淀粉等大分子杂质多糖基本分解为小分子多糖；再结合大孔树脂，利用大孔树脂对核苷类提取物的吸附作用，将核苷类提取物和水溶性β-葡聚糖分离；再将柱层析后的大孔树脂进行洗脱，实现了对核苷类提取物的回收利用。

根据本发明的一些实施方式，所述菌菇类子实体原料包括香菇子实体、灰树花子实体和猴头菇子实体中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述菌菇类子实体原料包括香菇子实体干料、灰树花子实体干料和猴头菇子实体干料中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述菌菇类子实体原料包括人工养殖的香菇子实体、人工养殖的灰树花子实体和人工养殖的猴头菇子实体中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述香菇子实体中总β-葡聚糖的质量百分数为18％～20％。

根据本发明的一些实施方式，所述香菇子实体中腺苷的质量百分数为0.2％～0.3％。

根据本发明的一些实施方式，所述猴头菇子实体中总β-葡聚糖的质量百分数为18％～20％。

根据本发明的一些实施方式，所述猴头菇子实体中腺苷的质量百分数为0.2％～0.3％。

根据本发明的一些实施方式，所述灰树花子实体中总β-葡聚糖的质量百分数为20％～22％。

根据本发明的一些实施方式，所述灰树花子实体中腺苷的质量百分数为0.2％～0.3％。

猴头菇(Hericium erinaceus)一种名贵的药食兼用菌，具有良好的药用价值，临床医学表明，猴头菇可治疗消化不良、胃溃疡、慢性胃炎、十二指肠溃疡及神经衰弱等疾病，増强机体免疫调节。猴头菇的营养价值丰富，研究表明猴头菇干菇中含有50％～55％碳水化合物(其中膳食纤维6％～7％)、26％～28.5％蛋白质、4％～5％脂肪和多种维生素并且含有9种人体必需的氨基酸，猴头菇还具有多种生物活性物质，如多糖(β-葡聚糖等)、核苷类、萜类和酚类等，特别是β-葡聚糖，具有提高机体免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老、抗菌、加速伤口的愈合等药效作用。

香茹(Lentinus edodes)是世界著名的食用兼药用菌之一，素有＂山珍之王＂之称，不仅具有独特的香气，鲜美的味道，并且具有极高的营养价值，是髙蛋白、低脂肪的营养保健食品。香菇干菇中除含有58％～60％碳水化合物(其中膳食纤维9％～10％)、蛋白质(20％～23％)、脂类(3％～4％)以及灰分(4％～5％)外，它还含有多种有效的药用成分，尤其是具有抗肿瘤、调节免疫功能和降血糖等多种药理作用的香茹多糖，有研究表明，香菇粗多糖中含有大约27.19％的β-葡聚糖，是丰富的β-葡聚糖的来源。

灰树花(Grifola Frondosa)子实体具有独特的芳香味，口味鲜美，是一种珍贵食药兼用真菌，具有极高的营养价值，灰树花干菇含有含蛋白质24％～28％，脂肪2％～3％，碳水化合物45％～50％(其中膳食纤维11％～13％)，含18种氨基酸，还富含多种维生素、矿物质；其中包含多种生物活性物质，其中灰树花多糖就是最主要的一类活性成分，结构多为带有β-1,6侧链的β-1,3-葡聚糖，还有少量的1,4-α-1,6-葡聚糖，构型不同的葡聚糖其活性也不一样。灰树花多糖是一种有效的生物免疫调节剂，能极大地激活细胞免疫功能，提高机体免疫力，并具有抗高血压、降血糖、降血脂和抗病毒等作用。灰树花多糖的抗肿瘤机制与其他真菌多糖相似，并不是通过直接杀死病毒或肿瘤细胞，而是通过激活机体免疫系统来防止正常细胞癌变、抑制肿瘤生长和转移通过与放化疗的协同作用提高治疗效果，并降低放化疗的毒副反应。

食药用菌中除了含有较多β-葡聚糖外，也含有丰富的核苷类成分，如鸟苷、尿苷以及腺苷等。大量的研究证实天然核苷类成分具有明显的免疫调节、抗病毒、抗肿瘤和调节心血管系统等生物活性。

β-葡聚糖的生物活性主要表现在：提高机体免疫力，预防和治疗心脑血管疾病、降血脂和降胆固醇；调节血糖，预防糖尿病等作用。

β-葡聚糖的活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，从而提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统。大量实验表明，β-葡聚糖可促进体内IgM抗体的产生，以提高体液的免疫能力。此外，β-葡聚糖尚有清除游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等引起的感染等作用，故广泛用于医药、食品保健、化妆品、美容护肤等行业。研究表明，β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖都有良好的免疫活性。β-1,6-葡聚糖水溶性良好，可以直接作针剂来防治疾病。然而β-1,3-葡聚糖水溶性差，直接用作针剂会引起肝脾肿大、血管微栓塞、机体对内毒素敏感性增强等副作用。且水溶性好在其他行业的应用范围也更广。而多糖的高度纯化，更是克服了一般真菌多糖成分复杂，有效成分不清的缺点。

根据本发明的一些实施方式，所述菌菇类子实体原料在进行微波辅助酶提取前需粉碎。

根据本发明的一些实施方式，所述粉碎操作后，所述菌菇类子实体原料的目数为40目～60目。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述溶剂和所述菌菇类子实体原料的体积质量比为15mL～20mL:1g。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述溶剂为水。

根据本发明的一些实施方式，所述水和所述菌菇类子实体原料的体积比为15～20:1。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波辅助酶提取的微波功率为300W～400W。

微波辅助酶提取功率在上述功率范围内，β-葡聚糖的提取率最优，原因是随着功率的增加，微波作用强度增大，使菌菇类原料细胞壁进一步疏松，吸收微波能量导致快速升温和增加内部压力，促使细胞破裂，细胞内的多糖、核苷类成分扩散到周围溶剂中；但功率过高的时候，过高热效应会破坏β葡聚糖内部结构，增加杂质的溶出。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波辅助酶提取的提取温度为50℃～60℃。

在该范围内温度，加快β葡聚糖热运动，使有效成分最大限度溶出，其次该温度范围为复合酶1的最适宜温度范围。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波辅助酶提取的时间为30min～45min。

根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶、所述木聚糖酶和所述木瓜蛋白酶的质量比为1：0.6～0.9：0.4～0.6。

根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶和所述木聚糖酶的质量比为1:0.6～0.9。

根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶和所述木瓜蛋白酶的质量比为1:0.4～0.6。根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶和所述木聚糖酶的质量比为2～2.5:1.5～1.8。

根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶和所述木瓜蛋白酶的质量比为2～2.5:1～1.2。

根据本发明的一些实施方式，所述第一复合酶中纤维素酶的酶活力为5万U/g～15万U/g、木瓜蛋白酶的酶活力为5万U/g～15万U/g、木聚糖酶的酶活力为5万U/g～15万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶的酶活力为5万U/g～15万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述木瓜蛋白酶的酶活力为5万U/g～15万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述木聚糖酶的酶活力为5万U/g～15万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述纤维素酶的酶活力为10万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述木瓜蛋白酶的酶活力为10万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述木聚糖酶的酶活力为10万U/g。一般来说酶的活力越高，酶解效果越好，应用时添加量可以适当减少。本发明中的酶添加量是经过多次筛查获得，如果改变酶的活力这一因素，对提取效果也是存在影响：酶活力越高，则相同添加量酶过量，酶的作用受限，同时过多的酶会分解已经溶出的水溶性β-葡聚糖的糖苷键，导致提取率下降，其次酶活力越低，相同添加量酶解效果达不到预期，也会影响水溶性β-葡聚糖与核苷类成分的提取率。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述第一复合酶与所述菌菇类子实体原料的质量比为1～2:250。

通过对第一复合酶的添加量、各酶的配比以及酶活力协同作用下，从而实现β-葡聚糖提取率最优。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波灭酶的微波功率为750W～850W。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波灭酶的微波功率为800W。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波灭酶的温度为160℃～180℃。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中所述微波灭酶的时间为2min～3min。

通过将微波灭酶的参数控制在上述范围内，从而达到灭酶的作用；其次在上述处理条件下，β-葡聚糖的提取率更高；原因在于：水不溶β-葡聚糖分子剧烈运动，在微波形成的空泡效应下，结构被破坏分解成可溶性β-葡聚糖。

根据本发明的一些实施方式，从微波辅助灭酶提取过程转化到微波灭酶过程需进行升温。

根据本发明的一些实施方式，所述升温时间为6min～8min。

根据本发明的一些实施方式，所述α-淀粉酶和所述转化酶的质量比为2～3.5:1。

根据本发明的一些实施方式，所述α-淀粉酶的酶活力为1.5万U/g～2.5万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述转化酶的酶活力为5万U/g～15万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述α-淀粉酶的酶活力为2万U/g。

根据本发明的一些实施方式，所述转化酶的酶活力为10万U/g。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述酶解的温度为50℃～60℃。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述酶解过程中的pH为4.0～5.5。

微波辅助酶提取后的混合体系的pH呈酸性，pH范围在4.0～5.5。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述酶解的时间为25min～35min。

根据本发明的一些实施方式，所述第二复合酶与所述菌菇类子实体原料的质量比为1～3:1000。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述酶解和步骤S3中所述柱层析之间还进行高温灭酶。

根据本发明的一些实施方式，所述高温灭酶的温度≥90℃。

根据本发明的一些实施方式，所述高温灭酶的温度为90℃～100℃。

根据本发明的一些实施方式，所述高温灭酶的时间为5min～10min。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述大孔树脂包括LS-206和LX-60中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述大孔树脂柱层析的温度为50℃～60℃。

通过对大孔树脂及柱层析条件进行控制，在达到分离β-葡聚糖的目的外，还对核苷类成分的富集纯化效果也显著。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述大孔树脂柱层析的上样液流速为2BV/h～3BV/h。

通过多次实验发现大孔树脂LX-60、LS-206具有较强的除杂能力，且在设定的上样液温度、流速以及树脂量的范围，树脂对蛋白以及核苷等杂质成分的吸附量最大化，β-葡聚糖损耗率极低。可能是高流速时，杂质分子在树脂穿柱层析中停留时间较短，较快流出，不易被吸附，低流速时，溶液与树脂充分接触，杂质被吸附的同时部分多糖也易被吸附；溶液温度太高，分子运动加速，大分子物质多糖易被树脂吸附，造成损失，温度过低，分子运动缓慢，对较大分子杂质吸附效果不佳。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述大孔树脂的体积和步骤S2中所述酶解液的体积比为1:6～8。

若比例越大(即树脂添加量多)，大孔树脂对β-葡聚糖具有一定的吸附作用，降低了β-葡聚糖的提取率；若比例越小，大孔树脂对核苷类及其他杂质的吸附效果变差，同时会影响醇沉效果，从而影响β-葡聚糖的收率及纯度。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述上样流出液减压浓缩和醇沉，收集醇沉物。

根据本发明的一些实施方式，所述减压浓缩后的固含量为30％～40％。

根据本发明的一些实施方式，所述醇沉的醇沉剂为体积分数为95％～99％的乙醇水溶液。

根据本发明的一些实施方式，所述醇沉过程中乙醇占醇沉液的体积分数为75％～85％。

根据本发明的一些实施方式，所述醇沉的时间为6h～12h。

根据本发明的一些实施方式，所述醇沉物溶解后，固液分离，收集液相后干燥，即得β-葡聚糖提取物。

根据本发明的一些实施方式，所述醇沉物用水溶解。

根据本发明的一些实施方式，所述醇沉物与水的体积比为1:3～5。

采用醇沉工艺，使糖类物质中的非目标多糖尽可能被去除，高度纯化β-葡聚糖化合物，进一步提高β-葡聚糖提取物的纯度；且整个工艺过程仅使用了乙醇一种有机溶剂，无其他有毒有害有机溶剂，产品安全，工艺简单，节能环保，适用于工业化生产。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥为真空干燥。

根据本发明的一些实施方式，所述干燥的温度为60℃～80℃。

根据本发明的一些实施方式，所述洗脱依次采用水和体积分数为50％～70％乙醇水溶液洗脱。

根据本发明的一些实施方式，所述洗脱依次采用水和体积分数为50％～70％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇段洗脱液。

根据本发明的一些实施方式，所述洗脱依次采用1BV～2BV的水和2.5BV～4BV的体积分数为50％～70％的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇段洗脱液。

根据本发明的一些实施方式，所述乙醇段洗脱液减压浓缩干燥得菌菇类核苷类提取物。

根据本发明的一些实施方式，所述洗脱的流速为1BV/h～2BV/h。

附图说明

图1为本发明实施例3中核苷酸类提取物的液相色谱检测图。

图2为本发明实施例4中核苷酸类提取物的液相色谱检测图。

图3为本发明实施例5中核苷酸类提取物的液相色谱检测图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面详细描述本发明的具体实施例。

本发明实施方式中香菇子实体原料(人工种植)中总β-葡聚糖质量百分数为18.88％，腺苷质量百分数为0.21％。

本发明实施方式中猴头菇子实体原料(人工种植)中总β-葡聚糖质量百分数为19.32％，腺苷质量百分数为0.25％。

本发明实施方式中灰树花子实体原料(人工种植)中总β-葡聚糖质量百分数为21.77％，腺苷质量百分数为0.28％。

纤维素酶：酶活力10万U/g，购自河南安锐生物科技有限公司。

木瓜蛋白酶：酶活力10万U/g，购自河南安锐生物科技有限公司。

木聚糖酶：酶活力10万U/g，购自南宁庞博生物工程有限公司。

中温淀粉酶(α-淀粉酶)：酶活力2万U/g，购自郑州万搏化工产品有限公司。

转化酶：酶活力10万U/g，购自郑州万搏化工产品有限公司。

采用试剂盒法(酵母和蘑菇β-葡聚糖检测试剂盒(K-YBGL))检测。

本发明实施方式中核苷类提取物中腺苷的液相测定色谱条件如下：

色谱柱：WONDASILTM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：乙腈：水＝5:95(V/V)；

流速：1mL/min；

检测波长：260nm；

进样量：20μL；

灵敏度：2.000AUFS；

柱温：35℃。

本发明实施方式中β-葡聚糖得结果是通过总糖减去α-葡聚糖得到的。

实施例1

本实施例为一种菌菇类提取物的制备方法，由以下步骤组成：

S1、微波辅助酶提取：

取香菇子实体原料500g，粉碎至40目，再加入20倍体积(10000mL)的纯水，得原料分散液；

再将原料分散液进行微波辅助酶提取45min后(其中，微波辅助酶提取的微波功率400W，微波辅助酶提取的酶解温度为60℃；微波辅助酶提取的第一复合酶由纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的按照质量比为2:1.5:1组成；第一复合酶添加量为香菇子实体原料重量得4‰(即500g*4/1000＝2g))，再将微波功率调至800W，升温至160℃后(升温时间7min±1min)进行微波灭酶处理，微波灭酶处理时间为2min(此处时间为升温至160℃后的处理时间)，固液分离；收集提取液。

S2、酶解：

在步骤S1中收集得到的提取液加入第二复合酶(第二复合酶的添加量为香菇子实体原料重量的1‰(即500g*1/1000＝0.5g)，α淀粉酶与转化酶的质量比3：1)，50℃酶解35min，升温至≥90℃(不超过100℃)，保温5min灭酶，固液分离，收集灭酶后液。

S3、柱层析：

将步骤S2制得的灭酶后液以2BV/h的流速过LS-206大孔树脂柱层析，其中灭酶后液的温度保持在60℃，灭酶后液的体积与树脂体积比为6：1，收集上样流出液。

S4、制备β-葡聚糖提取物：

将步骤S3制得的上样流出液减压浓缩至固含浓度30％，加入体积分数为99％乙醇水溶液使溶液乙醇的体积分数为75％，醇沉12h，固液分离；收集沉淀物。

沉淀物加3倍体积水复溶，固液分离，收集溶液；将溶液冷冻干燥，得水溶性β-葡聚糖提取物。

S5、制备核苷类提取物：

将步骤S3中柱层析后的大孔树脂依次用2BV纯水、2.5BV体积分数为70％乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为1BV/h，收集乙醇水洗脱液，减压浓缩干燥得香菇核苷提取物。

本实施例中制得的水溶性β-葡聚糖提取物的重量为46.51g，经试剂盒法检测β-葡聚糖的质量含量为75.41％，提取率为7.01％，α-葡聚糖的质量含量为0.27％。

本实施例中制得的香菇核苷类提取物重量为13.84g，经HPLC检测腺苷含量为6.86％。

实施例2

本实施例为一种菌菇类提取物的制备方法，由以下步骤组成：

S1、微波辅助酶提取：

取香菇子实体原料500g，粉碎至60目，再加入15倍体积(7500mL)的纯水，得原料分散液；

再将原料分散液进行微波辅助酶提取30min后(其中，微波辅助酶提取的微波功率300W，微波辅助酶提取的酶解温度为50℃；微波辅助酶提取的第一复合酶由纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的按照质量比为2.5:1.8:1.2组成；第一复合酶添加量为香菇子实体原料重量得8‰)，再将微波功率调至800W，升温至160℃后(升温时间7min±1min)进行微波灭酶处理3min，固液分离；收集提取液。

S2、酶解：

在步骤S1中收集得到的提取液加入第二复合酶(第二复合酶的添加量为香菇子实体原料重量的3‰，α淀粉酶与转化酶的质量比为3.5：1)，60℃酶解25min，升温至≥90℃(不超过100℃)，保温10min灭酶，固液分离，收集灭酶后液。

S3、柱层析：

将步骤S2制得的灭酶后液以3BV/h的流速过LX-60大孔树脂柱层析，其中灭酶后液的温度保持在50℃，灭酶后液的体积与树脂体积比为8：1，收集上样流出液。

S4、制备β-葡聚糖提取物：

将步骤S3制得的上样流出液减压浓缩至固含浓度40％，加入体积分数为99％乙醇水溶液使溶液乙醇的体积分数为85％，醇沉6h，固液分离；收集沉淀物。

沉淀物加5倍体积水复溶，固液分离，收集溶液；将溶液冷冻干燥，得水溶性β-葡聚糖提取物。

S5、制备核苷类提取物：

将步骤S3中柱层析后的大孔树脂依次用2BV纯水、2.5BV体积分数为50％乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集乙醇水洗脱液，减压浓缩干燥得香菇核苷提取物。

本实施例中制得的水溶性β-葡聚糖提取物的重量为47.20g，经试剂盒法检测β-葡聚糖的质量含量为73.95％，提取率为6.98％，α-葡聚糖的质量含量为0.46％。

本实施例中制得的香菇核苷类提取物重量为13.88g，经HPLC检测腺苷含量为6.85％。

实施例3

本实施例为一种菌菇类提取物的制备方法，由以下步骤组成：

S1、微波辅助酶提取：

取香菇子实体原料500g，粉碎至40目，再加入18倍体积(9000mL)的纯水，得原料分散液；

再将原料分散液进行微波辅助酶提取45min后(其中，微波辅助酶提取的微波功率350W，微波辅助酶提取的酶解温度为55℃；微波辅助酶提取的第一复合酶由纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的按照质量比为2:1.5:1.2组成；第一复合酶添加量为香菇子实体原料重量得6‰)，再将微波功率调至800W，升温至160℃后(升温时间7min±1min)进行微波灭酶处理，微波时间为3min，固液分离；收集提取液。

S2、酶解：

在步骤S1中收集得到的提取液加入第二复合酶(第二复合酶的添加量为香菇子实体原料重量的2‰，α淀粉酶与转化酶的质量比为2：1)，55℃酶解30min，升温至≥90℃(不超过100℃)，保温8min灭酶，固液分离，收集灭酶后液。

S3、柱层析：

将步骤S2制得的灭酶后液以2.5BV/h的流速过LX-60大孔树脂柱层析，其中灭酶后液的温度保持在55℃，灭酶后液的体积与树脂体积比为7：1，收集上样流出液。

S4、制备β-葡聚糖提取物：

将步骤S3制得的上样流出液减压浓缩至固含浓度35％，加入体积分数为99％乙醇水溶液使溶液乙醇的体积分数为80％，醇沉8h，固液分离；收集沉淀物。

沉淀物加4倍体积水复溶，固液分离，收集溶液；将溶液冷冻干燥，得水溶性β-葡聚糖提取物。

S5、制备核苷类提取物：

将步骤S3中柱层析后的大孔树脂依次用2BV纯水、3BV体积分数为60％乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为1～2BV/h，收集乙醇水洗脱液，减压浓缩干燥得香菇核苷提取物。

本实施例中制得的水溶性β-葡聚糖提取物的重量为47.78g，经试剂盒法检测β-葡聚糖的质量含量为73.35％，提取率为7.01％，α-葡聚糖的质量含量为0.41％。

本实施例中制得的香菇核苷类提取物重量为14.23g，经HPLC检测腺苷含量为6.70％。

本实施例的HPLC检测图谱见图1，其中本实施例中腺苷保留时间为9.695min；在1min～8min之前出峰均为与本申请腺苷检测不相关的杂峰。

实施例4

本实施例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：将香菇子实体原料替换为灰树花子实体原料。

本实施例中制得的水溶性β-葡聚糖提取物的重量为50.26g，经试剂盒法检测β-葡聚糖的质量含量为83.89％，提取率为8.43％，α-葡聚糖的质量含量为0.33％。

本实施例中制得的灰树花核苷类提取物重量为20.06g，经HPLC检测腺苷含量为6.33％。

本实施例的HPLC检测图谱见图2，其中本实施例中腺苷保留时间为9.823min；在1min～7min之前出峰和12min～13min的出峰均为与本申请腺苷检测不相关的杂峰。

实施例5

本实施例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：将香菇子实体原料替换为猴头菇子实体原料。

本实施例中制得的水溶性β-葡聚糖提取物的重量为48.14g，经试剂盒法检测β-葡聚糖的质量含量为71.95％，提取率为7.07％，α-葡聚糖的质量含量为0.55％。

本实施例中制得的猴头菇核苷类提取物重量为21.01g，经HPLC检测腺苷含量为5.37％。

本实施例的HPLC检测图谱见图3，其中本实施例中腺苷保留时间为9.620min；在1min～8min之前出峰均为与本申请腺苷检测不相关的杂峰。

对比例1

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：将实施例3中步骤S1中微波辅助酶提取替换为热水回流提取。

即本对比例中步骤S1的具体操作如下：

取香菇子实体原料500g，粉碎至40目，再加入12倍体积(6000mL)的纯水，得原料分散液；在100℃下回流提取2次，1.5h/次；制得提取液。

提取液的纯化过程按照实施例3中步骤S2～S5中操作进行。

本对比例中制得的水溶性β-葡聚糖提取物的重量为43.44g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为41.45％，提取率为3.60％，α-葡聚糖的质量含量为0.22％。

本对比例中制得的香菇核苷类提取物重量为18.75g，经HPLC检测腺苷含量为4.97％。

本对比例直接采用热水回流提取，虽然可以释放部分胞内水溶性β-葡聚糖提取出来，但无法使水不溶β-葡聚糖分解为水溶性β-葡聚糖；同时还会增大极性大的杂质溶出，增大了后续的分离难度，使其提取率以及纯度均比较低。

对比例2

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：将实施例3中步骤S1中微波辅助酶提取替换为微波辅助提取。

即本对比例中步骤S1的具体操作如下：

S1、微波辅助酶提取：

取香菇子实体原料500g，粉碎至40目，再加入18倍体积(9000mL)的纯水，得原料分散液；

再将原料分散液在微波功率350W，微波温度为55℃和微波时间为45min的条件下微波辅助提取后，固液分离；收集提取液。

提取液的纯化过程按照实施例3中步骤S2～S5中操作进行。

本对比例中制得的水溶性β-葡聚糖重量为45.67g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为47.23％，提取率为4.31％，α-葡聚糖的质量含量为0.43％。

本对比例中制得的香菇核苷类提取物重量为18.49g，经HPLC检测腺苷含量为5.15％。

本对比例中采用微波辅助提取，通过微波形成的空洞效应可以破坏部分细胞璧，使胞内水溶性β-葡聚糖较大部分释放，但由于相对于对比例1中热水提取的提取率提高不明显，故其纯度提升也不明显。

对比例3

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：将实施例3中步骤S1中微波辅助酶中第一复合酶替换为纤维素酶。

本对比例中制得的水溶性β-葡聚糖重量为47.25g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为50.65％，提取率为4.79％，α-葡聚糖的质量含量为0.39％。

本对比例中制得的香菇核苷类提取物重量为17.80g，经HPLC检测腺苷含量为5.32％。

本对比例中微波辅助单一酶提取，通过单一纤维素酶与微波协同提取可以破坏部分细胞璧，使胞内水溶性β-葡聚糖较大部分释放，但由于单一纤维素酶的酶解效果不明显，也导致微波灭酶改性促使水不溶β-葡聚糖分解成水溶性β-葡聚糖的效果也不明显，整体提取率提高也不明显，故其纯度提升也不明显。

对比例4

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：不进行步骤S2，即步骤S1完成后直接进行步骤S3。

本对比例中水溶性β-葡聚糖重量为58.48g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为50.46％，提取率为5.90％，α-葡聚糖的质量含量为9.74％。

本对比例中香菇核苷类提取物重量为18.45g，经HPLC检测腺苷含量为5.10％。

本对比例中未进行S2步骤，微波辅助复合酶提取，对细胞壁和细胞膜产生破坏，使细胞壁疏松，有效提高了胞内水溶性β-葡聚糖的溶出，再结合微波灭酶改性，有效促使部分水不溶β-葡聚糖分解成水溶性β-葡聚糖，从而较明显的提高了β-葡聚糖的提取率，同时非β-葡聚糖提取率也增高，由于未进行步骤S2，无法将非β-葡聚糖分解成小分子多糖，增大了后续的分离难度，也影响了分离过程中β-葡聚糖的得率，最终导致水溶性β-葡聚糖明显提高，纯度提升反而不明显。

对比例5

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：除提取方式为微波辅助提取后微波改性。

即本对比例中步骤S1的具体操作如下：

S1、微波辅助酶提取：

取香菇子实体原料500g，粉碎至40目，再加入18倍体积(9000mL)的纯水，得原料分散液；

再将原料分散液在微波功率350W，微波温度为55℃和微波时间为45min的条件下微波辅助提取后，再将微波功率调至800W，升温至160℃后(升温时间7min±1min)进行微波改性处理，微波时间为3min，固液分离；收集提取液。

提取液的纯化过程按照实施例3中步骤S2～S5中操作进行。本对比例中水溶性β-葡聚糖重量为47.14g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为59.25％，提取率为5.59％，α-葡聚糖的质量含量为0.34％。

本对比例中香菇核苷类提取物重量为17.75g，经HPLC检测腺苷含量为5.36％。

本对比例中采用微波辅助提取，虽然微波辅助提取一定程度可以破坏疏松细胞壁，有益于提升微波改性的效果，同时微波改性也一定程度增加部分杂质的溶出，但结合后续分离手段，提升了水溶性β-葡聚糖的提取率及纯度；但在未添加复合酶的基础上，由于微波辅助对细胞壁产生破坏并未达到实验预期，导致后续微波改性效果不理想，从而影响水溶性β-葡聚糖的提取率与纯度。

对比例6

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：不进行微波灭酶处理，即步骤S1中参数如下：

S1、微波辅助酶提取：

取香菇子实体原料500g，粉碎至40目，再加入18倍体积的纯水，得原料分散液；

再将原料分散液进行微波辅助酶提取45min后(其中，微波辅助酶提取的微波功率350W，微波辅助酶提取的酶解温度为55℃；微波辅助酶提取的第一复合酶由纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的按照质量比为2:1.5:1.2组成；第一复合酶添加量为香菇子实体原料重量得6‰)，升温至≥90℃(不超过100℃)灭酶10min，固液分离；收集提取液。

本对比例中水溶性β-葡聚糖重量为48.33g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为60.83％，提取率为5.88％，α-葡聚糖的质量含量为0.41％。

本对比例中香菇核苷类提取物重量为18.20g，经HPLC检测腺苷含量为5.21％。

本对比例中采用微波辅助复合酶提取，可以有效提高促使胞内水溶性β-葡聚糖的溶出，相比于采用常规技术灭酶(常规灭酶只是起到灭酶的效果，微波灭酶既可以达到灭酶的效果，又可以起到改性的作用，使水不溶的β葡聚糖结构分解或变化，增加其溶解度，从而提高水溶性β-葡聚糖提取率的效果)，减少了杂质的溶出，降低了后续分离难度，故可以明显提高水溶性β-葡聚糖的提取率和纯度。

对比例7

本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：第一复合酶中木聚糖酶酶活力为2万U/g(南宁庞博生物工程有限公司)。

本对比例中水溶性β-葡聚糖重量为49.26g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为54.96％，提取率为5.41％，α-葡聚糖的质量含量为0.27％。

本对比例中香菇核苷类提取物重量为19.13g，经HPLC检测腺苷含量为4.85％。

本对比例中酶活力较低，相同的添加量，酶的作用效果达不到预期，影响水溶性β-葡聚糖的溶出，导致提取率较低，从而影响其纯度不够。

对比例8

本对比例中本对比例为一种菌菇类提取物的制备方法，与实施例3的差异在于：第一复合酶中木聚糖酶酶活力为20万U/g(南宁庞博生物工程有限公司)。

本对比例中水溶性β-葡聚糖重量为51.66g，经试剂盒法检测β-葡聚糖含量为57.12％，提取率为5.90％，α-葡聚糖的质量含量为0.35％。

本对比例中香菇核苷类提取物重量为19.53g，经HPLC检测腺苷含量为4.82％。

本对比例中酶活力越高，则相同添加量酶过量，酶的作用受限，同时过多的酶会分解已经溶出的水溶性β-葡聚糖的糖苷键，导致提取率下降，从而影响其纯度不够。

综上所述，本发明提供了一种菌菇类提取物的制备方法，将菌菇子实体原料中水溶性β-葡聚糖充分提取分离，且制备方法安全性好，通用性和生产实用性强，还同时能综合利用原料中核苷类成分。

上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (3)

1.一种菌菇类提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将菌菇类子实体原料、第一复合酶和溶剂混合后，依次进行微波辅助酶提取和微波灭酶，制得提取液；

S2、将步骤S1制得的提取液和第二复合酶混合后酶解，制得酶解液；

S3、将步骤S2制得的酶解液采用大孔树脂柱层析后，收集上样流出液，得β-葡聚糖提取物；

S4、将步骤S3所述柱层析后的大孔树脂洗脱后制得菌菇类核苷提取物；

所述第一复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的混合酶，其中，纤维素酶的酶活力为5万U/g～15万U/g，木聚糖酶的酶活力为5万U/g～15万U/g，木瓜蛋白酶的酶活力为5万U/g～15万U/g；纤维素酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶的质量比为1：0.6～0.9：0.4～0.6；

所述第一复合酶与所述菌菇类子实体原料的质量比为1～2:250；

所述溶剂为水；

所述微波辅助酶提取的微波功率为300W～400W，提取温度为50℃～60℃，提取时间为30min～45min；

所述微波灭酶的微波功率为750W～850W，温度为160℃～180℃，时间为2min～3min；

所述第二复合酶为α-淀粉酶和转化酶的混合酶，其中，α-淀粉酶的酶活力为1.5万U/g～2.5万U/g，转化酶的酶活力为5万U/g～15万U/g；α-淀粉酶和转化酶的质量比为2～3.5:1；

所述第二复合酶与所述菌菇类子实体原料的质量比为1～3:1000；

所述酶解的温度为50℃～60℃，时间为25min～35min，pH为4.0～5.5；

所述洗脱依次采用水和体积分数为50％～70％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液。

2.根据权利要求1所述的菌菇类提取物的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂包括LS-206和LX-60中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的菌菇类提取物的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂柱层析的流速为2BV/h～3BV/h。

Images