CN107501428A - 一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法。依次包括以下步骤：a、取蛹虫草子实体，采用超声醇提法对蛹虫草子实体进行超声固液萃取；b、抽滤并弃去滤液，对滤渣进行超声水提；c、抽滤并合并滤液；d、浓缩滤液至设定体积，再用乙醇醇沉，得到醇沉液；e、将醇沉液离心，弃上清，干燥沉淀，得到蛹虫草多糖。本提取方法保持蛹虫草所含多糖成分的生物活性。不会引起生物活性物质失活或变性。本发明所采用的提取试剂均为无毒试剂，安全环保。本发明可以在提取时就达到提取、脱色、脱蛋白等作用，减少了单独的脱色脱蛋白的工艺步骤，工艺简单化。

Description

一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草子实体多糖高效环保绿色的提取改进方法，具体涉及一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法。

背景技术

蛹虫草又名北冬虫夏草，是著名的食药用菌，虫草多糖是其重要的生物活性成分，虫草多糖具有抗氧化活性、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖和降血脂等方面的应用。

现有的蛹虫草多糖的提取有醇提和水提，其中又有煎煮法、索氏抽提法、微波辅助提取法和超声波提取法等方法，但是这些提取方法在提取时会同时提取出大量的色素和水溶性蛋白等杂质，一般采用的处理方法有石油醚脱脂、乙醚脱脂、过氧化氢脱色、活性炭脱色、三氯甲烷-正丁醇脱蛋白等方法；工艺步骤大体分为三个部分：提取、脱脂脱色、脱蛋白；但是这些方法都存在如下几个缺点：

1、脱蛋白涉及低毒类有机试剂及二类易制毒有机试剂，且存在脱蛋白脱色效率低，需要反复多次萃取，工艺繁琐，损失量大，而且容易有机试剂残留的问题及环境危害等。

2、过氧化氢脱色方法中过氧化氢属于强氧化剂，可能存在破坏多糖中的某些活性物质的风险。

3、活性炭脱色时间长，脱色效率低，需多次脱色，脱色繁琐，且对多糖亦有一定的吸附作用，多糖损失量大。

4、石油醚、乙醚等有机试剂沸点低，且有易燃易爆的风险，对提取条件及提取环境要求高，存在一定的风险。

发明内容

本发明提供了一种开发高效、绿色的蛹虫草子实体多糖提取筛选方法。

为了解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，依次包括以下步骤：

a、取蛹虫草子实体，采用超声辅助双水相萃取法对蛹虫草子实体进行萃取；

b、抽滤并弃去滤液，加水对滤渣进行超声水提；

c、抽滤并合并滤液；

d、浓缩滤液至设定体积，再用乙醇醇沉，得到醇沉液；

e、将醇沉液离心，弃上清，干燥沉淀，得到蛹虫草多糖。

进一步，超声辅助双水相萃取法为：用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取。

进一步，用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取20～40分钟。

进一步，超声水提的步骤为：在步骤a中按照重量份取10～30份蛹虫草子实体；在步骤b中向滤渣中加入10-30份水，进行超声萃取。

进一步，超声水提20～40分钟。

进一步，醇沉时乙醇的用量是滤液的3～4倍。

进一步，在步骤b中抽滤1-5次。

与现有技术相比本发明的优点是：

超声水提的蛹虫草多糖对乳腺癌细胞具有一定的生长抑制作用，并且采用超声提取的方法的提取温度较其他提取方法的温度条件低，条件较温和，溶剂为水，原材料试剂也更易获得和经济。

本专利采用的是高聚物与无机盐组成的双水相的萃取方法，并结合超声波辅助提取的方法对蛹虫草子实体多糖进行提取。本发明具有以下几方面的优点：

1、本提取方法保持了蛹虫草所含多糖成分的生物活性。

2、传质和平衡速度快，回收率高。

3、大量杂质能与固体物质一起去掉，该萃取分配技术与其他常用固液分离方法相比，可省去多个分离步骤，使整个提取分离纯化过程更经济。

4、含水量高，一般为75％-90％，在接近生理环境的体系中进行萃取分离，不会引起生物活性物质失活或变性。

5、易于连续化操作及等比扩大生产量。

6、本发明所采用的提取试剂均为无毒试剂，安全环保。

7、本发明提取后无有机溶剂残留及提取试剂毒性物质残留。

8、本发明所采用形成双水相的试剂亦可循环利用，更经济。

9、本发明可以在提取就同时达到提取、脱色、脱蛋白等作用，减少了单独的脱色脱蛋白的工艺步骤，工艺简单化。

附图说明

图1为发明的流程示意图。

图2为硫酸-苯酚法标准曲线图。

图3为考马斯亮蓝法检测蛋白含量的标准曲线图。

图4为不同质量分数的活性炭的脱色实验图。图中左侧立柱为多糖损失率，中间立柱为脱色率，右侧立柱为质量损失率。

图5多糖溶液与sevage试剂体积比均为5:1时，不同体积比的sevage试剂在sevage法脱蛋白实验中的脱蛋白时的质量损失率和脱蛋白率实验图。图中左侧立柱为质量损失率，右侧立柱为脱蛋白率。

图6多糖溶液与sevage试剂体积比均为4:1时，不同体积比的sevage试剂在sevage法脱蛋白实验中的脱蛋白时的质量损失率和脱蛋白率实验图。图中左侧立柱为质量损失率，右侧立柱为脱蛋白率。

图7三氯甲烷-正丁醇组成的sevage试剂体积均为5:1时，多糖溶液与sevage试剂体积比不同时的sevage法脱蛋白的质量损失率与脱蛋白率实验图。图中左侧立柱为质量损失率，右侧立柱为脱蛋白率。

图8三氯甲烷-正丁醇组成的sevage试剂体积均为4:1时，多糖溶液与sevage试剂体积比不同时的sevage法脱蛋白的质量损失率与脱蛋白率实验图。图中左侧立柱为质量损失率，右侧立柱为脱蛋白率。

图9为聚乙二醇4000-硫酸铵双水相相图。

图10为聚乙二醇6000-硫酸铵双水相相图。

图11为聚乙二醇4000-硫酸镁双水相相图。

图12为聚乙二醇6000-硫酸镁双水相相图。

具体实施方式

实施例一：

参阅图1，一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，依次包括以下步骤：

a、按照重量取蛹虫草子实体10份，采用超声辅助双水相萃取法对蛹虫草子实体进行萃取；超声辅助双水相萃取法为：用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取20分钟。

b、抽滤2次并弃去滤液，对滤渣进行超声水提；超声水提的具体步骤为：向滤渣中加入10份(重量份)水，超声水提20分钟。

c、抽滤并合并滤液；

d、浓缩滤液至设定体积，再用是滤液倍量的乙醇醇沉，得到醇沉液；

e、将醇沉液离心，弃上清，干燥沉淀，得到蛹虫草多糖。

实施例二：

一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，依次包括以下步骤：

a、按照重量取蛹虫草子实体15份，采用超声辅助双水相萃取法对蛹虫草子实体进行萃取；超声辅助双水相萃取法为：用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取30分钟。

b、抽滤3次并弃去滤液，对滤渣进行超声水提；超声水提的具体步骤为：向滤渣中加入20份(重量份)水，超声提取30分钟。

c、抽滤并合并滤液；

d、浓缩滤液至设定体积，再用是滤液4倍量的乙醇醇沉，得到醇沉液；

e、将醇沉液离心，弃上清，干燥沉淀，得到蛹虫草多糖。

实施例三：

一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，依次包括以下步骤：

a、按照重量取蛹虫草子实体30份，采用超声辅助双水相萃取法对蛹虫草子实体进行萃取；超声辅助双水相萃取法为：用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取40分钟。

b、抽滤5次并弃去滤液，对滤渣进行超声水提；超声水提的具体步骤为：向滤渣中加入30份(重量份)水，超声提取40分钟。

c、抽滤并合并滤液；

d、浓缩滤液至设定体积，再用是滤液4倍量的乙醇醇沉，得到醇沉液；

e、将醇沉液离心，弃上清，干燥沉淀，得到蛹虫草多糖。

实验一：按照硫酸-苯酚法标准曲线的方法对蛹虫草多糖的糖含量测定实验

(1)硫酸-苯酚法标准曲线：精确称取已经干燥至恒重的无水葡萄糖50mg，置于500mL的容量瓶中，加RO水稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL，各以RO水补至1.0mL，然后精密吸取0.5mL 6％重蒸苯酚水溶液，再加入浓硫酸3.5mL，摇匀后沸水浴30min，再冷水浴10min，用紫外-可见分光光度计法于490nm波长处检测吸光度，重复测量3次。空白对照以RO水代替糖溶液。以无水葡萄糖作为标准品，以葡萄糖浓度(μg/mL)为X轴，以吸光度A为Y轴，绘制标准曲线，结果葡萄糖浓度在0～90μg/mL时得到回归方程：y＝0.0154x+0.0063，其中R²＝0.9996，硫酸-苯酚法标准曲线图如图2所示。

(2)按照硫酸-苯酚法标准曲线的方法对蛹虫草多糖的糖含量测定：按照硫酸-苯酚法标准曲线的方法精密移取待测的蛹虫草多糖提取液1mL，然后精密吸取0.5mL 6％重蒸苯酚水溶液，再加入浓硫酸3.5mL，摇匀后沸水浴30min，再冷水浴10min，照紫外-可见分光光度计法，在490nm的波长处检测吸光度，重复测量3次。空白对照以RO水代替待测的多糖溶液。根据硫酸-苯酚法绘制的标准曲线的回归方程计算待测多糖溶液的浓度及多糖提取率。多糖的提取率按以下公式计算：

式中：C—样液中多糖浓度

M—蛹虫草子实体粉末质量

V1—定容体积，mL

V2—样液稀释倍数。

实验二：蛋白含量的检测实验

(1)考马斯亮蓝法标准曲线制作：

试剂配置：取考马斯亮蓝G2500.01g，加乙醇5ml溶解后，加磷酸10ml，加水稀释至100ml，混匀；滤过，取滤液，得酸性染色液。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。

对照品溶液的制备：取牛血清白蛋白标准品(sigma)，加RO水溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。

测定方法：精密量取对照品溶液0.0mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL，分别置10mL具塞玻璃刻度试管中，各加水至0.1mL，再分别加入酸性染色液5.0mL，立即混匀，照紫外-可见分光光度法，立即在595nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。本实验采用考马斯亮蓝法检测提取的蛹虫草多糖中的蛋白含量。以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，以牛血清白蛋白浓度(μg/mL)为X轴，以吸光度A为Y轴，绘制标准曲线，结果蛋白浓度在0～100μg/mL时得到回归方程：y＝0.0078x+0.0059，其中R2＝0.9991，考马斯亮蓝法检测蛋白含量的标准曲线图如图3所示。

蛹虫草多糖的蛋白含量检测：检测方法同考马斯亮蓝法标准曲线的检测方法：将提取的蛹虫草多糖溶液配制成1mg/mL的供试品溶液，精密量取供试品溶液0.1mL，再分别加入酸性染色液5.0mL，立即混匀，照紫外-可见分光光度法，立即在595nm的波长处测定吸光度；同时以RO水代替供试品溶液作为空白对照。根据考马斯亮蓝法绘制的标准曲线的回归方程计算供试品溶液的蛋白含量。

实验三：多糖的分离纯化实验

活性炭脱色：精密称取提取的蛹虫草多糖干燥品125mg，定容至25ml，即得5mg/ml的超声水提多糖溶液。分别取6个干燥洁净的50ml锥形瓶，依次编号为1、2、3、4、5、6，分别精密移取40ml的该多糖溶液与上述锥形瓶中，然后分别按照上述编号的锥形瓶依次按w/v加入0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的活性炭，再分别将上述编号的多糖溶液于60℃水浴30min，并不时地振摇，然后取出锥形瓶冷却至室温后过滤，用可见-紫外分光光度法在450nm的波长处检测吸光度。实验结果如图4所示。

如图4所示，随着加入的活性炭的量增大，脱色效率也逐渐增加，但是多糖损失率和质量损失率也随之增加，由此可见，在活性炭质量分数为0.5％时，虽然脱色效率不是最高，但多糖的损失率和质量损失率都最低，而且本文主要考察的是多糖的提取工艺，所以脱色温度60℃，活性炭质量分数0.5％，水浴时间30min是活性炭脱色的最佳条件。

实验四：Sevage法除蛋白实验

除蛋白常用的方法有Sevage法、三氯乙酸法以及三氟三氯乙烷法等，三氯乙酸法操作简单，去除效率高，但此法反应较为剧烈，在酸性条件下多糖易降解。Sevage法较为常用，此法利用蛋白质在有机溶剂中易发生变性的特点，向多糖溶液中加入一定体积的Sevage试剂进行萃取，除去杂质蛋白质。

本实验中通过对Sevage法除蛋白中的Sevage试剂(三氯甲烷-正丁醇)的比例和Sevage试剂与待测多糖溶液体积比进行考察，并从中筛选出脱蛋白效率较高的Sevage法除蛋白条件。

取4支干燥洁净的50ml的刻度离心管，分别编号为1、2、3、4，再分别精密移取已配制好提取的5mg/mL的蛹虫草多糖溶液各20ml于已编好号的50mL的刻度离心管中，然后依次加入三氯甲烷-正丁醇(4:1)4mL、三氯甲烷-正丁醇(4:1)5mL、三氯甲烷-正丁醇(5:1)4mL、三氯甲烷-正丁醇(5:1)5mL，剧烈振摇30min，离心5min(4000r/min)，离心静置分层，再吸出水相溶液，重复三遍除蛋白，收集水相溶液，各取0.1mL脱蛋白后的溶液按照考马斯亮蓝法检测提取的蛹虫草多糖脱蛋白前后的蛋白含量。实验结果如图5、图6、图7和图8所示。

备注：图5和图6均表示当多糖溶液与sevage试剂体积一定时，三氯甲烷-正丁醇组成的sevage试剂的体积比不同时的质量损失率和脱蛋白率。图7和图8均表示在三氯甲烷-正丁醇组成的sevage试剂的体积比一定时，多糖溶液与sevage试剂的体积比不同时的质量损失率与脱蛋白率。

图5：多糖溶液与sevage试剂体积比均为5:1时，不同体积比的sevage试剂在sevage法脱蛋白实验中的脱蛋白时的质量损失率和脱蛋白率。

图6：多糖溶液与sevage试剂体积比均为4:1时，不同体积比的sevage试剂在sevage法脱蛋白实验中的脱蛋白时的质量损失率和脱蛋白率。

图7：三氯甲烷-正丁醇组成的sevage试剂体积均为5:1时，多糖溶液与sevage试剂体积比不同时的sevage法脱蛋白的质量损失率与脱蛋白率。

图8：三氯甲烷-正丁醇组成的sevage试剂体积均为4:1时，多糖溶液与sevage试剂体积比不同时的sevage法脱蛋白的质量损失率与脱蛋白率。

如图5、图6、图7和图8所示，当三氯甲烷-正丁醇(5:1)组成的Sevage试剂与多糖溶液的体积比例为(1:5)的脱蛋白率较好，当三氯甲烷-正丁醇(5:1)组成的Sevage试剂与多糖溶液的体积比例为(1:5)的质量损失率较低。故Sevage试剂[三氯甲烷-正丁醇(5:1)]与多糖溶液体积比为1:5时的脱蛋白效率最佳。

实验五：对不同分子量的聚乙二醇与不同的盐形成的双水相的相图考察

如图9至图12。图9为聚乙二醇4000-硫酸铵双水相相图，图10为聚乙二醇6000-硫酸铵双水相相图，图11为聚乙二醇4000-硫酸镁双水相相图，图12为聚乙二醇6000-硫酸镁双水相相图。

从图9、图10、图11和图12中的各双水相体系的相图分析可知：

(1)在相同无机盐溶液与聚乙二醇形成的双水相条件来看，随着聚乙二醇相对分子质量的增加，整体双水相体系的成相临界浓度越低，即聚乙二醇6000较聚乙二醇4000与硫酸铵形成的双水相条件的临界浓度低。

(2)就不同分子量的聚乙二醇与无机盐的成相容易程度与成相时间也有一定的不同，聚乙二醇6000的成相速度较聚乙二醇4000的成相速度快，聚乙二醇6000较聚乙二醇4000的成相时间短。

(3)在聚乙二醇分子量相同的条件下，硫酸铵较硫酸镁的临界成相浓度低。

(4)综上所述，通过对上述各双水相体系相图的考察分析，聚乙二醇6000-硫酸铵双水相体系为筛选出的最佳的双水相体系。

通过实验一至实验五，用双水相固液萃取法与超声波辅助提取法相结合对蛹虫草多糖提取，结果对比发现：

用双水相固液萃取前处理之后提取的蛹虫草多糖较直接用超声波水提取蛹虫草多糖的脱色率可达34.96％，脱蛋白率可达59.3％。

而用筛选出的Sevage法的最佳脱蛋白的条件对蛹虫草多糖的脱蛋白率只有36.36％(结果如图5、图6、图7和图8所示)，脱色效率不高，而且存在脱蛋白次数多，涉及到三氯甲烷等易制毒类的有机试剂。

活性炭脱色法筛选出的最佳脱色条件中的脱色率为7.32％，多糖损失率为8.37％，脱色过程中占提取产物中的质量损失率为6.8％(结果如图4所示)，存在脱色时间长，脱色效率低和多糖易被活性炭吸收而造成质量损失等问题。

综上所述，采用双水相固液萃取与超声波辅助提取法提取蛹虫草多糖，不仅可以减少提取过程中的工艺步骤而同时达到脱蛋白和脱色的目的，而且本提取方法过程中不涉及到易制毒等有机试剂，提取方法安全、环保。

以上所述仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (7)

1.一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

a、取蛹虫草子实体，采用超声辅助双水相萃取法对蛹虫草子实体进行萃取；

b、抽滤并弃去滤液，加水对滤渣进行超声水提；

c、抽滤并合并滤液；

d、浓缩滤液至设定体积，再用乙醇醇沉，得到醇沉液；

e、将醇沉液离心，弃上清，干燥沉淀，得到蛹虫草多糖。

2.根据权利要求1所述的一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，超声辅助双水相萃取法为：用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取。

3.根据权利要求2所述的一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，用硫酸铵-聚乙二醇6000双水相体系对蛹虫草子实体进行超声波辅助固液萃取20～40分钟。

4.根据权利要求1所述的一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，超声水提的步骤为：在步骤a中按照重量份取10～30份蛹虫草子实体；在步骤b中向滤渣中加入10-30份水，进行超声萃取。

5.根据权利要求4所述的一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，超声水提20～40分钟。

6.根据权利要求1所述的一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，醇沉时乙醇的用量是滤液的3～4倍。

7.根据权利要求1所述的一种高效的蛹虫草子实体多糖提取方法，其特征在于，在步骤b中抽滤1-5次。