CN102731666A - 一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法 - Google Patents

一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，是将蛹虫草粉碎，加水混合于30～80℃在酶液或碱液中浸提，离心分离，不溶物重复提取，合并上清液。于50～75℃淀粉酶酶解，离心分离后上清液浓缩至含糖1.5～3.0％，加乙醇，0～4℃下醇沉，离心后干燥得产品。经脱蛋白，透析后，得到虫草粗多糖。可以采用单一酶、双酶、复合酶和超声波酶法，酶可选用蛋白酶，胰蛋白酶等。本发明优化了提取虫草多糖的工艺路线，提高了虫草多糖的得率及提取效率，有效地进行虫草多糖提取、分离纯化。本发明既对农业废弃物的利用提供了一种解决途径，也为虫草多糖的进一步开发提供了技术基础。

Description

一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，更具体地说，涉及从蛹虫草培养基中提取多糖的方法。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)又称北冬虫夏草，属于子囊菌亚门(Asconlycotina)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳菌目(Sphaeriales)、麦角菌科(Claviciptiaceae)、虫草属(Cordyceps)与冬虫夏草(Cordyceps Sinensis(Berk)Sacc)同属异种。能够产生多种生物活性物质：多糖、甘露醇、虫草素、甾类等。近年来，蛹虫草人工培养及其活性成分的研究尤为活跃。
虫草多糖是一类高分子复合物，它作为蛹虫草的主要活性成分之一，是蛹虫草中含量最高的药理活性物质。大量药理学实验表明，虫草多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、保护肾脏、镇痛及抗放作用。
人工栽培的蛹虫草在营养生长阶段在培养基内长着大量的菌丝体，据研究菌丝体中含量最多的活性成分就是虫草多糖。
目前国内外公开报道的有关蛹虫草培养基中虫草多糖的提取，都只限于热水浸提，或利用超声波等辅助物理方法，提取率相对较低，而且其中混有大量的淀粉未经出去，影响虫草多糖的品质。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺方法，以蛹虫草大米或小麦培养基残基为原料，有效提取虫草多糖，并将其进行有效的分离纯化。
为了达到上述目的，本发明提供一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，包括如下步骤：
Step 1、原料处理：利用蛹虫草匀浆制得浆料或者制得干粉；
Step 2、利用所述浆料或干粉基于碱液提取法或酶提取法提取虫草多糖，获得虫草多糖提取液；
Step 3、对所述虫草多糖提取液基于中温淀粉酶清除淀粉，灭活分离，得上清液；
Step 4、将所述上清液，真空浓缩至多糖含量为1.5～3.0％；
Step 5、向浓缩液中加入乙醇，至乙醇最终浓度75～80％，在0～4℃温度下，醇沉12～16小时；
Step 6、醇沉后，以3000～4000转/分钟离心分离，蒸干乙醇，得沉淀状虫草粗多糖。
此外为了得到干燥的虫草粗多糖或粉状产品，Step 6之后可以采取如下步骤：
Step 7、所述沉淀状虫草粗多糖经喷雾干燥或者在-10～-50℃的温度下真空干燥，得到干燥的虫草粗多糖。
Step 8、所述干燥的虫草粗多糖经粉碎制得粉状虫草粗多糖产品。
而为了获得精制虫草多糖，Step 6之后可以采取Step 9、所述沉淀状虫草粗多糖配置成溶液，混合三氯乙酸溶液，在0～4℃条件下振摇后，离心分离，取上清液部分的多糖溶液；重复以上脱蛋白步骤，混合上清液，利用乙醇醇沉后离心分离，取沉淀配成3～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
优选方式下，Step 9的具体工艺参数及过程如下：所述沉淀状虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，在4℃条件下缓慢加入10％三氯乙酸溶液，体积比为5∶1，搅拌；在此4℃条件下振摇10分钟后，在4℃条件下高速离心10分钟，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量为0.5％。而后向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉12～16小时，高速离心，取沉淀，配成3～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
此外，为了获得精制虫草多糖，Step 6之后还可以采取Step 10、所述沉淀状虫草粗多糖配置成溶液，加入胃蛋白酶，用HCl调pH1.5～3.0、温度37～42℃条件下，酶解后于90～98℃灭酶，冷却至室温，用NaOH溶液调至中性，离心分离，取上清液利用乙醇醇沉，离心分离，取沉淀配成2～5％的溶液，以体积比为4～5∶1的比例加入氯仿与正丁醇体积比为4～5∶1的Sevag试剂，振摇后静置，离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤，而后利用乙醇醇沉，离心分离，取沉淀配成2～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
优选方式下，Step 10的具体工艺参数及过程如下：所述沉淀状虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，加入溶液重量的0.05～1％的胃蛋白酶，用6mol/L的HCl调pH1.5～3.0％，在37℃条件下酶解1～6小时；而后于90～98℃灭酶10分钟，冷却至室温，用NaOH溶液调至中性，离心10分钟，取上清液，加入3～4.5倍体积95％乙醇，在0～4℃的温度下，醇沉12～16小时左右。离心，取沉淀，配制成2～5％的溶液，加入Sevag试剂，剧烈振摇20分钟，静置30分钟，离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量至0.5％；而后向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉12～16小时，高速离心，取沉淀，配成2～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
Step 3的优选工艺过程为：向所述虫草多糖提取液加入水解液重量0.05～3.00％的中温淀粉酶，每500～1000mL提取液加入1～10％CaCl2溶液1～5mL，于50～75℃酶解1～2小时，而后在90～98℃条件下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，获得上清液待用。
此外，本发明还提供了如下多种实现Step 2的方法：
A、基于碱液提取法实现步骤S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，混匀，以0.5～1mol/L的NaOH或KOH调节pH值为8～9，在40～60℃下，浸提2～6小时后，3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离后的沉淀再加10～40倍的水，调节pH值8～9，重复上述浸提、分离操作1～2次，合并所得上清液，调节pH至中性获得所述虫草多糖提取液。
B、基于单酶提取法实现S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水；选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种，用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围，加入酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；而后调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离，所得沉淀加水10～40倍重复上述酶解、分离步骤1～2次，合并几次分离的上清液，即为所述虫草多糖提取液。
C、基于双酶提取法实现S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水；选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种，选用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围，加入所选的酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；再选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的第二种，以碱液或酸液调节pH值至所述第二种酶的适宜范围，加入所述第二种酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；而后调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离，所得沉淀加水10～40倍重复上述酶解、分离步骤1～2次，合并几次分离的上清液，即为所述虫草多糖提取液。
D、基于复合酶提取法实现S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水；选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的2～3种，而且所述2～3种酶的适宜pH值和温度相近；用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围，加入所述2～3种酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；而后调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离，所得沉淀加水10～40倍重复上述酶解、分离步骤1～2次，合并几次分离的上清液，即为所述虫草多糖提取液。
此外，Step 2在选用的酶提取法中，在所述浆料或干粉加入重量20～100倍的水之后，首先在20～80℃浸提2～6小时，而后实施上述B-D任一一种具体的酶提步骤。
或者，Step 2在选用的酶提取法中，在所述浆料或干粉加入重量20～100倍的水之后，首先在20～80℃浸提2～6小时，用20～30KHZ超声波处理30～60分钟；3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离得沉淀；而后基于沉淀加入重量20～100倍的水后实施上述B-D任一一种具体的酶提步骤。
本发明通过蛹虫草培养基残基的处理、提取、醇沉、干燥而得的虫草多糖，粗多糖经除蛋白、分离纯化而得虫草精制多糖。本发明有益效果在于：
1、工艺合理，开创了酶法为主从虫草培养基残基中提取虫草多糖的方法，最大限度将培养基中的虫草多糖提取出来；
2、在提取工艺上，广泛地研究并确定了多种有效的提取方法；
3、系统的研究并确定了蛹虫草培养基多糖的分离纯化方法，为丰富食用菌药物作了前期的铺垫；
4、为提高虫草多糖的经济效益提供了技术基础，虫草培养基残基得到充分利用，无废弃物排放，环保增益。
具体实施方式
本发明从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，详细过程如下：
一、原料处理：
原料蛹虫草培养基，新鲜品、干燥品均可。新鲜品可加入5～20倍水以捣碎机捣碎并匀浆制成浆料；干燥品可将其冻干或烘干、粉碎，为粒度在60目以下的干粉，待用。
二、虫草多糖的提取
提取虫草多糖的方法采用碱液提取法和酶提取法。
1、碱液提取法
向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，混匀，以0.5mol/L的NaOH或KOH调节pH为8～9，在40～60℃下，浸提2～6小时后，离心分离得上清液和沉淀。沉淀再加10～40倍的水，用NaOH或KOH调节pH值至8～9，重复上述操作1～2次，合并所得上清液，用HCl调节pH至中性待用。
2、酶提取法
酶提取法是向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，用酶在所用酶适宜的pH值和温度等条件下进行酶解，所用的酶可以是单酶、双酶或复合酶，也可与上述提取法相结合，均可达到提取的母体。所述的单一酶、双酶、复合酶的品种为胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶等。
(1)单、双、复合酶酶解法
1)单酶酶解法：向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，以6mol/L的HCL调pH为1～4，加入原料重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在30～45℃下搅拌酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；再以0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却至20～30℃后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用，上清液可用NaOH或KOH调整pH值为中性。其他品种酶(胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶)的酶解操作同上，只是用碱液或酸液调至所用酶适宜范围。
2)双酶酶解法：向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，以6mol/L的HCL调pH为1～4，加入原料重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在30～45℃下搅拌酶解1～4小时，水解时保持上述pH值；再以0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为7～9，加入原料重量0.05～3.00％的胰蛋白酶，在30～45℃水浴搅拌酶解1～4小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调节pH至中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。其他双酶酶解法操作同上，只是用碱液和酸液调到所用酶适宜的pH范围。
3)复合酶酶解法
向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，以6mol/L的HCL调节pH为1～4，加入胃蛋白酶、酸性蛋白酶，添加量为溶液重量的0.05～3.00％，两种酶的比例为1∶1，在30～45℃下，搅拌酶解1～4小时后，调节pH至中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。其他复合酶酶解法操作同上，只是用碱液和酸液调至所用酶适宜的pH范围，同时调节温度于所用酶适宜的范围。
一种复合酶酶解法的实施例为：经处理后的蛹虫草培养基浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，以0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调节pH为7～9，加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，添加量为溶液重量的0.05～3.00％，三种酶的比例为1.0∶0.1～1.0∶0.1～1.0，在20～60℃下，搅拌酶解1～4小时后，调节pH至中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并。
(2)结合提取法
1)水提和双酶结合法：向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，在20～80℃浸提2～6小时；以6mol/L的HCL调pH为1～4，加入原料重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在30～45℃下搅拌酶解1～4小时，水解时保持上述pH值；再以0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为7～9，加入原料重量0.05～3.00％的胰蛋白酶，在30～45℃水浴搅拌酶解1～4小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调节pH至中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。其他双酶酶解法操作同上，只是用碱液和酸液调到所用酶适宜的pH范围。
上述操作由于两种酶水解时需要的pH值不同，所以分前后两次酶解；如果两种酶的最适pH和最适温度相近，则可加两种酶，一次酶解即成。如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解时需要pH值均为7～9，温度均为37℃，则可以在这一pH值及温度下同时加入这两种酶。
2)超声波和单酶结合法：向浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，用20～30KHZ超声波处理30～60分钟，离心分离得到上清液和沉淀。向不溶物中再添加20～100倍的水，用6mol/L的HCl调节pH至1～4，加入原料重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在30～45℃下搅拌酶解1～4小时，水解时保持上述pH值；再以0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。
由上述操作可知，超声波、碱液和单酶、双酶及复合酶都是从虫草培养基中提取虫草多糖的可行方法，仅仅需要调整酶的最适合的pH值及酶的添加量。
上述所有离心分离均为3000～4000转/分钟高速离心10分钟左右的操作。
三、虫草多糖提取液淀粉的清除及浓缩
1、淀粉的清除
向提取液加入原料重量0.05～3.00％的中温淀粉酶(如α淀粉酶)，每1000mL提取液加入2％CaCl2溶液1～5mL。于50～75℃酶解1～2小时后于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，上清液待用。
2、浓缩
将上述所得的离心上清液，真空浓缩至多糖含量为1.5～3.0％。
四、虫草多糖的醇沉
向浓缩液中加入3～4倍体积的95％乙醇，至最终乙醇浓度为75～80％，在0～4℃温度下，醇沉12～16小时。
五、虫草粗多糖的离心
醇沉后的多糖，3000～4000转/分钟高速离心10分钟左右，蒸干乙醇，得到的沉淀即虫草粗多糖。
六、虫草粗多糖的干燥
虫草粗多糖的干燥可以用以下任一方法均可达到目的：
1、将纯化得到的离心沉淀，在-10～-50℃的温度下，真空干燥，得到干燥的虫草粗多糖干品。
2、将纯化得到的离心沉淀，用水稀释至比重为1.05～1.10左右，进行喷雾干燥，喷雾干燥设备入口温度160～180℃，出口温度50～60℃，得到干燥的虫草粗多糖。
如果需要，还可将上述得到的虫草多糖，用粉碎机粉碎至160目以下。
此时，用本发明的方法提取的虫草多糖为粗多糖，浅棕色粉末，多糖提取率为10％～30％(干品比)，多糖含量为20～47％，水溶性较好。可在食品行业广泛应用。如果再进一步纯化、脱蛋白，多糖含量可以更高，则可以应用于药品行业。
七、除蛋白及小分子，包括如下两种方法：
(1)将上述提取的虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，在4℃条件下缓慢加入10％三氯乙酸溶液，体积比为5∶1，搅拌。在此温度下振摇10分钟后，4℃条件下高速离心10min，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量0.5％以下，向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉过夜，高速离心，取沉淀，配成3～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
(2)将上述提取的虫草粗多糖或经浓缩配制成2～10％的溶液，加入溶液重量的0.05～1％的胃蛋白酶，用6mol/L的HCl调pH1.5～3.0％、温度37℃条件下，酶解1～6小时后，于90～98℃灭酶10分钟，冷却至室温，用NaOH溶液调至中性，离心10分钟，取上清液，加入3～4.5倍体积95％乙醇，在0～4℃的温度下，醇沉12～16小时左右。离心，取沉淀，配制成2～5％的溶液，加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝5∶1)，体积比为5∶1，剧烈振摇20min，静置30min，然后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量0.5％以下，向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉过夜，高速离心，取沉淀，配成2～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥即得精制虫草多糖。
实例1(碱液提取法)
取蛹虫草培养基干粉100g，加入重量2000mL水，混匀，以0.5mol/L的NaOHpH为9，在60℃下，浸提4小时后，离心分离得上清液和沉淀。沉淀再加1000mL的水，调节pH9，重复上述操作1～2次，合并所得上清液，调节pH至中性，加入2g中温淀粉酶，2mL 2％Cacl2于70℃水解60分钟后，90℃灭酶5分钟，冷却，高速离心10分钟。上清液浓缩至多糖含量4％(苯酚硫酸法检测)；加入3倍浓缩液体积95％乙醇，4℃下沉淀12小时后4000转/分钟离心10分钟，得到离心沉淀。将此沉淀于-50℃真空冷冻干燥得虫草粗多糖5.5g。苯酚硫酸法测其糖量为8.1％。
实例2(单酶法)
蛹虫草培养基干粉100g，加水8000mL，调节pH值为2.0，加入胃蛋白酶2g，在37℃下水解4小时后，调节pH值为7.0，90℃灭酶10分钟，冷却，4000转/分钟离心10分钟得上清液和沉淀，沉淀加水100mL重复上述操作1～2次，合并上清液。上清液加入0.2g中温淀粉酶，于70℃水解60分钟后，90℃灭酶5分钟，冷却，4000转/分钟离心10分钟。上清液浓缩至80mL，加入95％乙醇240mL，4℃下沉淀12小时后4000转/分钟离心10分钟，得到离心沉淀-50℃真空干燥得粗多糖15.8g，将此粗多糖用水稀释至50mL，加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝5∶1)10mL，剧烈振摇20min，静置30min，然后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤2次，此时多糖溶液中蛋白含量0.35％，向溶液中加入95％乙醇260mL，于4℃下醇沉12小时后4000转/分钟离心。将此沉淀溶于30mL水，7000Da透析48小时后，-50℃真空冷冻干燥，得虫草粗多糖13.1g，苯酚硫酸法测其多糖含量为47.1％。
实例3(双酶法)
取新鲜蛹虫草培养基100g，捣碎后加水200mL，匀浆后加入1800mL的水，以6mol/L的HCL调pH为2.0，1g胃蛋白酶，在38℃下搅拌酶解1～4小时，水解时保持pH值2.0；再以0.5mol/L的NaOH溶液调pH为8.0，加入原料重量1g的胰蛋白酶，在37℃水浴搅拌酶解4小时，水解时保持pH值8.0；酶解后用酸调节pH至中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀加水500mL重复上述步骤2次，合并上清液，调节pH至中性，加入1g中温淀粉酶，于70℃水解60分钟后，90℃灭酶5分钟，冷却，高速离心10分钟。上清液浓缩至4％糖含量(苯酚硫酸法)后，加入3倍浓缩液体积95％乙醇，4℃下沉淀12小时后4000转/分钟离心10分钟，得到离心沉淀用水稀释至比重1.1，-50℃冷冻干燥，得干燥虫草多糖8.6g，苯酚硫酸法测其糖含量43.6％。
实例4(复合酶法)
取蛹虫草培养基干粉100g，加入水2000mL，以6mol/L的HCl调节pH值为2.5，加入胃蛋白酶2g、酸性蛋白酶2g，于40℃下搅拌酶解3小时后，调节pH至中性于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀加水500mL重复上述步骤2次，合并上清液，调节pH至中性，加入1g中温淀粉酶，于70℃水解60分钟后，90℃灭酶5分钟，冷却，高速离心10分钟。上清液浓缩至4％糖含量(苯酚硫酸法)后，加入3倍浓缩液体积95％乙醇，4℃下沉淀12小时后4000转/分钟离心10分钟，得到离心沉淀用水稀释至比重1.1，-50℃冷冻干燥，得干燥虫草多糖11.2g，苯酚硫酸法测其糖含量41.9％。
实例5(结合法)
取蛹虫草培养基干粉100g，加入2000mL水，用20～30KHZ超声波处理40分钟，离心分离得到上清液和沉淀。向沉淀物中再添加2000mL的水，用0.5mol/L的NaOH调节pH至8.0，加入2g胰蛋白酶，在38℃下搅拌酶解3小时，水解时保持上述pH值；再以HCl溶液调pH为中性，于90～98℃下灭活10分钟，冷却后离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀加水500mL重复上述步骤2次，离心分离得上清液合并待用，加入1g中温淀粉酶，于70℃水解60分钟后，90℃灭酶10分钟，冷却，高速离心10分钟。上清液浓缩至4％糖含量(苯酚硫酸法)后，加入3倍体积95％乙醇，4℃下沉淀12小时后4000转/分钟离心10分钟，得到离心沉淀以水稀释至1.1比重，-50℃真空冷冻干燥，得虫草粗多糖9.8g，苯酚硫酸法测其多糖含量为26.3％。
实例6
取蛹虫草培养基干粉100g，加入重量2000mL水，于80℃浸提4小时后，以6mol/L的HCL调pH为2，加入2g胃蛋白酶，在38℃下搅拌酶解3小时，水解时保持上述pH值；再以0.5mol/L的NaOH溶液调pH为8，加入2g胰蛋白酶，在38℃搅拌酶解4小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调节pH至中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后4000转/分钟离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并。加入1g中温淀粉酶，于70℃水解60分钟后，90℃灭酶10分钟，冷却，4000转/分钟离心10分钟。上清液浓缩至4％糖含量(苯酚硫酸法)后，加入3倍体积95％乙醇，4℃下沉淀12小时后4000转/分钟离心10分钟，得到离心沉淀以水稀释至1.1比重，-50℃真空冷冻干燥，得虫草粗多糖10.3g，苯酚硫酸法测其多糖含量为38.3％。
实例7
取实例1所得虫草多糖5g，加入水50mL溶解，加入0.1g胃蛋白酶，以6mol/LHCl调pH为2.0、温度38℃下，酶解4小时后，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，冷却至室温，用0.5mol/LNaOH溶液调至中性，离心10分钟，取上清液，加入200mL 95％乙醇，在0℃的温度下，醇沉12小时。离心，取沉淀，加水50mL，加入Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇＝5∶1)10mL，剧烈振摇20min，静置30min，然后离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤2次，至多糖溶液中蛋白含量0.5％以下，向溶液中加入200mL95％的乙醇醇沉12，高速离心，取沉淀，加水100克，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得浅棕色粉末3.9g，为精制虫草多糖。
实例8
取如实例1得到的虫草多糖5克，加入水50mL，在4℃条件下缓慢加入10％三氯乙酸溶液，体积比为5∶1，搅拌。在此温度下振摇10min后，4℃条件下高速离心10min，取上清液重复以上脱蛋白步骤2次，至多糖溶液中蛋白含量0.5％以下，向溶液中加入160mL95％的乙醇，醇沉12小时，高速离心，取沉淀，加水50mL，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥浅色精制虫草多糖2.1g。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、原料处理：利用蛹虫草匀浆制得浆料或者制得干粉；
S2、利用所述浆料或干粉基于碱液提取法或酶提取法提取虫草多糖，获得虫草多糖提取液；
S3、对所述虫草多糖提取液基于中温淀粉酶清除淀粉，灭活分离，得上清液；
S4、将所述上清液，真空浓缩至多糖含量为1.5～3.0％；
S5、向浓缩液中加入乙醇，至乙醇最终浓度75～80％，在0～4℃温度下，醇沉12～16小时；
S6、醇沉后，以3000～4000转/分钟离心分离，蒸干乙醇，得沉淀状虫草粗多糖。
2.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S6之后还包括：S7、所述沉淀状虫草粗多糖经喷雾干燥或者在-10～-50℃的温度下真空干燥，得到干燥的虫草粗多糖。
3.根据权利要求2所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S7之后还包括：S8、所述干燥的虫草粗多糖经粉碎制得粉状虫草粗多糖产品。
4.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S6之后还包括去除蛋白及小分子的步骤：
S9、所述沉淀状虫草粗多糖配置成溶液，混合三氯乙酸溶液，在0～4℃条件下振摇后，离心分离，取上清液部分的多糖溶液；重复以上脱蛋白步骤，混合上清液，利用乙醇醇沉后离心分离，取沉淀配成3～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
5.根据权利要求4所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S9的具体步骤为：所述沉淀状虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，在4℃条件下缓慢加入10％三氯乙酸溶液，体积比为5∶1，搅拌；在4℃条件下振摇10分钟后，在4℃条件下高速离心10分钟，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量为0.5％；
而后向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉12～16小时，高速离心，取沉淀，配成3～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
6.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S6之后还包括去除蛋白及小分子的步骤：
S10、所述沉淀状虫草粗多糖配置成溶液，加入胃蛋白酶，用HCl调pH1.5～3.0、温度37～42℃条件下，酶解后于90～98℃灭酶，冷却至室温，用NaOH溶液调至中性，离心分离，取上清液利用乙醇醇沉，离心分离，取沉淀配成2～5％的溶液，以体积比为4～5∶1的比例加入氯仿与正丁醇体积比为4～5∶1的Sevag试剂，振摇后静置，离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤，而后利用乙醇醇沉，离心分离，取沉淀配成2～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da～8000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
7.根据权利要求6所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S10的具体步骤为：所述沉淀状虫草粗多糖配置成2～10％的溶液，加入溶液重量的0.05～1％的胃蛋白酶，用6mol/L的HCl调pH1.5～3.0，在37℃条件下酶解1～6小时；而后于90～98℃灭酶10分钟，冷却至室温，用NaOH溶液调至中性，离心10分钟，取上清液，加入3～4.5倍体积95％乙醇，在0～4℃的温度下，醇沉12～16小时左右；
离心，取沉淀，配制成2～5％的溶液，加入Sevag试剂，剧烈振摇20分钟，静置30分钟，离心除去沉淀，取上清液重复以上脱蛋白步骤数次，至多糖溶液中福林酚法检测蛋白含量至0.5％；
而后向溶液中加入4.5倍体积95％的乙醇醇沉12～16小时，高速离心，取沉淀，配成2～5％的多糖液，在截留分子量为7000Da的透析袋内透析48～72小时，透析后，袋内液浓缩，冷冻干燥得精制虫草多糖。
8.根据权利要求1所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S3的具体步骤为：向所述虫草多糖提取液加入水解液重量0.05～3.00％的中温淀粉酶，每500～1000mL提取液加入1～10％CaCl2溶液1～5mL，于50～75℃酶解1～2小时，而后在90～98℃条件下灭活5～10分钟，冷却后离心分离，获得上清液待用。
9.根据权利要求1-8任一所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，基于碱液提取法实现步骤S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水，混匀，以0.5～1mol/L的NaOH或KOH调节pH值为8～9，在40～60℃下，浸提2～6小时后，3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离后的沉淀再加10～40倍的水，调节pH值8～9，重复上述浸提、分离操作1～2次，合并所得上清液，调节pH至中性获得所述虫草多糖提取液。
10.根据权利要求1-8任一所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，基于单酶提取法实现S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水；选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种，用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围，加入酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；
而后调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离，所得沉淀加水10～40倍重复上述酶解、分离步骤1～2次，合并几次分离的上清液，即为所述虫草多糖提取液。
11.根据权利要求1-8任一所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，基于双酶提取法实现S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水；选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的一种，选用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围，加入所选的酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；
再选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的第二种，以碱液或酸液调节pH值至所述第二种酶的适宜范围，加入所述第二种酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；
而后调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离，所得沉淀加水10～40倍重复上述酶解、分离步骤1～2次，合并几次分离的上清液，即为所述虫草多糖提取液。
12.根据权利要求1-8任一所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，基于复合酶提取法实现S2的具体步骤为：
向所述浆料或干粉中加入重量20～100倍的水；选用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶或者胰蛋白酶中的2～3种，而且所述2～3种酶的适宜pH值和温度相近；
用碱液或酸液调节pH值至所选用酶的适宜范围，加入所述2～3种酶搅拌酶解，酶解时保持pH值；
而后调pH为中性，于90～98℃下灭活5～10分钟，冷却后3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离，所得沉淀加水10～40倍重复上述酶解、分离步骤1～2次，合并几次分离的上清液，即为所述虫草多糖提取液。
13.根据权利要求1-8任一所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S2在选用的酶提取法中，在所述浆料或干粉加入重量20～100倍的水之后，首先在20～80℃浸提2～6小时，而后实施具体的酶提步骤。
14.根据权利要求1-8任一所述从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，其特征在于，步骤S2在选用的酶提取法中，在所述浆料或干粉加入重量20～100倍的水之后，首先在20～80℃浸提2～6小时，用20～30KHZ超声波处理30～60分钟；3000～4000转/分钟离心10～15分钟分离得沉淀；而后基于沉淀加入重量20～100倍的水后实施具体的酶提步骤。
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