CN108641006A - 一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法 - Google Patents

一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，该方法包括以下步骤：将蛹虫草大米培养基下脚料粉碎后加水回流提取，将提取液浓缩，加入乙醇静置过夜，离心取沉淀为蛹虫草培养基多糖提取物；多糖提取物加入H2O2脱色，然后加入木瓜蛋白酶酶解，再加入Sevage试剂，离心取上清，为粗多糖；上离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，得到多个多糖组分。采用本发明的方法可以完成大通量的多糖提取操作，适用于工业化大规模生产，DEAE离子交换层析柱分离效果好，重复性好，所得到的多糖组分纯度高、性质稳定。

Description

一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法。
背景技术
蛹虫草(C.militaris)又称北虫草，分类学上属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目，与北冬虫夏草同属麦角科虫草属，主要分布在我国东北、华北、西北等地区。蛹虫草可寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫的幼虫或蛹体上，能采用家蚕蛹、大米培养基等进行人工批量培育。
由于天然的蛹虫草资源有限，目前人工栽培的较多，主要有三种培养方法：(1)采集野生的蛹虫草，进行菌种的分离、纯化，然后将蛹虫草菌种接种在含蚕蛹粉的大米等固体培养基上，在一定的温度、湿度和光照条件下，培养35-45d获得蛹虫草子实体；(2)将蛹虫草菌种接种在家蚕幼虫或活蛹体内，在一定的温度、湿度和光照条件下，培养35-45d获得蛹虫草子实体；(3)以大豆粉蔗糖或玉米浆蔗糖为培养基，采用液体发酵培养蛹虫草。
我国采用人工方法培养蛹虫草子实体的生产已有相当规模，但在子实体收获的同时，也产生了大量的蛹虫草培养基下脚料，不仅造成环境的污染，也是不可忽视的资源浪费。
研究表明，蛹虫草培养基下脚料中含有虫草素、虫草多糖等生物活性物质。因此为了更好地开发利用蛹虫草资源，提高经济效益，完善蛹虫草产业链，对蛹虫草培养基下脚料的利用和研究开发已成为必要。
中国专利申请(申请号201110086808.2)公开了一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法，利用不同的酶液来去除蛹虫草培养基中的蛋白、淀粉，再经醇沉得到蛹虫草培养基粗多糖；其操作过程复杂，成本较高，且不能将多糖进一步分离纯化，无法得到纯度较高的多糖组分。
发明内容
本发明的目的是提供一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，利用超声波辅助水提醇沉法对蛹虫草废弃培养基进行多糖提取，并通过离子交换层析法对多糖进行分离纯化，由此提取分离出纯度较高、具有生物活性的多糖组分。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：
(1)提取蛹虫草培养基多糖：将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎，过筛得下脚料干粉；称取干粉加入15-16倍质量的蒸馏水，超声波处理30min以上，在70-80℃下回流提取1.5-2.0h，提取若干次合并提取液，提取液过滤后浓缩，得到多糖浓缩液；在多糖浓缩液中加入3-4倍体积的95％(V/V)乙醇，搅拌后于4℃中静置过夜；离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物；
步骤(1)所述的过筛优选过40目筛；
步骤(1)所述的浓缩优选在50-55℃下浓缩；
步骤(1)所述的离心优选5000r/min离心15min；
(2)蛹虫草培养基多糖的脱色：将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0-8.5，滴加H2O2溶液至无色，50-55℃保温2h以上；
步骤(2)所述的H2O2溶液，浓度优选30％(V/V)；
(3)酶法结合Sevage法脱蛋白：
3-1：将木瓜蛋白酶溶液与蛹虫草培养基多糖提取液混合，两者的体积比为1.0:1.5～1.0:1.7，60-70℃酶解2-3h；
所述的木瓜蛋白酶溶液用pH值6.0的PBS缓冲液配制而成，其中木瓜蛋白酶的浓度优选250U/ml；
3-2：在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂，振荡培养30min以上，然后多次离心直至无蛋白沉淀析出为止，取上清液，烘干得到蛹虫草培养基粗多糖；
步骤(3)所述的Sevage试剂，是氯仿和正丁醇按体积比5:1配制而成；
步骤(3)所述的振荡培养，摇床转速优选150r/min；
步骤(3)所述的离心优选4000r/min离心20-30min；
(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化：将蛹虫草培养基粗多糖用蒸馏水溶解后上DEAE琼脂糖凝胶FF(DEAE Sephrose Fast Flow)离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，得到多个多糖组分；
步骤(4)所述的梯度洗脱，NaCl溶液的浓度分别是0、0.1、0.3、0.5、0.7、1mol/L；
多糖的分离纯化不仅是一个除杂的过程，同时也是将混合多糖分离为单一组分的过程。柱层析法可分为离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换层析是依据离子电荷密度的不同而进行分级分离，阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电，因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应，而阳离子交换剂则反之。
将琼脂糖凝胶与DEAE(二乙基氨基乙基)结合成为弱碱型离子交换剂，其填料带有正电荷，在低盐条件下可以通过电荷相互作用吸附多糖样品中的阴离子和负电荷物质。这些带负电的物质由于其带电量不同，分子大小不同，因此与正电填料之间的结合力也就不同。当用氯离子(通常是NaCl溶液)洗脱样品时，氯离子会和填料结合上的负电荷物质竞争结合正电填料，伴随着氯离子浓度的不断升高，氯离子的竞争作用越来越强，与填料结合的多糖就会按照亲和力从弱到强依次被洗脱下来，形成独立的洗脱峰，从而将粗多糖分离开来，得到不同的组分。这是梯度洗脱的原理。
本发明通过水提醇沉法得到蛹虫草培养基粗多糖，利用离子交换层析柱进行粗多糖的分离纯化，相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明充分利用了培养蛹虫草而产生的培养基下脚料，符合变废为宝的绿色环保理念，建立了一条完整可行的蛹虫草培养基多糖提取、分离纯化、理化性质、结构和生物活性研究的技术路线，完善了人工培养蛹虫草产业的残渣处理工艺，为食用菌多糖的提取分离纯化提供了技术指导。
(2)本发明所用的水提醇沉法可以完成大通量的多糖提取操作，成本较低，重复性好，得率高，适用于工业化大规模生产。
(3)本发明所用的DEAE Sephrose Fast Flow理化稳定性和机械性能更好，交换容量大，可以在位清洗，床体积随pH值的离子强度变化很小，由于流速和载量高，适合于进行大量粗产品的纯化工作。
(4)采用本发明的提取方法不影响蛹虫草培养基多糖的生物活性，所得到的多糖纯品在抗氧化、降尿酸、抑菌方面具有显著效果，有益于人体代谢；成本较低，多糖纯品可进一步用于保健品、药品、化妆品的开发。
(5)本发明创造性地将多糖的水提醇沉提取方法与离子交换层析分离纯化方法结合起来用于蛹虫草培养基下脚料多糖的研究，比较并得到较优的工艺参数，并确定DEAESephrose Fast Flow作为层析柱填料，为蛹虫草培养基下脚料多糖的提取分离纯化提供技术指导和新思路。
附图说明
图1是蛹虫草培养基多糖的洗脱曲线图。
图2是多糖P1的紫外光谱图。
图3是多糖P2的紫外光谱图。
图4是多糖P1的红外光谱图。
图5是多糖P2的红外光谱图。
图6是蛹虫草培养基多糖的ABTS自由基清除能力。
图7是蛹虫草培养基多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果；
图8是蛹虫草培养基多糖对绿脓杆菌的抑菌实验结果；
其中，1-多糖P1产生的抑菌圈，2-多糖P2产生的抑菌圈，0-对照组。
具体实施方式
下面结合实施例及图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，所得到的蛹虫草培养基多糖组分P1、P2的理化性质分析由中国广州分析测试中心进行，报告编号分别为2018001306-1b、2018001306-2b。
实施例1
一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，包括以下步骤：
(1)提取蛹虫草培养基多糖：称取55g蛹虫草大米培养基下脚料充分干燥后粉碎，过40目筛，称取50g干粉加入800ml的蒸馏水，超声30min，在70℃下回流提取1.5h，提取3次合并滤液，真空抽滤后于55℃下浓缩至100ml，得到多糖浓缩液；在多糖浓缩液中加入400ml的95％乙醇，不断搅拌使多糖均匀沉淀，于4℃中静置过夜；5000r/min离心15min后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物；
(2)蛹虫草培养基多糖的脱色：将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解配成浓度为0.05g/ml的多糖提取液，加入NaOH调节pH值至8.0，滴加30％的H2O2至无色，50℃下保温2h；
(3)酶法结合Sevage法脱蛋白：
精确称取木瓜蛋白酶0.1g，用pH值6.0的PBS缓冲液溶解成终浓度为250U/ml的溶液，与蛹虫草培养基多糖提取液混合，酶液与蛹虫草培养基多糖提取液的体积比为1.0:1.5，64℃下酶解3h；
在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝5:1)，置于摇床150r/min振荡30min后4000r/min离心20min，重复离心多次直到无蛋白沉淀析出，合并上清液，50℃下烘干得到蛹虫草培养基粗多糖；
(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化：
称取0.1g蛹虫草培养基粗多糖溶于10ml蒸馏水中，上DEAE Sephrose FastFlow离子交换层析柱，分别用浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速为0.5ml/min，每10min收集1管，以苯酚-硫酸法逐管检测多糖含量，依据洗脱曲线(图1)合并，得到两个蛹虫草培养基多糖组分；
苯酚-硫酸法检测多糖含量具体操作：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品0.1g，置于100ml容量瓶中加蒸馏水溶解并定容，摇匀，配成1mg/ml的标准品溶液备用。取该溶液分别稀释成10、20、40、60、80、100μg/ml不同浓度的标准溶液。分别吸取上述溶液各1ml置于试管中，加入6％苯酚溶液0.5ml并混匀，再加入2.5ml浓硫酸混匀，室温静置20min，以蒸馏水为空白对照，于490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。未知样品用标准曲线法测定多糖含量。
将洗脱得到的多糖组分浓缩、透析后冷冻干燥，得到两个蛹虫草培养基多糖纯品P1和P2。
实施例2
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行紫外光谱分析，各称取1mg多糖样品，配制1mg/mL多糖溶液，扫描在200-800nm范围内紫外图谱。
图2为P1的紫外光谱图，图3为P2的紫外光谱图，结果显示，P1在260nm、280nm处有微弱的吸收峰，表明P1含有微量的蛋白质和核酸；P2在260nm、280nm处均无明显的吸收峰，表明P2不含蛋白质和核酸物质。
实施例3
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行多糖分子量分析，具体实验方法如下：
采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定分子量。称取冷冻干燥的多糖样品2mg，加0.02M磷酸缓冲液溶解，配制成2.0mg/mL溶液，用0.22μm无菌滤膜过滤，取过滤清液待用。
色谱条件：柱温35℃；0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0)为流动相，流速0.6ml/min，进样量20μL；TSK凝胶保护柱(40mm×6.0mm)，
TSKG-4000K凝胶柱(300mm×7.8mm)和TSKG-2500K凝胶柱(300mm×7.8mm)；Waters2414示差折光检测器检测。配制一系列不同分子量的葡聚糖溶液(700,400,200,100,50,30,10,5kD)作为标样，做标准曲线。样品的分子量根据其相应的洗脱体积对照标准曲线进行计算。
结果表明，蛹虫草培养基多糖P1的平均分子量为2.18k Da、P2的平均分子量为16.6kDa。
实施例4
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行单糖组成分析，具体方法如下：
称取多糖样品10mg，加入5mL三氟乙酸(4M)，110℃水解2h。水解液于50℃真空旋转蒸发至干，用色谱纯甲醇清洗3次(加入色谱纯甲醇，再进行旋干，反复3次，直至旋干物质再无三氟乙酸味道)，得多糖水解物。
在多糖水解物中依次加入10mg盐酸羟胺、1mg内标肌醇和2mL吡啶，密封，90℃水浴30min后加入2m L醋酸酐90℃水浴30min，加入2m L水终止反应。加入2m L二氯甲烷萃取，重复2次，合并二氯甲烷相，加入无水硫酸钠干燥，过0.22μm有机微孔滤膜，备用。
采用气相色谱仪分析，分析柱为HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。升温程序如下：进样口温度为250℃，初始柱温100℃，保持0.5min；然后以20℃/min升至140℃，保持5min；以3℃/min速度升至160℃；再以10℃/min速度升到250℃，保持5min。进样体积为1μL；分流比为10:1；流动相为氦气；流速为1mL/min。
各种单糖标准品(鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖)按照相同步骤进行实验，按照相同的检测程度，将处理后的标准品单糖进行气相色谱分析。
测得蛹虫草培养基多糖的单糖组成结果如下表：
表1蛹虫草培养基多糖P1、P2的单糖组成
实施例5
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行傅里叶红外光谱分析。
称取2mg多糖样品，将其与干燥后的KBr(溴化钾)于研钵中混匀研磨，经压片机压成片，采用傅里叶变换红外光谱仪，在400-4000cm-1的波数范围内扫描。
图4为P1的红外光谱图，图5为P2的红外光谱图，在3402、3401cm-1处的峰分别是P1、P2的O-H伸缩振动产生的，而2929cm-1处的峰是由C-H振动产生的，1622、1642cm-1处的峰分别是P1、P2的C＝O伸缩振动产生的，这些都是多糖的特征峰，说明P1和P2属于多糖类物质。
此外，在P1的红外光谱中，1240cm-1处的弱峰是由S＝O的伸缩振动所产生的，这说明P1中存在非常微量的硫酸基，1154cm-1处的峰是环上C-O的吸收峰，1081、1023cm-1的峰是由醇羟基的变角振动产生的，这三个峰说明P1中存在吡喃糖环，850cm-1处的峰表示P1中存在α-型糖苷键。
在P2的红外光谱中，1153cm-1处的峰是环上C-O的吸收峰，1080、1027cm-1的峰是由醇羟基的变角振动产生的，这三个峰说明P2中存在吡喃糖环，862cm-1处的峰表示P2中存在β-型糖苷键。
实施例6
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行抗氧化能力测定(ABTS自由基清除能力测定)：
取7mmol/L ABTS水溶液和2.45mmol/L过硫酸钾水溶液各5mL混合，置于暗处反应12h，产生ABTS自由基，将ABTS自由基溶液稀释并使其在734nm波长条件下的吸光值为0.70±0.02。将1mL不同质量浓度的蛹虫草培养基多糖P1、P2溶液与2mL ABTS自由基溶液混合均匀，10min后测其在734nm处的吸光值，记作A1；2mL ABTS自由基溶液与1mL蒸馏水混合后测定734nm处的吸光值，记作A0；测定2mL蒸馏水与1mL多糖溶液在734nm处的吸光值，记作A2。
清除率：Y＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
图6为蛹虫草培养基多糖的ABTS自由基清除能力。由图6可知，在浓度1.0～5.0mg/ml范围内，两个蛹虫草培养基多糖组分P1和P2具有一定的清除ABTS自由基能力，且与多糖浓度呈正相关。比较两个多糖组分的自由基清除率，P1的ABTS自由基清除能力比P2的强；当多糖浓度为5.0mg/ml时，P1和P2的ABTS自由基清除率分别为85.4％和38.0％。
实施例7
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行降尿酸研究。
(1)高尿酸血症模型的建立
雄性小鼠60只，饲养一周后，随机分为9组，每组10只，依次为空白组、模型组、多糖P1高(400mg/kg)、P1中(200mg/kg)、P1低(100mg/kg)剂量组、多糖P2高、P2中、P2低剂量组以及阳性药物(50mg/kg)对照组。每天上午模型组、阳性对照组、多糖P1、P2高中低剂量组灌胃给予黄嘌呤600mg/kg(ig)+腹腔注射氧嗪酸钾100mg/kg(ip)。造模前一个小时禁食不禁水，空白组给予同等剂量生理盐水。下午多糖P1、P2高、中、低剂量组采用多糖混悬液进行灌胃给药，阳性对照组灌胃给予别嘌醇混悬液50mg/kg，模型组和空白组则灌胃给予同等体积的生理盐水，连续七天
(2)体内生化指标的测定
第七天下午给药1h后称体重，断头取血，室温放置40min后，以3000r/min离心10min，吸取上层血清，采用试剂盒检测血清中尿酸(UA)、血清肌酐(CREA)和血清尿素氮(BUN)值，考察多糖P1和P2对高尿酸血症模型小鼠UA、CREA和BUN及肾功能的影响。
测得蛹虫草培养基多糖的降尿酸作用结果如下表：
表2蛹虫草培养基多糖的降尿酸作用
由表2可以看出，与正常组比，模型组小鼠的血清肌酐、血清尿酸和血清尿素氮水平均显著升高了，建模成功。
与模型组相比，多糖P1的低中高剂量组可使小鼠血清肌酐水平分别下降5.03％、20.19％、32.76％，可使小鼠血清尿酸水平分别下降39.58％、46.46％、53.72％，可使小鼠血清尿素氮水平分别下降22.77％、40.05％、51.59％。
与模型组相比，多糖P2的低中高剂量组可使小鼠血清肌酐水平分别下降2.22％、10.06％、19.01％，可使小鼠血清尿酸水平分别下降3.52％、11.16％、19.80％，可使小鼠血清尿素氮水平分别下降10.22％、22.70％、43.30％。
说明在该实验模型下，蛹虫草培养基多糖P1和P2能够降低高尿酸血症的血清肌酐、血清尿酸和血清尿素氮水平。
实施例8
对实施例1得到的蛹虫草培养基多糖进行抑菌研究。
对常见的致病菌金黄色葡萄球菌(Sa)、绿脓杆菌(Pa)采用打孔法测定抑菌活性。主要操作过程如下：取直径为90mm的培养皿，倒平板后用移液枪取150μl的菌悬液，涂布均匀后每一平板用8mm打孔器打4孔，分别加入40μl备用的1mg/ml蛹虫草培养基多糖P1、P2，对照组则每孔加入40μl生理盐水。置于37℃恒温培养箱内培养24h，用十字交叉法分别测量实验平板及对照平板上各抑菌圈的直径，并计算其平均值。
金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果如图7所示，绿脓杆菌的抑菌实验结果如图8所示，分别为P1、P2、对照组的抑菌效果。测得抑菌圈的直径如表3。
表3抑菌圈直径(cm)
由表3可知，蛹虫草培养基多糖P1、P2对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用，其中P2对金黄色葡萄球菌的抑制作用比P1稍强，而P1对绿脓杆菌的抑制作用比P2稍强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从蛹虫草培养基下脚料中提取并分离纯化多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取蛹虫草培养基多糖：将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎，过筛得下脚料干粉；称取干粉加入15-16倍质量的蒸馏水，超声波处理30min以上，在70-80℃下回流提取1.5-2.0h，提取若干次合并提取液，提取液过滤后浓缩，得到多糖浓缩液；在多糖浓缩液中加入3-4倍体积的95％(V/V)乙醇，搅拌后于4℃中静置过夜；离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物；
(2)蛹虫草培养基多糖的脱色：将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解，调节pH值至8.0-8.5，滴加H2O2溶液至无色，50-55℃保温2h以上；
(3)酶法结合Sevage法脱蛋白：
3-1：将木瓜蛋白酶溶液与蛹虫草培养基多糖提取液混合，两者的体积比为1.0:1.5～1.0:1.7，60-70℃酶解2-3h；
3-2：在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂，振荡培养30min以上，然后多次离心直至无蛋白沉淀析出为止，取上清液，烘干得到蛹虫草培养基粗多糖；
(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化：将蛹虫草培养基粗多糖用蒸馏水溶解后上DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，得到多个多糖组分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的过筛是过40目筛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的浓缩是在50-55℃下浓缩。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的离心是5000r/min离心15min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的H2O2溶液，浓度为30％(V/V)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的木瓜蛋白酶溶液用pH值6.0的PBS缓冲液配制而成，其中木瓜蛋白酶的浓度为250U/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的Sevage试剂，是氯仿和正丁醇按体积比5:1配制而成。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的振荡培养，摇床转速为150r/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的离心为4000r/min离心20-30min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述的梯度洗脱，NaCl溶液的浓度分别是0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mol/L。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810201A (zh) * 2019-03-01 2019-05-28 江南大学 一种蛹虫草中虫草多糖和虫草素的超声波复合酸性水提取方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090121824A (ko) * 2008-05-23 2009-11-26 농업회사법인 하나바이오텍(주) 수용성 베타글루칸의 제조방법
CN101906127A (zh) * 2010-07-23 2010-12-08 上海国宝企业发展中心 一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法
CN102731666A (zh) * 2011-04-07 2012-10-17 大连工业大学 一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法
CN103755825A (zh) * 2014-01-03 2014-04-30 南京晓庄学院 一种从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖的方法及其提取物的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090121824A (ko) * 2008-05-23 2009-11-26 농업회사법인 하나바이오텍(주) 수용성 베타글루칸의 제조방법
CN101906127A (zh) * 2010-07-23 2010-12-08 上海国宝企业发展中心 一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法
CN102731666A (zh) * 2011-04-07 2012-10-17 大连工业大学 一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法
CN103755825A (zh) * 2014-01-03 2014-04-30 南京晓庄学院 一种从废弃蛹虫草培养基质中提取虫草基质多糖的方法及其提取物的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810201A (zh) * 2019-03-01 2019-05-28 江南大学 一种蛹虫草中虫草多糖和虫草素的超声波复合酸性水提取方法

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