CN107573433A - 微藻硫酸酯化复合多糖及其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微藻硫酸酯化复合多糖，由硫酸酯化小球藻多糖：硫酸酯化螺旋藻多糖按1:16‑‑16:1比例混合构成。本发明微藻硫酸酯化复合多糖能有效的抑制肿瘤细胞的体外增殖，并由于具有很好的水溶性，故能在体内发挥作用，能很好的抑制肿瘤的生长。

Description

微藻硫酸酯化复合多糖及其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于海洋生物的医疗应用领域，涉及螺旋藻及小球藻，尤其是一种微藻硫酸酯化复合多糖及其制备方法及其应用。

背景技术

微藻的生长条件和环境特点决定了其胞内多糖具有一些有别于其它生物多糖的结构和功能，此类多糖在医药和医学领域中应用潜力越来越引起人们对其的研究兴趣。但是，近几年大量研究发现，不同来源的微藻多糖具有不同的生物活性，单一多糖生物活性不能全面提升人体的免疫力。

螺旋藻(Spirulina platensis)是一类低等的古老生物，系属于蓝藻门(Cyanophyta)，段殖藻目(Oscillatoriaceae)，颤藻科(Oscillatoriales)，螺旋藻属(Spirulina)或节旋藻(Arthrospira),包括钝顶螺旋藻(S.platensis)和极大螺旋藻(S.maxima)等38个种类。作为地球上出现的最早进行光合作用的生物之一，螺旋藻已有35亿年的历史。

小球藻(Chlorella pyrenoidosa)是一种拥有坚硬细胞壁的单细胞真核生物，直径约3-12μm，系属于绿藻门(Chlorphyta)，绿藻纲(Chlorophyceae)，绿球藻目(Chlorella)，卵胞藻科小球藻属。小球藻广泛的分布在新鲜的淡水和海水中，生物量极大，能利用太阳光能进行自养，在异养条件下，也能利用有机碳源进行生长繁殖。

通过检索，尚未发现有将螺旋藻及小球藻结合用于抗肿瘤活性的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种用于抗肿瘤的微藻硫酸酯化复合多糖及其制备方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种微藻硫酸酯化复合多糖，由硫酸酯化小球藻多糖：硫酸酯化螺旋藻多糖按1:16--16:1比例混合构成。

而且，所述的硫酸酯化小球藻多糖或硫酸酯化的螺旋藻多糖的制备方法为：

(1)称取5-10g硫酸铵晶体，缓慢加入到装有15-30mL正丁醇的烧杯中，磁力搅拌15-40min；然后加入15-30mL浓硫酸，磁力搅拌1-4h；

(2)准确称取1000mg小球藻多糖或螺旋藻多糖放入20-60mL甲酰胺制得悬浮液，与(1)所述溶液混匀磁力搅拌1-4h；

(4)调至溶液pH中性，蒸馏水透析2-4天，旋转蒸发浓缩后加入3-5倍体积的无水乙醇析出沉淀，冷冻干燥得硫酸化酯化多糖。

而且，所述的小球藻多糖或螺旋藻多糖的制备方法包括如下步骤：

(1)螺旋藻或小球藻细胞的破壁：将生长至平台期的螺旋藻或小球藻液离心，称取10-50g藻粉，加入100-800mL蒸馏水，将藻液低温冷冻结块，再80℃水浴加热6-10h解冻和破壁，重复上述过程3次，离心取上清，剩余藻泥震荡后加入蒸馏水超声破壁：500-1000W，每次1-3min，共10-30min，完毕后离心取上清。合并所有上清进行蛋白质等杂质的去除；

(2)去除蛋白质：调节溶液pH至中性并加入含量1％的中性蛋白酶，30-60℃条件下水浴3-5h，离心取上清调至pH值中性，加入1/5-1/2体积三氯甲烷和1/10-1/3体积的异戊醇，震荡10-15h去除杂质蛋白，重复3-5次直到无沉淀产生；

(3)粗多糖的纯化：

①醇沉：在清除杂质蛋白后的溶液中加入3倍体积的无水乙醇，混匀后4℃静置12-24h，离心分别收集上清和沉淀，上清液加入适量无水乙醇6-24h后离心收集沉淀，合并两次收集的沉淀旋转蒸发浓缩，得粗多糖浓缩液；

②透析：粗多糖浓缩液装入前处理的透析袋中，置于蒸馏水中于磁力搅拌器上搅拌透析8-24h；

③冷冻干燥：将预冻的透析物取出放置在干燥架上，将干燥架放置在冷阱上，打开真空泵开始真空干燥；

④采取纤维素DEAE-52阴离子层析进行粗多糖的纯化。

而且，采取纤维素DEAE-52阴离子层析进行粗多糖的纯化的步骤为：

(1)酸碱处理：称取30-100g DE-52阴离子交换剂干粉，超纯水浸泡6-12h换水，倒掉上层悬浮的细小颗粒；配制0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCL溶液调节阴离子凝胶pH值，先用HCL处理至pH值到2-3，后用NaOH处理其pH值达到9-10，最后用超纯水泡胶，多次换水后其pH值为7即可灌柱；

(2)灌柱及上样：关闭层析柱出水口，向柱中加入适量洗脱液，不断搅拌下灌柱，自然沉降后的胶体积应占柱体积的3/4左右；装柱完毕之后胶将粗多糖溶液倒入层析柱中，准备洗脱；

(3)洗脱液收集：选用0.1-0.5mol/L的NaCl作为洗脱液，在梯度混合仪和恒流泵作用下持续洗脱。

本发明同时保护该微藻硫酸酯化复合多糖在抗肿瘤领域的应用。包括体内抗肿瘤及体外抗肿瘤。

尤其是，所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抑制人乳腺癌细胞MCF-7中的应用，浓度≤6.4mg/mL。

尤其是，所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抑制人肝癌细胞HepG2中的应用，浓度≤6.4mg/mL。

尤其是，所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抑制人肺癌细胞A549中的应用，浓度≤6.4mg/mL。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明采用浓硫酸法制备的硫酸酯化螺旋藻多糖和硫酸酯化小球藻多糖，取代度分别为0.42和0.41，傅里叶红外光谱扫描图显示，两种硫酸酯化多糖不但保存了原多糖的结构而且硫酸基团被成功的添加到多糖分子中。

2、本发明能有效的抑制肿瘤细胞的体外增殖，并由于具有很好的水溶性，故能在体内发挥作用，能很好的抑制肿瘤的生长。硫酸酯化程度决定其抗凝血活性的强弱。

3、本发明具有良好的体外抗肿瘤效果，对三种肿瘤细胞人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞A549均有一定的抑制效果，在设定的浓度范围内呈现浓度依赖性，并与螺旋藻单糖相比，说明硫酸酯化后的复合多糖的体外抗肿瘤活性比天然的单一多糖效果好。本发明具有良好的体内抗肿瘤效果，裸鼠成瘤，将人乳腺癌细胞成功转接到小鼠体内，并按低剂量组(0.8mg/mL)、中剂量组(3.2mg/mL)和高剂量组(6.4mg/mL)所设定的浓度灌胃小鼠，并设定空白对照(生理盐水)，用药20之后，解剖小鼠，取出肿瘤，测其肿瘤的瘤重、体积并以此算出其肿瘤抑制率。结果显示高中低剂量组的复合多糖对MCF-7肿瘤细胞有很好的抑制效果。

4、本发明具有良好抗凝血活性。抗凝血活性的检测采用正常饲养的家兔，去家兔血液适当，与复合多糖SCP12水溶液混匀，孵育3min，然后分别加入预温的检测试剂TT、PT和APTT，并设空白对照，结果显示凝固时间显著地缩短，并且浓度越高其凝固时间越长，说明复合多糖SCP12具有非常显著地抗凝血活性，并呈现浓度依赖性。

附图说明

图1为小球藻多糖(CSP)红外光谱图；

图2为硫酸酯化的小球藻多糖(SCSP)红外光谱图；

图3为螺旋藻多糖(PSP)的红外光谱图；

图4为硫酸酯化的小球藻多糖(SPSP)红外光谱图；

图5为不同浓度复合多糖SCP12对HL7702细胞毒性效果；

(图片中a、b、c分别代表正常肝细胞HL7702显微镜图、12.8mg/mL多糖作用后肝细胞HL7702显微镜图和6.4mg/mL多糖作用后肝细胞HL7702显微镜图)

图6-1为多糖对MCF-7细胞生长的抑制作用(n＝6,x±s)；

图6-2为多糖对MCF-7细胞生长的抑制效果

(a、b、c分别代表正常乳腺癌细胞MCF-7显微镜图、6.4mg/mL复合多糖SCP12作用后乳腺癌细胞MCF-7显微镜图和6.4mg/mL多糖PSP作用后乳腺癌细胞MCF-7显微镜图)；

图6-3为多糖对HepG2的细胞生长的抑制作用(n＝6,x±s)；

图6-4多糖对HepG2细胞生长的抑制效果

(图片中a、b、c分别代表正常肝癌细胞HepG2显微镜图、6.4mg/mL复合多糖SCP12作用后肝癌细胞HepG2显微镜图和6.4mg/mL多糖PSP作用后肝癌细胞HepG2显微镜图)；

图6-5多糖对A549的细胞生长的抑制作用(n＝6,x±s)；

图6-6多糖对A549细胞生长的抑制效果

(图片中a、b、c分别代表正常肺癌细胞A549显微镜图、6.4mg/mL复合多糖SCP12作用后肺癌细胞A549显微镜图和6.4mg/mL多糖PSP作用后肺癌细胞A549显微镜图)。

图7为复合多糖SCP12对移植性MCF-7实体瘤小鼠肿瘤的影响。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

1、制备小球藻多糖(CSP)及螺旋藻多糖(PSP)

(1)螺旋藻或小球藻细胞的破壁：将生长至平台期的螺旋藻或小球藻液离心，称取10g藻粉，加入90mL蒸馏水，将藻液先进行-20℃低温冷冻过夜结块，再水浴加热8h解冻和破壁，重复上述过程3次，4500r/min离心10min，取上清，将藻泥震荡，加入蒸馏水后超声破壁：600-800W，每次1min，共10min，完毕后4500r/min离心10min取上清，合并所有上清进行蛋白质等杂质的去除；

(2)去除蛋白质：调溶液的pH至7.0，加入含量1％的中性蛋白酶，50℃条件下水浴2.5h，待反应完全后，5000r/min条件下离心10min，取上清去除杂质沉淀，再将溶液的pH值调至7.0，待反应完全后，加入1/4体积三氯甲烷和1/10体积的异戊醇，震荡10-15h去除杂质蛋白，重复3-5次，直到不出现沉淀；

(3)粗多糖的纯化：

①醇沉：在清除杂质蛋白后的溶液中加入3倍体积的无水乙醇，摇匀，待混匀后放置在4℃的冰箱中静置过夜，在5000r/min条件下离心10min，去上清留沉淀，收集上清液后再次加入适量的无水乙醇放置8-10h后在相同条件下离心，最终合并两次收集的沉淀在旋转蒸发仪中进行旋转蒸发浓缩，最终得粗多糖浓缩液；

②透析：将旋转蒸发浓缩完毕的粗多糖溶液倒入经过前处理的透析袋中，置于3L蒸馏水锥形瓶中于磁力搅拌器上搅拌透析24h；

③冷冻干燥：将预冻的透析物料取出放置在干燥架上，将干燥架放置在冷阱上，打开真空泵开始真空干燥；

④采取纤维素DEAE-52阴离子层析进行粗多糖的纯化。

采取纤维素DEAE-52阴离子层析进行粗多糖的纯化的步骤为：

(1)准确称取60g DE-52阴离子交换剂干粉，用超纯水浸泡，使其能够充分溶胀，5-7小时左右换次水，即用倾泻法倒掉上层悬浮的细小颗粒；

(2)酸碱处理：配制0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的Hcl溶液各1000mL，对阴离子层析的凝胶进行调pH处理，先用酸泡，多次换水后测定胶液的pH值，到达3左右即可，再次用碱泡，重复上述步骤，待其pH值达到9左右即可，最后用超纯水泡胶，多次换水后其pH值为7即可灌柱；

(3)装柱：关闭层析柱的出水口，并向柱子中注入适量的洗脱液，不断搅拌作用下将浓稠浆糊状的胶倒入层析柱中，使之自然沉降，将所有的胶倒入柱子后沉降完毕后的体积约占柱子总体积的3/4左右；

(4)上样：装柱完毕之后要检查柱子内的胶是否均匀，装好后的凝胶柱用0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱，在梯度混合仪和恒流泵作用下持续洗脱，保证流通顺畅。

(5)洗脱及洗脱液的收集：将冷冻干燥完毕的粗多糖溶液倒入层析柱中，柱子装好完毕，开启梯度混合仪和恒流泵，选用0.1mol/L的NaCl作为洗脱液，收集洗脱下来的糖液。

2、制备硫酸酯化的小球藻多糖(SCSP)及硫酸酯化的螺旋藻多糖(SPSP)

(1)准确称取2g硫酸铵晶体，缓慢加入到装有5mL正丁醇的烧杯中，磁力搅拌20min；

(2)再加入10mL浓硫酸，磁力搅拌1h；

(3)准确称取500mg小球藻多糖或螺旋藻多糖放入装有8mL甲酰胺的烧杯中，制得悬浮液，将悬浮液与上述溶液混匀，磁力搅拌2h；

(4)用冷却至4℃的2mol/L NaOH调至pH中性，自来水活水透析2d，蒸馏水透析24h，浓缩，加入浓缩液体积三倍的无水乙醇，析出沉淀，离心，去上清，将沉淀用去离子水复溶，冷冻干燥得硫酸化酯化多糖。

小球藻多糖和硫酸酯化后的小球藻多糖的红外光谱图和分析结果如图1、图2及表1、2所示，硫酸化后的小球藻多糖SCSP在2924.79cm-1和1420.46cm-1处出现这两组峰值，它们是糖类C-H伸缩振动和变角振动引起的。说明硫酸酯化后的小球藻多糖没有破坏糖类化合物结构。与小球藻多糖红外光谱相比，硫酸酯化后的小球藻多糖在623.72cm-1和1261.28cm-1出现峰值，它们分别是硫酸酯化特征峰和S＝O特征峰，表明硫酸基团取代了羟基的氢，硫酸基团已经和多糖结合成酯类衍生物。

表1小球藻多糖红外分析结果

表2硫酸酯化小球藻多糖红外分析结果

螺旋藻多糖和硫酸酯化后的螺旋藻多糖的红外光谱图和分析结果如图3、4及表3、4所示，硫酸酯化后的螺旋藻多糖在2916.02cm-1和1420.05cm-1出现两组峰值，它们糖类C-H的伸缩振动和变角振动，是糖类的特征吸收峰值，据此可以判定SPSP是多糖类化合物。与螺旋藻多糖红外光谱图相比，除保留了S＝O的弱峰伸缩振动外，在624.01cm-1和815cm-1处出现两组峰值，他们分别代表硫酸酯化特征峰和C-O-S基团的伸缩振动，说明硫酸基团已经和多糖结合形成了酯键。

表3螺旋藻多糖红外分析结果

表4硫酸酯化螺旋藻多糖红外分析结果

经浓硫酸法制备的螺旋藻硫酸酯化多糖和小球藻硫酸酯化多糖的硫酸根含量和取代度分别为19.58％、0.42和19.30％、0.41，傅里叶红外光谱扫描图显示，两种硫酸酯化多糖不但保存了原多糖的结构而且硫酸基团被成功的添加到多糖分子中。

3、将硫酸酯化小球藻多糖：硫酸酯化螺旋藻多糖＝1:16--16:1的比例制备成15种复合多糖，按一定顺序分别编号为SCP1、SCP2、SCP3、SCP4、SCP5、SCP6、SCP7、SCP8、SCP9、SCP10、SCP11、SCP12、SCP13、SCP14、SCP15；实验浓度分别为6.4mg/mL、3.2mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP1的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(1～2):(15.6～16)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP2的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(2.5～3):(15～15.5)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP3的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(4.3～5.8):(14.5～14.9)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP4的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(3～4):(14～14.4)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP5的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(4.1～5.8):(13.5～13.9)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP6的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(6～7.5):(13～13.4)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP7的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(7.8～8.5):(12.5～12.9)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP8的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(8～9.8):(12～12.4)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP9的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(10～10.8):(11.6～11.9)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP10的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(11～11.9):(10～11)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP11的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(12～12.8):(9～9.8)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP12的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(13～13.5):(7～8.8)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP13的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(13.6～14):(5.3～6.8)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP14的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(14.3～15):(3～5)混合制成。

硫酸酯化小球藻、螺旋藻复合多糖SCP15的制备方法为：将硫酸酯化小球藻多糖与硫酸酯化螺旋藻复合多糖按照质量比(15～16):(1～2.8)混合制成。

将15种比例复合多糖以不同浓度对人乳腺癌细胞MCF-7处理之后，经MTT法检测，得出15种比例复合多糖在不同浓度下对MCF-7的抑制率如表5所示，不同配比的复合多糖对MCF-7细胞均表现出一定的抑制作用，且呈现浓度依赖性。其中复合多糖SCP12对MCF-7的抑制效果最好，当浓度达到6.4mg/mL时抑制率达到了52.31％。故SCP12为复合多糖筛选的最佳配比多糖。

表5硫酸化复合多糖在不同浓度下对MCH-7的抑制效果(n＝6，x±s)

不同浓度复合多糖SCP12对HL7702正常肝细胞的毒性结果如表6和图5所示。结果表明，在0.4-12.8mg/mL浓度范围内，当浓度为12.8mg/mL时，多糖对HL7702正常肝细胞有毒性，并结合显微镜图像发现对正常肝细胞有明显的毒性作用，RGR为41.6％，毒性为II级；当浓度是6.4mg/mL时，RGR为77.4％，毒性为I级，其显微镜图片下观察细胞生长状态与正常细胞基本无异，其余低浓度对细胞毒性均为0-I级，因此，复合多糖SCP12对细胞最大无毒浓度为6.4mg/mL。

表6不同浓度复合多糖SCP12对HL7702细胞毒性作用(n＝6)

4、复合多糖SCP12的体外抗肿瘤实验

(1)细胞培养与接种：用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基(1％双抗)培养MCF-7细胞、HepG2细胞和A549细胞，胰酶消化收集，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，于37℃5％的CO2培养箱中贴壁培养24～48h。

(2)多糖处理：待细胞生长至对数期，弃上清，用PBS清洗三次。用各浓度的SCP12处理细胞，并设置空白对照和阳性对照组(PSP多糖处理细胞)。每个样本浓度6孔，每孔100μL。于37℃5％的CO2培养箱中培养24～48h，观察。

(3)MTT检测：培养结束后，弃上清液，用PBS清洗一次，每孔加入100μL不完全DMEM培养液，再加入20μLMTT溶液，37℃5％的CO2培养箱中孵育4h后，每孔加入100μLDMSO溶解，室温静置10min，在酶标仪下于570nm处检测光吸收值。

肿瘤细胞抑制率(IR)＝(1-A1/A2)×100％

式中A1为试验孔组吸光值；A2为对照孔吸光值。

复合多糖SCP12的体外抗肿瘤实验结果

复合多糖SCP12及对照组螺旋藻多糖PSP在体外与三种肿瘤细胞共同培养24h，经MTT法检测，如图6-1、6-3、6-5及部分的显微镜图6-2、6-4、6-6所示，复合多糖SCP12和多糖PSP在浓度0.4-6.4mg/mL范围内对三种肿瘤细胞的增殖均有一定的抑制作用，并呈现出浓度依赖性(p＜0.05)，当浓度达到6.4mg/mL时，复合多糖SCP12对三中肿瘤细胞MCF-7细胞、HepG2细胞和A549细胞的抑制率分别为52.31％、39.71％和16.15％，其中对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果明显高于其他两种肿瘤细胞。与对照组相比，复合多糖SCP12对三种肿瘤的抑制率明显高于多糖PSP，说明复合多糖抗肿瘤活性显著高于螺旋藻多糖PSP。

5、复合多糖SCP12的体内抗肿瘤实验

(1)裸鼠成瘤：将32只裸鼠随机的分为4组，A组：对照组，只灌胃生理盐水。B组：高剂量组，灌胃多糖浓度为6.4mg/mL复合多糖SCP12溶液。C组：中剂量组，灌胃多糖浓度为3.2mg/mL复合多糖SCP12溶液。D组：低剂量组，灌胃多糖浓度为0.8mg/mL复合多糖SCP12溶液。每组8只。MCF-7细胞扩增培养，至80％密度为宜。用胰酶消化细胞成单个，计数后用PBS调整浓度到3×107/mL，所用液体均预热。细胞离心5000rpm，5min，弃培养液，取80μL无血清培养基小心混合细胞(总体积约100μL)；然后用1mL注射器吸取细胞悬液，排空气泡，将细胞接种于裸鼠右前肢腋背部皮下，每三天观察一次肿瘤的生长情况。接种12天后，肿瘤直径达到5mm左右时进行治疗实验。

(2)药物处理：A、B、C、D四组分别采取灌胃方式给药，隔日给药，按照10mL/Kg的剂量给药。A组灌胃生理盐水，B、C、D组分别灌胃浓度分别为6.4mg/mL，3.2mg/mL，0.8mg/mL的复合多糖SCP12。20天后处死裸鼠，分离瘤体，测量瘤体大小并称重，计算抑瘤率。

抑瘤率＝(1-给药组小鼠的平均瘤重/肿瘤对照组的平均瘤重)×100％

肿瘤体积＝0.5×最大直径×(最小直径)²

复合多糖SCP12的体内抗肿瘤实验结果

灌胃20天之后，处死小鼠，取出肿瘤细胞称重，并算的肿瘤的体积及肿瘤抑制率如图表7所示，与对照组相比，肿瘤的重量和体积都有明显的下降(p＜0.05)，低剂量组(0.8mg/mL)、中剂量组(3.2mg/mL)h和高剂量组(6.4mg/mL)对肿瘤的抑制率分别是28.77％、71.32％和82.19％，呈现出浓度依赖性。说明复合多糖SCP12对体内肿瘤有非常明显的抑制作用。也体现了两种多糖体内的协同效应。

表7复合多糖SCP12对移植性MCF-7实体瘤小鼠瘤重和瘤体积的影响(n＝8,x±s)

6、复合多糖SCP12的抗凝血实验

(1)制备血浆：饲养健康雌性家兔，体重约3.0±0.5kg，用20％氨基甲酸乙酯(5ml/kg)经耳缘静脉麻醉后行颈总动脉插管，采血118mL，置于含0.109mol/L枸橼酸钠抗凝液0.2mL的硅化离心管中，混匀后，3000r/min离心20min，收集上清液(血浆)。

(2)PT检测：分别取待测血浆与复合多糖SCP12混合液和待测血浆与PSP的混合液0.1mL，37℃孵育3min，加入37℃预温PT试剂0.2mL，记录凝固时间，同时用生理盐水作为对照。

(3)TT检测：分别取待测血浆与复合多糖SCP12混合液和待测血浆与PSP的混合液0.2mL，37℃孵育3min，加入37℃预温TT试剂0.2mL，记录凝固时间，同时用生理盐水作为对照。

(4)APTT检测：分别取待测血浆与复合多糖SCP12混合液和待测血浆与PSP的混合液0.2mL，37℃孵育3min，加入37℃预温预温APTT试剂0.1mL，37℃孵育5min；加入37℃预温的0.025mol/LCaCl2溶液0.1mL，记录凝固时间，同时用生理盐水作为对照。

复合多糖SCP12的抗凝血实验结果

表8为复合多糖SCP12经生理盐水稀释成高浓度(6.4mg/mL)、中浓度(3.2mg/mL)和低浓度(0.8mg/mL)后的凝血指标的检测结果。PT、TT、APTT是医学上常用来确定凝血途径的三项指标。PT反映外源性凝血系统的凝血状况，TT反映血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白的凝血状况，APTT反映内源性凝血系统各凝血成分总的凝血状况。试验结果显示，复合多糖SCP12能显著改善人体的PT值、TT值和APTT值。在实验范围内，检测体系中复合多糖SCP12的浓度越高其抗凝血作用也越强。

表8复合多糖SCP12的抗凝血作用分析

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种微藻硫酸酯化复合多糖，其特征在于：由硫酸酯化小球藻多糖：硫酸酯化螺旋藻多糖按1:16--16:1比例混合构成。

2.根据权利要求1所述的微藻硫酸酯化复合多糖，其特征在于：所述的硫酸酯化小球藻多糖或硫酸酯化的螺旋藻多糖的制备方法为：

(1)称取5-10g硫酸铵晶体，缓慢加入到装有15-30mL正丁醇的烧杯中，磁力搅拌15-40min；然后加入15-30mL浓硫酸，磁力搅拌1-4h；

(2)准确称取1000mg小球藻多糖或螺旋藻多糖放入20-60mL甲酰胺制得悬浮液，与(1)所述溶液混匀磁力搅拌1-4h；

(4)调至溶液pH中性，蒸馏水透析2-4天，旋转蒸发浓缩后加入3-5倍体积的无水乙醇析出沉淀，冷冻干燥得硫酸化酯化多糖。

3.根据权利要求2所述的微藻硫酸酯化复合多糖，其特征在于：所述的小球藻多糖或螺旋藻多糖的制备方法包括如下步骤：

(1)螺旋藻或小球藻细胞的破壁：将生长至平台期的螺旋藻或小球藻液离心，称取10-50g藻粉，加入100-800mL蒸馏水，将藻液低温冷冻结块，再80℃水浴加热6-10h解冻和破壁，重复上述过程3次，离心取上清，剩余藻泥震荡后加入蒸馏水超声破壁：500-1000W，每次1-3min，共10-30min，完毕后离心取上清。合并所有上清进行蛋白质等杂质的去除；

(2)去除蛋白质：调节溶液pH至中性并加入含量1％的中性蛋白酶，30-60℃条件下水浴3-5h，离心取上清调至pH值中性，加入1/5-1/2体积三氯甲烷和1/10-1/3体积的异戊醇，震荡10-15h去除杂质蛋白，重复3-5次直到无沉淀产生；

(3)粗多糖的纯化：

①醇沉：在清除杂质蛋白后的溶液中加入3倍体积的无水乙醇，混匀后4℃静置12-24h，离心分别收集上清和沉淀，上清液加入适量无水乙醇6-24h后离心收集沉淀，合并两次收集的沉淀旋转蒸发浓缩，得粗多糖浓缩液；

②透析：粗多糖浓缩液装入前处理的透析袋中，置于蒸馏水中于磁力搅拌器上搅拌透析8-24h；

③冷冻干燥：将预冻的透析物取出放置在干燥架上，将干燥架放置在冷阱上，打开真空泵开始真空干燥；

④采取纤维素DEAE-52阴离子层析进行粗多糖的纯化。

4.根据权利要求3所述的微藻硫酸酯化复合多糖，其特征在于：采取纤维素DEAE-52阴离子层析进行粗多糖的纯化的步骤为：

(1)酸碱处理：称取30-100g DE-52阴离子交换剂干粉，超纯水浸泡6-12h换水，倒掉上层悬浮的细小颗粒；配制0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCL溶液调节阴离子凝胶pH值，先用HCL处理至pH值到2-3，后用NaOH处理其pH值达到9-10，最后用超纯水泡胶，多次换水后其pH值为7即可灌柱；

(2)灌柱及上样：关闭层析柱出水口，向柱中加入适量洗脱液，不断搅拌下灌柱，自然沉降后的胶体积应占柱体积的3/4左右；装柱完毕之后胶将粗多糖溶液倒入层析柱中，准备洗脱；

(3)洗脱液收集：选用0.1-0.5mol/L的NaCl作为洗脱液，在梯度混合仪和恒流泵作用下持续洗脱。

5.一种权利要求1所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抗肿瘤领域的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤包括体内抗肿瘤及体外抗肿瘤。

7.一种权利要求1所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抑制人乳腺癌细胞MCF-7中的应用，浓度≤6.4mg/mL。

8.一种权利要求1所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抑制人肝癌细胞HepG2中的应用，浓度≤6.4mg/mL。

9.一种权利要求1所述的微藻硫酸酯化复合多糖在抑制人肺癌细胞A549中的应用，浓度≤6.4mg/mL。