CN105410898A - 一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物及其制备方法和用途 - Google Patents
一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物及其制备方法，它是将白藜芦醇与蓝莓花青素提取物按质量比1∶5-1∶10的比例均匀混合制得。本发明还公开了该复合物的用途，所制得的白藜芦醇花青素复合物具有显著的降血脂作用和体内外抗氧化功效，本发明的白藜芦醇花青素复合物对高脂大鼠的TC下降了31.5%，TG下降了29.3%，提示蓝莓花青素与白藜芦醇复配具有良好的降脂作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物，本发明还涉及一种辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物的制备方法和用途。
背景技术
随着现代人们生活水平的提升，伴随而来的各种富贵病如糖尿病、肥胖症、高血脂、高血压等高发，导致冠心病的多发因素之一就是血清中的高胆固醇，冠心病的发生是动脉粥样硬化的结果。人们已经开始重视高血脂这个问题，人们的消费观念已悄然发生了转变，使得现在功能食品受到青睐。功能食品(FunctionalFoods)是指对人体具有增强机体防御功能、调节生命节律、预防疾病和促进康复等有关生理调节功能的加工食品。高血脂引起的心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病的疾病。目前治疗高脂血症的化学类药物大都会呈现出不同程度的毒副作用，天然降血脂活性成分越来越受到消费者和研究者的亲睐。
花青素因其抗氧化性而具有降血脂和防治心血管疾病的功效。蓝莓花青素以维持血管壁的正常功能及皮肤弹性，保护血管内皮细胞防止动脉硬化、降血脂和血管壁功能退化等心血管方面起着重要的作用，可以很好地降低胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇的水平，预防血栓的形成，从而有助于预防心脑血管疾病的发生。
白藜芦醇作为葡萄、虎杖等植物的天然产物，具有良好抗氧化、抗衰老作用，可预防动脉粥样硬化、防止冠心病、降低血清和肝脏的脂质、抑制肝脏癌细胞组织变异。白藜芦醇的抗氧化、抗衰老作用与丁基羟基甲苯、槲皮素和生育酚相比，白藜芦醇的抗氧化作用最强。白藜芦醇具有抑制脂质氧化酶过氧化作用的活性。白藜芦醇具有良好的舒张血管的效应，其与NO的产生密切相关,而且大剂量的白藜芦醇可能会有直接舒张血管的作用。研究表明，白藜芦醇是植物在遇到紫外线照射、真菌感染等不利的条件时所产生的一种植物补体，对植物本身起着保护作用，同时对人体也具有调节脂质代谢、保护心血管、抑制血小板聚集、抗肿瘤等多种药理作用。近年来以白藜芦醇为活性成分的保健食品层出不穷。将白藜芦醇与花青素复配制备新型降血脂保健产品将具有巨大的市场前景。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物。
本发明的第二个目的是提供一种白藜芦醇花青素复合物的制备方法。
一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物，其特征在于：将来源于传统中药材虎杖中的98-99%纯度的白藜芦醇，与蓝莓花青素提取物按质量比1∶5-1∶10的比例混合制成。
一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）从虎杖中提取获得98-99%纯度的白藜芦醇；
2）蓝莓花青素的提取：称取50g冷冻园蓝蓝莓鲜果，研磨至泥状后置于蒸馏瓶中，随后加入60%的乙醇（15mL/g）作为提取剂，加入0.1mol/L盐酸调节，使溶液的pH为3左右。将样品与提取剂充分混匀后，将蒸馏瓶置于磁力搅拌器上提取，40℃提取2h，提取过程重复两次，合并滤液并过滤得到澄清的粗提取液，减压浓缩，冷冻干燥，粗提物冻干后置于-20℃保存至进一步纯化；将粗提物配成5mg/mL的水溶液上样于25mm×100mm的AB-8大孔吸附树脂（粒径大小为0.3-1.25mm）；随后用5倍柱体积的蒸馏水多次洗涤上样后的柱子，除去杂质，最后采用浓度60%乙醇水溶液（体积比）洗脱至无色，收集后于40℃减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化后产品，并置于-20℃保存；
3）将白藜芦醇与蓝莓花青素提取物按质量比1∶5-1∶10的比例均匀混合，即得。
本发明的白藜芦醇花青素复合物抗氧化效果良好；对高脂大鼠的TC下降了31.5%，TG下降了29.3%，提示蓝莓花青素与白藜芦醇复配具有良好的降脂作用。
附图说明
图1是BHT、白藜芦醇的还原力测定对比。
图2是不同比例白藜芦醇花青素复配样品还原力的测定对比。
图3是不同比例白藜芦醇花青素复配样品对·OH的清除作用对比。
图4是不同比例白藜芦醇花青素复配样品对O2-·的清除作用对比（图中“白”代指白藜芦醇、“花”代指花青素）。
图5是不同比例白藜芦醇花青素复配样品对DPPH·的清除作用对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物的制备
1、从虎杖中提取获得98-99%纯度的白藜芦醇；
2、蓝莓花青素的提取：称取50g冷冻园蓝蓝莓鲜果，研磨至泥状后置于蒸馏瓶中，随后加入60%的乙醇（15mL/g）作为提取剂，加入0.1mol/L盐酸调节，使溶液的pH为3左右。将样品与提取剂充分混匀后，将蒸馏瓶置于磁力搅拌器上提取，40℃提取2h，提取过程重复两次，合并滤液并过滤得到澄清的粗提取液，减压浓缩，冷冻干燥，粗提物冻干后置于-20℃保存至进一步纯化；将粗提物配成5mg/mL的水溶液上样于25mm×100mm的AB-8大孔吸附树脂（粒径大小为0.3-1.25mm）；随后用5倍柱体积的蒸馏水多次洗涤上样后的柱子，除去杂质，最后采用浓度60%乙醇水溶液（体积比）洗脱至无色，收集后于40℃减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化后产品并置于-20℃保存；
3、将白藜芦醇与蓝莓花青素提取物按质量比1∶5-1∶10的比例均匀混合，即得。
实施例2白藜芦醇花青素复合物的体内外抗氧化活性研究
一、试验方法
1、溶液的配制
a、白藜芦醇甲醇溶液分别取白藜芦醇干粉若干，以甲醇为溶剂，配制浓度分别为10,20,50,100,200,400,800μg/ml的系列溶液；
b、白藜芦醇花青素复配溶液分别取200㎎的白藜芦醇和200mg的蓝莓花青素提取物混合，以甲醇为溶剂，定容至100ml容量瓶中，配制白藜芦醇：花青素=1:1（质量比）浓度分别为10，20，50，100，200μg/mL的系列溶液；
c、白藜芦醇花青素复配溶液分别取100mg的白藜芦醇和300㎎花青素提取物混合，以甲醇为溶剂，定容至100ml容量瓶，配制白藜芦醇：花青素=1:3（质量比）的浓度分别为10，20，50，100，200μg/mL的系列溶液。
2、总还原力测定方法
移取1ml上述不同浓度样品溶液于5个不同的离心管中，依次加入2.5ml0.2mol/L磷酸缓冲溶液(pH=6.6)、2.5ml质量分数1%的K3Fe(CN)6溶液，50℃水浴保温20min，迅速冷却，再加入2.5ml质量分数10%的三氯乙酸溶液，以3000r/min离心10min。取2.5ml上清液，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml质量分数0.1%的FeCl3溶液，以水调零于700nm处测定吸光度，每一次吸光值平行测定三次，取平均值。以吸光度的大小来表示其还原力的大小。
3、·OH自由基的清除作用测定方法
A1为样品组：反应体系中含20mmol/LH2O20.5ml，8mmol/LFeSO40.6ml，3mmol/L水杨酸-乙醇溶液2ml，不同浓度的样品溶液2ml，其中H2O2是最后加入并启动整个反应。37℃反应30min后流水冷却，加0.9ml蒸馏水，使得体系总体积为6ml，3000r/min离心10min，在510nm下测定吸光度。每一次吸光值平行测定三次，取平均值。
A0为空白组：以1ml蒸馏水代替不同浓度的样品溶液。
A2为对照组：以1ml蒸馏水代替水杨酸-乙醇溶液。
清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。
4、O2-·自由基的清除作用测定方法
采用邻苯三酚自氧化法测定取pH=8.2的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液4.5ml,不同浓度的样品溶液各4.2ml,混匀后，在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入25℃水浴预热的3mmol/L的邻苯三酚0.3ml（3mmol/L的邻苯三酚以10mmol/L的HCL溶液配制），迅速摇匀后，325nm处每隔30s测定一次吸光度。计算线性范围内每分钟吸光度的增加。空白组以4.2ml蒸馏水代替样品溶液。每一次吸光值平行测定三次，取平均值。
ΔA0为空白组的吸光度增长率，ΔA为样品组的吸光度增长率。
O2-·自由基抑制率（%）=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100%。
5、DPPH·自由基的清除作用测定方法
取0.15mmol/L的DPPH乙醇（95%）溶液2ml，不同浓度的样品溶液2ml，混合震荡后，室温放置30min，在波长517nm处测的吸光值Ai；以蒸馏水代替样品溶液，测得吸光值A0；乙醇代替DPPH溶液，测得吸光值Aj。每一次吸光值平行测定三次，取平均值。
DPPH·自由基清除率（%）={1-(Ai-Aj/A0）}×100。
6、抗氧化动物实验
选用12月龄雄性昆明小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个老龄对照组和4个受试样品剂量组以及一个模型对照组，每组10只。另增设1个少龄对照组，选用8周龄雄性昆明小鼠，每组10只。试验前动物在试验环境下进行一周的环境适应，然后按照设定好的剂量，连续给各组小鼠灌胃给药30d。30d后饥饿过夜，给小鼠称重，眼底取血，并取脏器进行称重。
实验设白藜芦醇对照组（2个剂量组）、白藜芦醇花青素复合物（2个剂量组）和一个少龄空白对照组及一个老龄空白对照组，并且设置一个阳性对照组。少龄空白对照组、老龄空白对照组每只小鼠按10mg生理盐水/kg的剂量灌胃。白藜芦醇高、低剂量组分别按每只小鼠20mgRes/kg、10mgRes/kg的剂量灌胃给药。白藜芦醇花青素复合物高、低剂量组每只小鼠分别按20mg/kgRes和200mg/kg蓝莓提取物、10mg/kgRes和100mg/kg蓝莓提取物的剂量灌胃给药。阳性对照组按10μg硒代半胱氨酸/kg的剂量灌胃给药。
7、白藜芦醇花青素复合物对老龄小鼠体内生化指标影响的检测
总抗氧化能力（T-AOC）测定、超氧化物歧化酶（SOD）测定、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定、丙二醛（MDA）测定按照试剂盒说明书操作进行。
二、试验结果
1、总还原力测定实验数据与结论分析
图1为BHT的还原力测定结果，浓度分别为0、10、20、50、100、200μg/ml。
由图2可见，白藜芦醇花青素复合配方、白藜芦醇自身都有一定的总还原力，并且与浓度呈正相关。在同等质量浓度下，单独白藜芦醇的还原力最高，高于复配组。随着样品浓度的增加，不同比例的待测样品还原力呈现增加趋势，可见同种样品的还原力随着浓度的增加而呈现出增加的趋势。
2、·OH自由基的清除实验
由图3（图中“白”代指白藜芦醇、“花”代指花青素）显示,不同比例的复配样品对·OH自由基都有一定的清除作用。在实验的浓度范围内，随着各种比例复配样品的浓度的升高，其清除作用显著升高，并且浓度与清除率之间具有较好的量效关系。且当样品浓度为200μg/ml时，Vc、白藜芦醇、白藜芦醇：蓝莓花青素=1:1（质量比）、白藜芦醇：蓝莓花青素=1:3（质量比）四者对·OH自由基的清除率均趋近于20%。由图所示，单独白藜芦醇组和白藜芦醇与花青素复配组对·OH自由基的清楚作用并无太大差异。由此可以推断，复配后并不影响其对·OH自由基的清除作用。
3、O2-·自由基的清除实验
由图4可以看出,单独白藜芦醇组与不同比例的复配组对O2-·都有一定的清除作用。在实验的浓度范围内，随着各种比例复配样品的浓度的升高，其清除作用显著升高，并且浓度与清除率之间具有较好的量效关系。且当实验浓度较低时，复配组对O2-·自由基的清除作用较大于单独白藜芦醇组；当浓度达到600μg/ml时，三者对O2-·的清除率趋近于100%。
4、DPPH·自由基的清除实验
如图5所示，蓝莓花青素和白藜芦醇对DPPH·的清除率与它们的浓度存在剂量效应关系，并且在测定浓度范围内，表现出了正相关的关系。随着样品浓度的增加，不同比例的复配样品DPPH·清除率逐渐增加。且在实验测定浓度范围内，复配组与单独白藜芦醇组对DPPH·的清除作用无明显差异。由此可以推断，复配后对DPPH·的清除作用无明显影响。
5、体内抗氧化活性动物实验数据及结论分析
由表1可见，与老龄对照组相比，少龄组小鼠的胸腺指数明显要高出很多，其他给药组的小鼠胸腺指数均有不同程度提高，差异呈现显著性（P<0.05），由此推断白藜芦醇蓝莓花青素配方有利于提高老龄小鼠的免疫。
各组的脾脏指数规律不明显，与老龄组小鼠相比，少龄组、白藜芦醇高剂量组、蓝莓花青素白藜芦醇复配高剂量组小鼠的脾脏指数均有不同程度降低，阳性对照组、白藜芦醇低剂量组、蓝莓花青素白藜芦醇复配低剂量组的脾脏指数均有提高。
由表2可见，除蓝莓花青素白藜芦醇复配高剂量组小鼠的心脏指数稍有降低外，其他各组小鼠的心脏指数值没有大幅度变化。
除少龄对照组的肝脏指数高于其他各组，各个给药组与老龄组的肝脏指数没有明显差别。
少龄对照组的肾脏指数明显低于老龄组小鼠，白藜芦醇高剂量组肾脏指数高于老龄组，由此推断白藜芦醇蓝莓花青素配方对老龄小鼠肾脏指数的降低作用比单独白藜芦醇作用强。
由表3可见，各给药组小鼠血清的T-AOC值（总抗氧化能力）比老龄组小鼠的T-AOC值有明显提高，也高于少龄对照组的T-AOC值。此可以推断白藜芦醇有利于提高T-AOC值，但是蓝莓花青素与白藜芦醇复配后效果比单独白藜芦醇效果差一些。
阳性对照组SOD活性（超氧化物歧化酶活性）与老龄组相比并无较大提高，少龄组与其他给药组的SOD活性（超氧化物歧化酶活性）均明显高于老龄组。由此可以推断白藜芦醇有利于提高SOD活性，但是蓝莓花青素与白藜芦醇复配后效果比单独白藜芦醇效果还要更好些。
少龄组、蓝莓花青素与白藜芦醇复配高剂量组小鼠体内MDA（丙二醛）含量比老龄对照组略低，而其他给药组小鼠MDA含量均明显低于老龄组。由此推断，白藜芦醇及其蓝莓花青素与白藜芦醇复配组有利于降低老龄小鼠内MDA含量。
老龄组小鼠的GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）活性最低，少龄对照组、全部给药组GSH-PX活性均明显高于老龄组。由此推断蓝莓花青素与白藜芦醇复配效果强于单独白藜芦醇。
6、急性毒理实验
经过2周的观察，发现小鼠行动自如、无出现异常情况、无死亡现象。说明实验所采用最高剂量组300mg白藜芦醇/kg和3000mg花青素+300mg白藜芦醇/kg无毒性。
综上，白藜芦醇花青素复配的抗氧化效果良好。
实施例3白藜芦醇花青素复合物的体内降血脂活性研究
一、试验方法
1、实验动物
Wistar雄性大鼠，SPF级，体重130±10g，购于湖北省疾病控制中心，许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。
2、实验方法
2.1、动物实验方法
将40只体重为130±10g的雄性大鼠随机分为4组，每组10只，第1组为正常对照组，第2组为高脂模型组，第3、4组分别为低、高剂量的白藜芦醇花青素复配组，灌胃剂量见实验结果表格。
分组完毕后，用普通饲料进行1周环境适应性喂养，之后每天给第1组，第2组大鼠灌胃生理盐水，给第3、4组大鼠灌胃不同剂量的样品组，实验期间每3天测体重一次，实验为期30天。
2.2、测定指标
实验结束后眼球取血，断颈处死，解剖取肝脏并冷冻（-20℃）制备切片。将大鼠血液3500r/min离心8min后分离血清，冷藏待检。测定各组大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C、动脉硬化（AI）指数等指标；根据代谢实验期间的饲料投入量和剩余量计算每只大鼠饲料消耗量，称重并比较各组变化，试验期间每三天称体重一次。
2.3、血清总胆固醇（TC）含量的测定
按照试剂盒说明书进行实验。样品管加血清10μL，工作液1.0mL；空白管加工作液1.0mL，蒸馏水10μL；标准管加工作液1.0mL，加标准液10μL。将各管分别混合均匀，37℃下保温6min，于波长500nm处，1cm光径比色杯，以试剂空白管校零，分别读取A标准和A样品，计算：
注：标准浓度见试剂盒说明书。
2.4、血清甘油三酯（TG）含量的测定
按照试剂盒说明书进行实验。样品管加血清10μL，工作液1.0mL；空白管加工作液1.0mL，蒸馏水10μL；标准管加工作液1.0mL，加标准液10μL。将各管分别混合均匀，37℃下保温10min，于波长500nm处，1cm光径比色杯，以试剂空白管校零，分别读取A标准和A样品，计算：
注：标准浓度见试剂盒说明书。
2.5、血清高密度脂蛋白（HDL-C）含量的测定
按照试剂盒说明书进行实验。样品管加血清25μL，工作液1.0mL；空白管加工作液1.0mL，蒸馏水25μL；标准管加工作液1.0mL，加标准液25μL。将各管分别混合均匀，37℃下保温6min，于波长500nm处，1cm光径比色杯，以试剂空白管校零，分别读取A标准和A样品，计算：
注：标准浓度见试剂盒说明书，*为血液稀释倍数。
二、试验结果
1、白藜芦醇花青素复配对大鼠血脂指标的影响
由表4可以看出，与正常对照组相比，高脂模型组大鼠的血清TC浓度是正常组的1.75倍，TG是1.62倍。经统计学分析，高脂模型组和正常组之间大鼠TC、TG水平具有显著性差异（p＜0.01），说明高脂动物模型造模成功。与模型组相比，白藜芦醇花青素复配低、高剂量组TC、TG浓度均显著降低，高剂量组降低达极显著水平，其中白藜芦醇花青素复配高剂量组TC下降了31.5%，TG下降了29.3%，提示蓝莓花青素与白藜芦醇复配降脂效果良好。
由表5可以看出，与模型组相比，白藜芦醇花青素复配低、高剂量组的高密度脂蛋白显著性增加，分别增加了6.8%、13.6%；同时白藜芦醇花青素复配低、高剂量组的低密度脂蛋白浓度均显著降低，分别下降了14.5%、26.6%。与高脂模型组相比，白藜芦醇花青素复配低、高剂量组动脉硬化指数（AI）值均具有显著性差异。
综上，白藜芦醇花青素复配的降脂效果良好。
Claims (4)
1.一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物，其特征在于：将来源于传统中药材虎杖中的98-99%纯度的白藜芦醇，与蓝莓花青素提取物按质量比1∶5-1∶10的比例混合制成。
2.一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）从虎杖中提取获得98-99%纯度的白藜芦醇；
2）蓝莓花青素的提取：称取50g冷冻园蓝蓝莓鲜果，研磨至泥状后置于蒸馏瓶中，随后加入60%的乙醇（15mL/g）作为提取剂，加入0.1mol/L盐酸调节，使溶液的pH为3左右；
将样品与提取剂充分混匀后，将蒸馏瓶置于磁力搅拌器上提取，40℃提取2h，提取过程重复两次，合并滤液并过滤得到澄清的粗提取液，减压浓缩，冷冻干燥，粗提物冻干后置于-20℃保存至进一步纯化；将粗提物配成5mg/mL的水溶液上样于25mm×100mm的AB-8大孔吸附树脂；随后用5倍柱体积的蒸馏水多次洗涤上样后的柱子，除去杂质，最后采用浓度60%乙醇水溶液（体积比）洗脱至无色，收集后于40℃减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化后产品，并置于-20℃保存；
3）将白藜芦醇与蓝莓花青素提取物按质量比1∶5-1∶10的比例均匀混合，即得。
3.一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物作为降血脂功能食品的用途。
4.一种用于辅助降血脂的白藜芦醇花青素复合物作为抗氧化功能食品的用途。
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