CN104817608B - 含硒化合物的虫草素盐及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含硒化合物的虫草素盐及其制备方法和用途。本发明的含硒化合物的虫草素盐结构如通式(I)所示，其中，n＝1或2，x＝3或4。本发明的含硒化合物的虫草素盐具有较强的抗肿瘤效果。

Description

含硒化合物的虫草素盐及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及含硒化合物的虫草素盐及其制备方法和用途。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，对人体健康有极其重要的生物学功能。与其它的(半)金属不同，硒代半胱氨酸——作为人类蛋白质合成的第21个氨基酸的一部分，硒通过共转译机制成为蛋白质的一部分。至今有二十五个硒蛋白在人体内被确认，然而它们的功能仅很少被了解。大多数的硒蛋白参与抗氧化应答和氧化还原状态的调节，特别是谷胱甘肽过氧化物酶(GPxs)家族和硫氧还蛋白还原酶(TrxRs)家族。一些硒蛋白还发挥更特殊的必须的作用，例如，甲腺氨酸脱碘化酶(DIOs)参与甲状腺素的代谢，GPx4是精子发育必不可少的，硒磷酸合成酶2(SPS2)参与硒蛋白的生物合成。其它的硒蛋白可能也参与了重要的生物过程，但它们确切的作用机理仍未被充分认识。
尽管对它们的生化功能缺乏精确的认识，但在过去二十年开展的大量研究表明硒水平，尤其是硒蛋白的不足与许多人类疾病密切相关，所述疾病包括癌症、糖尿病、心血管和免疫系统疾病。大部分情况下，这种联系在于氧化应激——可能引发疾病或可由疾病引发。在这种情况下，充足的硒状态是否可以对比健康和疾病的风险因素，或者当硒代谢改变时补充硒是否可以改善健康状况，理解这一点是非常重要的。另外，最近发现硒蛋白的基因多态性与癌症和其它疾病相关，这一发现引起了人们的注意。癌症研究是最有希望的战线，硒作为一些新设计的抗癌药和关键组成，已经试验使用。大量文献支持了硒对人类健康的重要作用，催生了补充硒的研究热点。
过去二十年的研究已经证明，硒可能直接或间接地与多种人类健康失常有关。大部分的这些联系是由于在氧化应激下降过程中GPxs和TrxRs酶的作用，这些氧化应激的减少已被确认为是一些疾病的发展和恶化的主要原因。其他的一些硒蛋白也参与特定的过程，如钙离子传导信号、大脑功能和精子形成等。与硒不足相关的基因改变或低表达被认定是引起相关病理的原因；然而，与人类疾病相关的硒蛋白的作用机制还处于未知的现状。大多数硒蛋白表现出对人类疾病有益的作用，这意味着活性不足可能与病理状态的发生或发展有关。Marco Roman、Petru Jitaru和Carlo Barbante三位科学家从流行病学调查和硒蛋白的生物功能方面综述分析了硒缺乏引起的人类疾病(Selenium biochemistry and itsrole for human health；Metallomics，2014，6，25-54)。Selenium biochemistry and itsrole for human health(Metallomics，2014，6，25-54)第五节“硒与人类疾病”(“Seleniumand human diseases”)的内容全部或部分并入本发明说明书，作为本发明的背景技术。补充可以对抗各种硒缺乏引起的疾病，包括大骨节病；克山病；心血管疾病(CVD)，包括动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭和冠心病；肝病，包括酒精性肝损伤和肝硬化；肾功能衰竭；神经系统疾病，包括神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病，帕金斯氏病，多发性硬化症，巴滕氏病和癫痫等，以及缺血性损伤、接触环境毒素、滥用药物、脑肿瘤等引起的神经退行性疾病，强迫性(精神)障碍，抑郁症等；免疫预防和炎症性疾病，包括类风湿性关节炎、哮喘和Crohn’s病、牛皮癣、红斑狼疮、败血症或败血症样疾病；艾滋病(HIV)；糖尿病；内分泌紊乱；男性不育症；癌症，包括列腺癌、膀胱癌、肺癌、直肠癌、肝癌、大肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、巴雷特食管癌，癌症放疗过程中增强正常组织对辐射的防护作用，以及提高晚期癌症患者的总体生活质量；衰老有关的疾病；有毒金属的中毒。
硒对前列腺疾病也有治疗作用。近年来大量基础研究显示前列腺增生可能是前列腺间质与上皮的相互作用所致，即上皮与间质通过各种细胞因子的相互调控，促使上皮与间质增生。目前已知3种前列腺上皮细胞(神经内分泌细胞、分泌细胞和基底细胞)5种间质细胞(平滑肌、纤维母细胞、淋巴细胞、内皮细胞和神经细胞)参与相互作用。信息传递是通过各种生长因子和通过3种细胞(神经、淋巴和内皮细胞)产生的一氧化氮介导的，从而使细胞凋亡减少，增生加速，最终导致腺体增生。大量的研究表明硒化合物有诱导细胞凋亡的作用。Wan，X.Steven(Oncology Reports，10(6)，2009-2014；2003)将九个影响细胞生长或克隆存活的化学预防剂用于正常的非致癌人前列腺上皮细胞系(267B1)、人类良性前列腺增生(增生)细胞系(brf-55t)和人类前列腺癌细胞系(267b1/Ki-ras)，对其进行评估。被试验的九种药物中的9-顺式维甲酸、利阿唑甲酯、1，4-苯基二(亚甲基)硒腈(p-XSC)和L-硒代蛋氨酸被证明对前列腺癌细胞生长抑制作用明显强于对正常的前列腺上皮细胞的抑制作用，表明这些药物作为前列腺癌的化学预防剂可能是有用的。9-顺式维甲酸、金雀、利阿唑甲酯、p-XSC、L-硒代蛋氨酸和维生素E对BRF-55T细胞生长抑制作用远强于对正常前列腺上皮细胞的抑制，表明这些药物对预防和治疗前列腺增生(BPH)也可能是有益的。硒能抑制环氧合酶-2(COX-2)的表达，增强谷胱甘肽的抗氧化作用，抑制前列腺素E2的合成等，是治疗前列腺炎的基础。
目前，现有技术中可用于人体的硒的形式仍很有限，除了亚硒酸钠被批准为克山病大骨节病的治疗，硒酸钾在英国批准用和维生素E联用治疗肌肉营养不良外，硒化卡拉胶、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸等，通过发酵或发芽获得的有富硒酵母、富硒麦芽等被批准作为微量元素补充剂用于保健食品或食品。国内外研发的多个含硒的化合物，例如ebselen是有谷胱甘肽过氧化物酶活性的人工模拟酶，p-XSC是化学预防剂，但是都停止了临床试验。硒的生物医药应用现状与硒的作用不相符。
因此开发出安全有效的含硒药物，特别是防癌抗癌的药物，是当务之急。
虫草素，化学名为3-脱氧腺苷，是天然来源的腺苷类似物，是蛹虫草的有效成份，研究发现它是聚腺苷酸化的特异性抑制剂，具有抗癌、抗菌等多种作用，临床上可用于白血病的治疗等。研究表明，虫草素有以下生物作用：(1)抑制嘌呤、DNA/RNA的生物合物和mTOR的信号通路；(2)诱导凋亡和细胞周期调控；(3)抵抗肿瘤转移；(4)抗血小板聚集和；(5)抗炎作用。
虫草素用于人体的剂量较大，一般20mg～100mg/天，但从人工栽培的蛹虫草子实体或菌丝体提取的虫草素的来源十分稀缺，成本高，提高它的效果非常有必要。一种情况是对氨基进行修饰，屏蔽腺苷脱氨酶的脱氨基作用，但修饰后的治疗效果并不增加，可能是氨基修饰后增加了相关酶的识别能力，无法像原结构那样被当作腺苷掺入到DNA/RNA中，从而消失了原有的作用；另一种情况是和腺苷脱氨酶抑制剂ADA(2’-脱氧柯福霉素，2’-dCF，商品名为Nipent，由美国SuperGen公司生产)合用，在抑制脱氨基作用的情况下，提高了效用，但是ADA的副作用也限制了联合用药。本发明将有抗癌作用的硒和虫草素制备成化合物，希望联合发挥两者的抗癌活性，并降低虫草素的使用剂量。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种含硒化合物的虫草素盐，其制备方法，包含该含硒化合物的虫草素盐的药物组合物，以及该含硒化合物的虫草素盐的用途。
本发明实现上述目的的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种含硒化合物的虫草素盐，其结构如通式(I)所示：
其中，n＝1或2，x＝3或4。
优选地，H2SeOx为硒酸或亚硒酸。
优选地，n＝1，x＝3。即所述含硒化合物的虫草素盐为亚硒酸虫草素，其结构如式(Ia)所示：
。
优选地，n＝2，x＝3。即所述含硒化合物的虫草素盐为亚硒酸二虫草素，其结构如式(Ib)所示：
优选地，n＝1，x＝4。即所述含硒化合物的虫草素盐为硒酸虫草素，其结构如式(Ic)所示：
。
优选地，n＝2，x＝4。即所述含硒化合物的虫草素盐为硒酸二虫草素，其结构如式(Id)所示：
。
另一方面，本发明提供一种所述含硒化合物的虫草素盐的制备方法，该方法包括使虫草素与二氧化硒、硒酸或亚硒酸进行反应的步骤。
本发明所述的含硒化合物的虫草素盐可通过以下示例性反应路线来制备得到：
方案一：虫草素的亚硒酸盐的合成：
C10H13N5O3+H2SeO3→C10H13N5O3·H2SeO3
2C10H13N5O3+H2SeO3→2C10H13N5O3·H2SeO3。
方案二：虫草素的硒酸盐的合成：
C10H13N5O3+H2SeO4→C10H13N5O3·H2SeO4
2C10H13N5O3+H2SeO4→2C10H13N5O3·H2SeO4。
又一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含一种或多种所述含硒化合物的虫草素盐作为活性成分以及药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物组合物可以是片剂、注射剂、酊剂、栓剂、胶囊剂、软膏剂、眼用制剂、丸剂、植入剂、糖浆剂、气雾剂、膜剂、颗粒剂、口服溶液剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、洗剂、搽剂、凝胶剂或贴剂的形式。
可在制备含有作为活性成分的含硒化合物的虫草素盐的药物组合物中使用的辅料可包括甜味剂、粘合剂、溶解剂、助溶剂、润湿剂、乳化剂、等渗剂、吸收剂、降解剂、抗氧化剂、防腐剂、润滑剂、填充剂、芳香剂等；比如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、甘氨酸、二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂精、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硅酸镁铝、淀粉、明胶、黄蓍胶、甘氨酸、二氧化硅、藻酸、藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、琼脂、水、乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、氯化钾、柑橙香精、草莓香精、香草香料等。
可将本发明的含硒化合物的虫草素盐以适于所选施用途径的各种形式(例如口服或胃肠外，通过静脉内、肌肉内、局部或皮下途径，或者直接注射进过度增殖性组织或细胞内)配制成药物组合物并施用给需要治疗的对象，例如哺乳动物，比如人患者。
因此，本发明的含硒化合物的虫草素盐可以全身施用，例如与药学上可接受的运载体(如惰性稀释剂或可吸收的食用性载体)一起口服或者通过吸入或喷洒而施用。它们可被包封进硬壳或软壳明胶胶囊中，可被压进片剂中，或者可被直接掺入患者膳食的食物中。对于口服治疗施用而言，所述含硒化合物的虫草素盐可与一种或多种赋形剂组合并且可以以咀嚼片、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆等的形式使用。所述含硒化合物的虫草素盐可以与微细的惰性粉末载体一起组合并由对象吸入或喷洒。甚至可以制备成灌肠液由腔门或结肠给药。这些组合物和制剂应包含至少0.1％的含硒化合物的虫草素盐。当然，所述组合物和制剂的百分数可以变化，通常可以是给定单位剂型重量的约2％至约60％。在此可用于治疗的含硒化合物的虫草素盐的量是将获得有效剂量水平的量。
所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下物质：粘合剂比如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂比如磷酸二钙；崩解剂比如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂比如硬脂酸镁；甜味剂比如蔗糖、果糖、乳糖或天冬甜素；或者调味剂比如薄荷、冬青油，或者可加入樱桃调味剂。当所述单位剂型是胶囊时，除了上述类型物质以外，其还可包含液体载体，比如植物油或聚乙二醇。多种其它物质可用作包衣或修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，可利用明胶、蜡、虫胶或糖等将片剂、丸剂或胶囊等包衣。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂比如樱桃或柑橙风味的调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所使用的任何物质都应当是药学上可接受的，并且在所施用量下是基本上无毒的。此外，可将所述含硒化合物的虫草素盐掺入持续释放制剂和装置中。
还可通过输注或注射静脉内或腹膜内施用所述含硒化合物的虫草素盐。可在水中(任选地与无毒的表面活性剂混合)制备所述含硒化合物的虫草素盐的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精、其混合物以及油中制备分散液。在通常的贮存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。
适于注射或输注的药物剂型可包括含有含硒化合物的虫草素盐的无菌水溶液或分散液或无菌粉末，其适于即时制备任选地包封在脂质体中的无菌注射溶液或输注溶液或分散液。在所有情形下，最终剂型都应当是无菌流体并且在生产和贮存条件下都应当是稳定的。所述液体载体或运载体可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯以及其合适的混合物。可以例如通过形成脂质体、通过在分散体情形下保持所需粒度或者通过使用表面活性剂来保持合适的流动性。可通过多种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在多种情况下，优选包含等张剂例如糖、缓冲剂或氯化钠。可通过在组合物中使用延缓吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现注射用组合物的延长吸收。
通过将所需量的所述含硒化合物的虫草素盐与多种上述列举的其它成分(如果需要的话)掺入到合适的溶剂中然后过滤除菌而制备无菌注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情形下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其得到存在于前述无菌过滤溶液中的所述活性成分和任何其它所需成分的粉末。
对于局部施用而言，可以纯形式施用所述含硒化合物的虫草素盐。然而，将其与皮肤学可接受的载体(其可以是固体或液体)一起作为组合物或制剂而施用于皮肤通常是所期望的。
可用的固体载体包括微细固体，比如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。其它的固体载体包括无毒的聚合物纳米颗粒或微粒。可用的液体载体包括水、醇或二醇或水/醇/二醇混合物，所述含硒化合物的虫草素盐可以有效水平(任选地借助无毒表面活性剂)溶解或分散其中。可加入辅助剂(比如香料和其它抗微生物剂)以优化针对给定用途的性质。所得的液体组合物可以用于浸渍绷带和其它敷料的吸收垫形式施用，或者利用泵式喷雾器或气雾喷雾器喷到感染区域上。
再一方面，本发明提供一种保健食品组合物，该保健食品组合物包含一种或多种所述含硒化合物的虫草素盐作为活性成分以及食品级辅料。
再又一方面，本发明提供所述含硒化合物的虫草素盐在制备用于预防和/或治疗硒元素缺乏引起的疾病或病症的药物或保健食品中的用途。
优选地，所述硒元素缺乏引起的疾病或病症选自大骨节病；克山病；心血管疾病(CVD)，包括动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭和冠心病；肝病，包括酒精性肝损伤和肝硬化；肾功能衰竭；神经系统疾病，包括神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病，帕金斯氏病，多发性硬化症，巴滕氏病和癫痫等，以及缺血性损伤、接触环境毒素、滥用药物、脑肿瘤等引起的神经退行性疾病，强迫性(精神)障碍，抑郁症等；免疫预防和炎症性疾病，包括类风湿性关节炎、哮喘和Crohn’s病、牛皮癣、红斑狼疮、败血症或败血症样疾病；艾滋病(HIV)；糖尿病；内分泌紊乱；男性不育症；癌症，包括列腺癌、膀胱癌、肺癌、直肠癌、肝癌、大肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、巴雷特食管癌，癌症放疗过程中增强正常组织对辐射的防护作用，以及提高晚期癌症患者的总体生活质量；衰老有关的疾病；有毒金属的中毒；前列腺疾病，包括良性前列腺增生和前列腺炎。
本发明的含硒化合物的虫草素盐至少具有以下有益效果：
本发明含硒化合物的虫草素盐同时包含含硒化合物部分和虫草素部分，一方面可以作为硒的补充剂，另一方面虫草素和硒两者在抗癌中发挥作用，因此，本发明含硒化合物的虫草素盐效果优于单独的含硒化合物或虫草素。更进一方面，含硒化合物的虫草素盐使用剂量大大低于单独使用虫草素的使用剂量，大大降低了保健治疗成本，具有十分重要的创造性。本发明含硒化合物的虫草素盐结构确切，克服了硒酵母、硒化考拉胶硒含量不稳定的缺点，更容易应用于制药工业和易于推广应用。
附图说明
图1为亚硒酸二虫草素的核磁共振氢谱。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明。
核磁共振检测仪器为Bruker AVANCE 400MHz超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪；检测条件为：溶剂：重水(D2O)，检测温度：30℃；检测依据：JY/T 007-1996超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱方法通则。其中Se77NMR用0.4M的亚硒酸定位(δ＝28.62ppm，在D2O中)。
如无特殊指出，如下实施例中C、H、N含量用元素分析仪方法测定，硒的含量使用中华人民共和国国家标准GB2124-80《硒中硒量的测定(硫代硫酸钠容量法)》测定。
实施例1亚硒酸虫草素(Secor)的制备
称取二氧化硒22.1毫克，加去离子水10毫升溶解，加虫草素50毫克，在室温搅拌。冷冻干燥除去溶剂，得到亚硒酸虫草素，还可以用水/乙醇重结晶，得到晶体。
重水(D2O)中的Se77NMR：δ42.11(ppm)，元素含量：C，31.25；H，3.82；N，18.28；Se，20.90。理论值：C，31.59；H，3.98；N，18.42；Se，20.77。
实施例2亚硒酸二虫草素(Se2cor)的制备
称取二氧化硒22.1毫克，加去离子水10毫升溶解，加虫草素100毫克，在室温搅拌。冷冻干燥除去溶剂，得到亚硒酸二虫草素，还可以用水/乙醇重结晶，得到晶体。
重水(D2O)中的1HNMR：δ(ppm)8.383(1H，s)，8.269(1H，s)，6.081～6.076(1H，d)，4.837～4.810(1H，q)，4.677～4.630(1H，q)，3.965～3.926(1H，dd)，3.768～3.725(1H，dd)，2.356～2.283(1H，q)，2.231～2.196(1H，q)，重水(D2O)中的Se77NMR：δ(ppm)45.28，元素含量：C，37.24；H，4.40；N，22.03；Se，12.68。理论值：C，38.04；H，4.47；N，22.18；Se，12.50。
实施例3硒酸的制备
15克二氧化硒溶于10毫升水中，加入500克含量大于30％的双氧水，回流12小时，然后在133.3～233.6Pa的压强下减压蒸馏至433K脱水，所得浓溶液冷至283～288K加入固体硒酸晶体，产物放在666.6Pa以下干燥气流中干燥。
实施例4硒酸虫草素(n-Secor)的制备
称取二氧化硒22.1毫克，加去离子水10毫升溶解，加虫草素50毫克，在室温搅拌。冷冻干燥除去溶剂，得到硒酸虫草素，还可以用水/乙醇重结晶，得到晶体。
重水(D2O)中的Se77NMR：δ(ppm)-230.22，元素含量：C，30.57；H，3.91；N，17.63；Se，20.30。理论值：C，30.31；H，3.82；N，17.68；Se，19.93。
实施例5硒酸二虫草素(n-Se2cor)的制备
称取二氧化硒22.1毫克，加去离子水10毫升溶解，加虫草素100毫克，在室温搅拌。冷冻干燥除去溶剂，得到硒酸二虫草素，还可以用水/乙醇重结晶，得到晶体。
重水(D2O)中的1HNMR：δ(ppm)8.517(1H，s)，8.433(1H，s)，6.159～6.155(1H，d)，4.867～4.854(1H，q)，4.662～4.626(1H，q)，3.958～3.920(1H，dd)，3.770～3.727(1H，dd)，2.359～2.286(1H，q)，2.219～2.162(1H，q)..重水(D2O)中的Se77NMR：δ(ppm)-228.12，元素含量：C，36.65；H，4.41；N，21.43；Se，11.81。理论值：C，37.10；H，4.36；N，21.63；Se，12.20。
实施例6硒酸溶液的制备
15克二氧化硒溶于10毫升水中，加入500克含量大于30％的双氧水，回流12小时，然后在133.3～233.6Pa的压强下减压蒸馏至433K脱水，所得浓溶液定容到20毫升，用化学法测定硒的含量，避光放置待用。按实施例4和5的方法，用等当量的硒酸溶液代替硒酸制备硒酸虫草素和硒酸二虫草素。
实施例7亚硒酸二虫草素片的制备
配方(1000片)：亚硒酸二虫草素(由实施例2制备)8.00g，乳糖240.0g，淀粉40.0g，微晶纤维素4.0g，滑石粉6.0g，硬脂酸镁1.0g，1％羟甲基纤维素钠适量。
方法：将乳糖、淀粉、微晶纤维素与原料均匀混合，加入1％羟甲基纤维素钠溶液适量制成软料，过筛制料，湿粒烘干并过筛，加入硬脂酸镁和滑石粉混合均匀，调整片重约0.3g，压片制得含硒1mg/粒的片。
虫草素的其它(亚)硒酸盐的片剂可按同样的方法制备。
实施例8亚硒酸二虫草素注射液的制备
取亚硒酸二虫草素(由实施例2制备)40.0克，加入10升配料桶中，加水2L溶解，加入针用活性碳，加热升温到60℃，保温搅拌10分钟，冷却至30℃，过滤脱碳，补加注射用水至10L，再经0.22μm的滤膜精滤，灌装，压盖，110℃灭菌30分钟。灌装成2ml：1mgSe的规格。可直接用于肌注，或稀释于生理盐水、葡萄糖注射液用于静脉滴注。
虫草素的其它(亚)硒酸盐的注射液可按同样的方法制备。
实施例9体外抗癌试验
1实验系统
1.1细胞株
1.1.1种类：LOVO(人结肠癌细胞)、4T1(人乳腺癌细胞)、A549(人非小细胞肺癌细胞)、PC-3(人前列腺癌细胞)和Hela(人宫颈癌细胞)。
1.1.2来源：中山大学实验动物中心细胞库。
1.2DMEM高糖培养基：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。
1.3胎牛血清的种类：胎牛血清(FBS)，gibco(澳大利亚)。
1.4CCK8：广州晶欣生物科技有限公司。
2试验设计
细胞复苏后，培养至对数生长期，铺96孔板，100μL/孔，培养24小时后吸出培养基，加入药液，培养48小时，每孔加10μL的CCK8，培养4小时左右，用酶标仪450nm波长测定OD值，计算各浓度的抑制率和IC50。
2.1细胞培养
细胞复苏后，培养至对数生长期，稀释到细胞密度：Hela：2×104细胞/mL，A549：1×105细胞/mL，PC-3：1×104细胞/mL，LOVO、4T1：3×104细胞/mL。
2.2药物浓度设计
阳性药顺铂购自中山大学肿瘤医院医院。试验样品虫草素和亚硒酸钠购自阿拉丁试剂公司；亚硒酸二虫草素(Se2cor)和硒酸二虫草素(n-Se2cor)分别从实施例2和5制备。亚硒酸二胆碱(Se2ch)和硒酸二胆碱(n-Se2ch)按照中国发明专利申请201410165697.8的方法(如实施例2和实施例5)制备；磷酸硒钾(FS01)的按照中国发明专利申请200610136924X的方法(如实施例1)制备。
以上阳性药物和试验样品用灭菌水溶解，配成浓度如表1的溶液：
药液配制方法：
吸出各受试物溶液，加入培养基均匀，0.22μm过滤膜过滤，并依次用培养基稀释，得到系列终浓度的药液。
顺铂加入后的终浓度为1-100mg/L(1、3、8、20、50、100mg/L)。
虫草素加入后的终浓度为0.4-320mg/L(0.4、1、2、5、10、30、80、160、320mg/L)，Se2cor、n-Se2cor(以含虫草素量计)加入的终浓度为0.1-100mg/L(0.1、0.2、0.4、1、3、8、20、50、100mg/L)。
n-Se2ch、Se2ch、FS01、亚硒酸钠(以含硒量计)加入后的终浓度为0.1-100mg/L(0.1、0.2、0.4、1、3、8、20、50、100mg/L)。
2.3操作步骤
1)细胞培养条件：37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养。
2)培养基：10％胎牛血清的DMEM培养基。
3)细胞复苏后，培养至对数生长期细胞。
4)分别取1-3瓶细胞，倒去培养液，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗2次，每瓶用0.25％胰酶1mL消化。
5)细胞脱壁后加入3-5mL培养液中止消化，洗下细胞吸至离心管中。
6)1000转/分钟离心3分钟，吸去上清，加1-2mL培养液吹打均匀，用细胞计数板进行细胞浓度计数。
7)根据计数结果，用培养基将细胞调节至各自密度各种细胞相应浓度。
8)种板至2或3块96孔板(最外圈各孔加PBS，对照组用中间3个孔，不加细胞液，只加培养基)，100μL/孔，培养24h。
9)将前一天培养基吸出，每孔加入已配好的试验组药液和阳性药组药液，100μL/孔，每个药物浓度用3个复孔。
10)孵育48h后，观察细胞形态，加入CCK810μL/孔，孵育4h后，在450nm酶标仪读板并拍照。
2.4结果处理和分析
细胞生长抑制率＝(1-试验组OD/对照组OD)×100％
用Origin7.0软件以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定药物的半数抑制浓度IC50(growth-inhibitory concentration)，即细胞存活率达到一半时的药物作用浓度。
3结果
检测出各孔OD值后，根据上述2.4的公式计算各个药物不同药物浓度对各个细胞的抑制率，并对应于药物浓度的反对数作图，计算出IC50，均转换为μM后结果如表2所示。
表2对人癌细胞细胞生长的抑制作用(IC50，μM)
注：Se2cor、n-Se2cor、虫草素以含虫草素量计，n-Se2ch、Se2ch、FS01、亚硒酸钠以含硒量计。
括号内的值为n-Se2cor或Se2cor的硒量(μM)。
--表示无实验数据。
结果表明，以含虫草素量计，硒酸二虫草素和亚硒酸二虫草素体外对各种癌细胞有抑制作用，其作用和顺铂相当，且远高于单独使用虫草素的效果；以含硒量计，其效果显著高于亚硒酸钠、磷酸硒钾、亚硒酸二胆碱和硒酸二胆碱；其中，无论以虫草素量计还是以含硒量计，亚硒酸二虫草素对各种癌细胞的抑制效果均优于硒酸二虫草素。
实施例10细胞凋亡试验
1实验方法
1.1细胞培养A549(人非小细胞肺癌细胞)按实施例9进行。分对照组(未用药)、虫草素组(100μM)、硒酸二虫草素(n-Se2cor)组(2.5μM)、亚硒酸二虫草素组(Se2cor)组(2.5μM)和亚硒酸钠组(2.5μM)，以上各试药浓度以分子当量计。虫草素和亚硒酸钠从阿拉丁试剂公司购得，Se2cor和n-Se2cor分别从施例2和5制备。
1.2细胞形态变化
定时用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化；透射电镜观察细胞超微结构；用Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态的变化。
1.3流式细胞仪PI染色法(PI染液终浓度50mg/L)检测细胞周期变化、凋亡率和bc1-2的变化(blc-2FITC荧光染料法)。
1.4免疫组织化学法测定NF-κBp65的表达采用酶标记的链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)。结果判断NF-κBp65抗体染色阳性细胞为单纯胞核出现棕褐色颗粒或胞核和胞质着色，以胞核着色为主。高倍(400倍)视野下随机计数10个视野，计算阳性的细胞数占细胞总数的百分率。
2实验结果
2.1对A549肺癌细胞周期及凋亡率的影响
虫草素(100μM)、n-Se2cor(2.5μM)、Se2cor(2.5μM)和亚硒酸钠(2.5μM)作用于A549肺癌细胞24h后，G0/G1期细胞比例下降，S期细胞比例升高，使细胞阻滞于S期，并出现典型的“亚二倍体”凋亡峰，凋亡率升高，与对照组比较差异有统计学意义，P分别是＜0.05，＜0.05，＜0.01和＜0.05；凋亡率明显增加，与对照组比较差异有统计学意义，P分别是＜0.05，＜0.05，＜0.01和＜0.05。结果见表3。
2.2对A549肺癌细胞细胞形态的影响
倒置显微镜下观察A549肺癌细胞，未用药组表现为细胞呈梭形生长，细胞数增多，可见典型的细胞分裂像，形成集落，可见多细胞融合。用药干预后细胞变圆，黏附性降低，部分漂浮于培养液中；透射电镜下观察未用药组细胞膜完整，胞核和细胞器结构清晰；用药后胞核固缩，核染色质浓缩至核膜下呈新月状或环状，胞质浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成空泡，见明显的晚期凋亡细胞。荧光显微镜下观察：Hoechst33258染色检测时，对照组细胞发蓝色荧光，核呈均匀的圆形，染色质分布均匀；用药组细胞体积变小，染色质致密浓染，聚集于核膜下呈颗粒状块或月牙形。
表3对A549肺癌细胞细胞周期及凋亡率的影响(％)
2.3对A549肺癌细胞NF-κBp65表达的影响
用药物作用24h后，NF-κBp65的表达下调，虫草素(100μM)6.8％、n-Se2cor(2.5μM)18％、Se2cor(2.5μM)32％和亚硒酸钠(2.5μM)11％，与对照组比较差异有统计学意义，P分别是＜0.05，＜0.01，＜0.01和＜0.05；n-Se2cor(2.5μM)组、Se2cor(2.5μM)组与虫草素组比较差异有统计学意义，P分别是＜0.05，＜0.01；n-Se2cor(2.5μM)组、Se2cor(2.5μM)组与亚硒酸钠组比较差异有统计学意义，P分别是＜0.05，＜0.01。结果见表4。
表4对A549肺癌细胞NF-κBp65和bc1-2表达的影响
结果表明，虫草素、亚硒酸钠、硒酸虫草素和亚硒酸虫草素对A549肺癌细胞有促进细胞凋亡作用，抑制细胞bc1-2的表达，可能与抑制NF-κBp65水平有关。作用强度：虫草素＜亚硒酸钠、硒酸虫草素＜亚硒酸虫草素，亚硒酸虫草素作用最强，硒和虫草素可能有协同作用。
中国专利申请201410165697.8和201410334641.0公开了一种含硒化合物的胆碱盐，有较好的抗癌作用，重要的是有较好的脂溶性，拓展了硒补充剂药用剂型的应用范围；中国专利申请201410473434.3公开了一种含硒化合物的罗通定，有较好的抗癌作用，更重要的潜在应用是对癌症疼痛的镇痛作用。相比之下，本专利的技术方案在抗癌作用更有优势。中药虫草有抗肿瘤作用，能增强肿瘤病人的免疫力。虫草的有效成份虫草素有确切的抗癌作用，在临床上已用于治疗白血病，确切的机理包括(1)抑制嘌呤、DNA/RNA的生物合物和mTOR的信号通路；(2)诱导凋亡和细胞周期调控；(3)抵抗肿瘤转移；等等。虫草素的抗癌作用是胆碱或罗通定所没有的，因此相比含硒化合物的胆碱盐和含硒化合物的罗通定，本发明的含硒虫草素化合物的抗肿瘤作用比含硒化合物的胆碱盐和含硒化合物的罗通定的作用更强，能更有效地清除癌细胞、抑制肿瘤的生长。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (15)

1.一种含硒化合物的虫草素盐，其结构如通式(I)所示：
其中，n＝1或2，x＝3或4。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述含硒化合物的虫草素盐为：
3.一种制备权利要求1或2所述含硒化合物的虫草素盐的方法，该方法包括使用虫草素与硒氧化物、硒酸或亚硒酸进行反应的步骤。
4.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1或2所述的一种或多种含硒化合物的虫草素盐作为活性成分以及药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、注射剂、酊剂、栓剂、胶囊剂、软膏剂、眼用制剂、丸剂、植入剂、糖浆剂、气雾剂、膜剂、颗粒剂、口服溶液剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、洗剂、搽剂、凝胶剂或贴剂的形式。
6.一种保健食品组合物，该保健食品组合物包含权利要求1或2所述的一种或多种含硒化合物的虫草素盐作为活性成分以及食品级辅料。
7.权利要求1或2所述的含硒化合物的虫草素盐在制备用于预防和/或治疗硒元素缺乏引起的疾病或病症的药物或保健食品中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述硒元素缺乏引起的疾病或病症选自大骨节病、克山病、心血管疾病、肝病、肾功能衰竭、神经系统疾病、免疫预防和炎症性疾病、艾滋病、糖尿病、内分泌紊乱、男性不育症、癌症、衰老有关的疾病、有毒金属的中毒和前列腺疾病。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭和冠心病。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肝病选自酒精性肝损伤和肝硬化。
11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述神经系统疾病选自神经退行性疾病、强迫性精神障碍和抑郁症。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金斯氏病、多发性硬化症、巴滕氏病和癫痫以及由缺血性损伤、接触环境毒素、滥用药物、脑肿瘤引起的神经退行性疾病。
13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述免疫预防和炎症性疾病选自类风湿性关节炎、哮喘和Crohn’s病、牛皮癣、红斑狼疮、败血症和败血症样疾病。
14.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症选自列腺癌、膀胱癌、肺癌、直肠癌、肝癌、大肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、霍奇金淋巴瘤和巴雷特食管癌。
15.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述前列腺疾病选自前列腺良性增生和前列腺炎。
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