WO2020155673A1 - 三元复合纳米体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Definitions

  • the invention belongs to the field of pharmacy, and relates to a novel anti-tumor drug preparation, specifically a ternary composite nano system based on iron compound-benzene ring-containing small molecule anti-tumor active compound-polyphenol compound and its preparation method and application.
  • a ternary composite nano system the system includes an iron compound, a small molecule anti-tumor active compound containing a benzene ring, and a polyphenol compound, and the weight ratio of the three is 1-4:2-10:5-20.
  • step (3) Add a solution of a small molecule anti-tumor active compound containing a benzene ring to the mixed solution of step (2), add a precipitation solvent after mixing, and collect the product after centrifugation, reconstitution, and ultrasound.
  • Example 3 Preparation of ternary composite nano-system of ferric citrate/tea polyphenol/doxorubicin hydrochloride
  • the weight ratio of 2:4:6 accurately weigh ferrous sulfate, catechin, and epirubicin hydrochloride, respectively, and dissolve in purified water, vortex to mix, and combine the ferrous sulfate solution and catechin solution prepared above Mix and stir, inject an ethanol-water mixture with a volume of 20 times the total volume of the mixed solution of ferrous sulfate and catechin under stirring conditions, and continue to stir for 1-60 minutes.
  • Add the epirubicin hydrochloride solution to the above-mentioned stirring system continue to stir for 1-60 min, then add 50 times the volume of the total volume of the mixed solution of ferrous sulfate and catechin sodium bicarbonate, centrifuge, and reconstitute the precipitate with water.
  • the probe is sonicated for 8-30 minutes to prepare a ternary composite nano system.
  • Example 5 Preparation of the ternary composite nano-system of ferrous sulfate/epicatechin/epirubicin hydrochloride
  • Example 9 Preparation of ternary composite nano-system of ferrous fumarate/apple polyphenol/arubicin hydrochloride
  • Example 10 Preparation of ternary composite nano-system of ferrous chloride/tannic acid/indocyanine green
  • MCF7 cells were inoculated in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 /well, incubated at 37°C for 24 hours, the culture solution was aspirated, and 0.35 ⁇ g/mL of free benzene ring-containing small molecule anti-tumor active compounds and benzene ring-containing compounds were added respectively.
  • 2 mL of small molecule anti-tumor active compound-polyphenol compound-iron compound ternary composite nano solution incubated at 37°C for 48h, add 100 ⁇ L of PI, mix gently, and react at room temperature for 15 minutes in the dark or 30 minutes at 4°C. Add 2mL labeling buffer, and immediately go to the machine (flow cytometer) for detection.
  • the cells were washed three times with PBS, and the cells were resuspended in 1 mL of ice-cold PBS, and immediately tested on the machine (flow cytometer). Measure the fluorescence intensity of each group, and measure the fluorescence intensity of the blank group and the control group in the same way, and calculate the relative concentration of ROS according to formula (2). It can be seen from Table 6 that the ternary composite nano system group can generate a large amount of ROS, which indicates that the iron compound and the multi-class compound induce the Fenton reaction in the cell to induce the production of ROS, and the photodynamic therapy is combined with laser irradiation to synergistically induce the production A large amount of ROS has a better killing effect on cells.
  • MCF7 cells in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 /well, incubate at 37°C for 24 hours, aspirate the culture solution, and add 0.35 ⁇ g/mL of free benzene ring-containing small molecule anti-tumor active compounds and benzene ring-containing compounds.
  • Small molecule anti-tumor active compound-polyphenol compound-iron compound ternary composite nano solution 2mL incubated at 37°C for 48h, washed 3 times with PBS, digested with 0.25% trypsin, centrifuged at 1000r for 5min, and used 0.5mL Resuspend the cells in PBS and transfer them to a glass test tube.

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Abstract

三元复合纳米体系及其制备方法和应用，所述体系包括铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物，三者的重量比为1-4∶2-10∶5-20。相对于现有技术，仅通过物理组装手段可将不同的小分子化合物或药物进行稳定组装，所形成的复合纳米药物不仅小分子抗肿瘤活性化合物的抗肿瘤治疗作用，还具有铁化合物与多酚类化合物基于胞内芬顿反应而介导的铁死亡治疗效应，此外，形成的新型复合纳米药物还具有突出的光热效应，可整合化疗、铁死亡治疗与光热疗法为一体，三者协同作用，相互增效，达到多位一体的联合抗肿瘤治疗效果。

Description

三元复合纳米体系及其制备方法和应用 技术领域
本发明属于药剂学领域，涉及一种新型抗肿瘤药物制剂，具体为基于铁化合物-含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物的三元复合纳米体系及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是目前威胁人类健康的主要疾病之一，传统化疗药物作为目前临床癌症治疗的主体，常常由于生物利用度低、易产生多药耐药等弊端无法获得满意的治疗效果，因此临床上常采用联合用药方式。化疗药物联合使用能够产生协同效应，提高治疗效果；而且由于化疗药物作用机制不同，可在一定程度上预防多药耐药的产生。但化疗联合治疗并不能解决传统化疗药固有的缺陷，如特异性差、非期望的药动学和生物分布等，这些均导致化疗药物在杀死肿瘤细胞时对正常组织也造成严重损害；且联合治疗往往具有增强的毒副作用，患者顺应性和耐受性差，大大限制了联合化疗在临床上的应用。
“铁死亡”(ferroptosis)是2012年Dxion提出的一种新型的细胞死亡方式，可通过介导胞内脂质过氧化物(LPO)累积至铁蛋白死亡水平而最终诱导细胞死亡，其本质是一种新型的细胞氧化性死亡方式(Dixon S,LembergK,Lamprecht M,et al.Ferroptosis:An Iron-Dependent Form ofNonapoptotic Cell Death[J].Cell,2012(5),149.)。利用铁死亡介导肿瘤细胞死亡可绕过肿瘤细胞凋亡通路，因而避免其他肿瘤治疗方式如化疗、光热治疗等经凋亡通路介导细胞死亡引起的耐药(V.S.Viswanathan,M.J.Ryan,H.D.Dhruv,et al.Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway[J].Nature,2017(7664)：453-457.)。铁死亡治疗与其他肿瘤治疗方式如化疗、光热治疗、光动力治疗联合应用，还可缓解单一疗法容易导致的治疗抗性等局限性。以铁死亡诱导剂Erastin为例，Erastin可抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白摄取胱氨酸从而抑制胞内谷胱甘肽(GSH)的合成，进而降低胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)，使细胞的抗氧化能力降低。同时胞内多不饱和脂肪酸(PUFAs)可持续氧化，并以立体特异性方式产生LPO。在铁存在的情况下，LPO进一步形成毒性脂质自由基，如烷氧基自由基，最终诱导铁死亡。此外，这些产生的脂质自由基还能转移邻近PUFAs的质子，随后启动新一轮的脂质氧化反应并进一步传递氧化性损害，产生循环放大的细胞杀伤效应(Stockwell B R,José Pedro,Angeli F,et al.Ferroptosis:A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism,Redox Biology,and Disease[J].Cell,2017(2):273-285.)。此外，铁化合物还可通过参与胞内芬顿反应，产生大量活性氧(Reactive oxygen species,简称ROS)并插入脂膜形成LPO，从而高效介导铁死亡(Hofmans S,Berghe T V,Devisscher L,et al.Novel ferroptosis inhibitors with improved potency and ADME properties[J].Journal of Medicinal Chemistry,2015(5):2041-53)。然而，铁化合物用于肿瘤治疗所需剂量大，毒副作用风险高，因此其使用受到限制。
含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物往往具有严重的毒副作用，此外，其他无机纳 米光热材料具有无法降解的弊端，从而带来不可预知的潜在毒性。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，解决抗肿瘤活性小分子化合物单一治疗易诱导耐药的缺陷，改善铁化合物应用于肿瘤治疗药物中的技术瓶颈，本发明提供了基于铁化合物-含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物的三元复合纳米体系及其制备方法和应用。具体目的如下：
目的1：获得一种基于铁化合物-含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物的三元复合纳米体系及其制备方法。
目的2：提供上述三元复合纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用，实现铁死亡治疗、光热治疗和化疗或光动力治疗的联合治疗。
目的3：拓宽上述三元复合纳米体系中含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物的治疗窗。
目的4：破除上述三元复合纳米体系中含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物耐药、抗肿瘤纳米药物的深层递送等壁垒。
目的5：以上述三元复合纳米体系为基础，提供一种改善铁死亡治疗-光热治疗-化疗或光动力治疗三重联合治疗毒副作用的策略。本发明所设计的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系可以通过以下机制降低这些现有或潜在的毒副作用：①提高各活性组分的肿瘤靶向分布，降低其非选择性全身分布，以降低系统毒性；②该纳米体系的各组装单元均为可降解和可代谢的活性成分，避免了金纳米粒等无机光热材料无法降解带来的毒副作用；③多酚类化合物与铁离子在胞内的芬顿反应通过促进胞内ROS和LPO的生成，能够大幅提高单纯铁离子介导的铁死亡的反应效率，从而提高铁剂的利用率，降低其剂量，达到减毒的效果。
技术方案：三元复合纳米体系，所述体系包括铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物，三者的重量比为1-4:2-10:5-20。
所述三元复合纳米体系粒径为10-1000nm。
优选的，所述铁化合物为柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、硫酸亚铁、枸橼酸铁铵、富马酸亚铁、氯化亚铁和六水合氯化铁中的至少一种。
优选的，所述含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物为盐酸阿霉素、盐酸依达比星、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸阿柔比星、盐酸表柔比星、盐酸米托蒽醌、米托蒽醌甲磺酸盐、美法仑、昂丹司琼、吲哚菁绿、甲氨蝶呤、盐酸伊立替康和紫杉醇中的至少一种。
优选的，所述多酚类化合物为鞣酸、儿茶素、表儿茶素、没食子酚儿茶素、表没食子酚儿茶素、茶多酚、苹果多酚、圣草酚、葡萄多酚和白藜芦醇中的至少一种。
以上任一所述三元复合纳米体系的制备方法，所述方法为铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物在溶液环境中自组装形成三元复合纳米体系。
优选的，所述方法为铁化合物和多酚类化合物首先通过配位化学组装形成预组装基元，进而与含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物通过π-π共轭作用形成三元复合纳米体系。
进一步的，所述方法具体步骤如下：
(1)分别称取铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物，并配 制成水溶液；
(2)混合铁化合物和多酚类化合物溶液，混合过程中加入有机溶剂；
(3)向步骤(2)的混合溶液中加入含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物溶液，混匀后加入沉淀溶剂，离心、复溶、超声后收集产物。
优选的，步骤(2)中的有机溶剂为乙醇、乙醇水、甲醇、甲醇水、异丙醇、异丙醇水中的至少一种。
优选的，步骤(3)中的沉淀溶剂为氨水、碳酸钠、尿素、碳酸氢铵、六次甲基四胺、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠溶液中的至少一种。
优选的，步骤(2)中有机溶剂加入量为步骤(1)中铁化合物和多酚类化合物水溶液总体积的2-100倍，步骤(3)中沉淀溶剂加入量为步骤(1)中铁化合物和多酚类化合物水溶液总体积的0.2-50倍。
以上任一所述三元复合纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述三元复合纳米体系的原理在于：该三元复合纳米体系在细胞内解聚后，游离的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物在胞内发挥其相应化疗或光动力治疗作用，抑制肿瘤细胞的增殖，同时游离的铁离子与多酚类化合物在细胞内发生芬顿反应产生大量的ROS堆积于脂膜，进一步诱导胞内LPO产生，诱导铁死亡。此外，该纳米粒复合体系还具有良好的光热效应，不仅可以进一步促进胞内ROS产生，还可促进纳米粒在肿瘤中的深部递送，破除间质的对纳米药物的递送障碍，最终实现铁死亡治疗、光热治疗和化疗或光动力治疗的联合治疗。该三元复合纳米体系在含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物低浓度情况下也可保持较高肿瘤细胞杀伤活性，显著改善含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物治疗效果对药物浓度的高度依耐性。此外，提高了含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物在肿瘤细胞中的蓄积和滞留，使含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物在较宽浓度浮动区间内保持有效的细胞杀伤能力，显著抵消细胞物质平衡过程中由于药物浓度变化引起的治疗效果大幅波动的不利影响，提高含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物的治疗效果、降低含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物毒性，有效拓宽含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物的治疗窗。
有益效果：(1)本发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系只需通过物理组装，不改变药物化学结构，不同于化学修饰手段可能引起的构效关系的改变；突破了传统共轭修饰手段所构建的聚合物前药胶束、树状大分子前药纳米粒等因合成工艺复杂，药物小分子化学结构因化学修饰而发生改变，构效关系无法明确等因素导致的发展应用限制。
(2)本发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系制备方法简单，制备条件温和，避免了复杂制备方法造成的质量均一性差等问题，重现性好，产业转化技术简单。
(3)本发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系亦是一种可降解的新型光热复合纳米材料。
(4)本发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系便捷高效的实现了铁死亡治疗、光热治疗和化疗或光动力疗法的多位一体联合治疗，治疗功能性高度协同，潜在毒性互相化解；本发明提供的三元复合纳米体系不仅实现肿瘤铁死亡治疗、光热治疗与化疗或光动力疗法的联合治疗，而且还能通过提高肿 瘤靶向精度以较少药物的脱靶分布、以及促进主要单元组分含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物、多酚类化合物及铁化合物的胞内反应两重手段，降低这一多元联合治疗方案的毒副作用，提高这一多位一体联合体系的治疗实用性。
(5)本发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系可拓宽含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物的治疗窗。
(6)发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系还拓宽了铁制剂应用于肿瘤治疗领域的应用范围，大大提高了其介导肿瘤细胞铁死亡的效率，针对性解决了铁制剂单纯应用于肿瘤治疗时所需剂量大、毒性高的应用困境。
(7)本发明构建的含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物的三元复合纳米体系具有出色的肿瘤靶向性，可使所负载活性化合物选择性浓集于肿瘤细胞以提高其靶向分布效率，且可保护所负载化合物在血液循环中不被代谢为活性降低或失活的化合物，保持其的稳定性。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：氯化铁/单宁酸/盐酸多柔比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比4:2:5的比例精密称取氯化铁、单宁酸、盐酸多柔比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯化铁溶液和单宁酸溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯化铁和单宁酸混合溶液总体积5倍量的无水乙醇，继续搅拌1～60min。将盐酸多柔比星溶液加入上述搅拌中的体系继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯化铁和单宁酸混合溶液总体积0.2倍量的氨水，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例2：柠檬酸铁/茶多酚/盐酸柔红霉素三元复合纳米体系的制备
按照重量比4:6:9的比例精密称取柠檬酸铁、茶多酚、盐酸柔红霉素分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的柠檬酸铁溶液和茶多酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入搅拌条件下注入体积为柠檬酸铁和茶多酚混合溶液总体积10倍量的无水甲醇，继续搅拌1～60min。将盐酸柔红霉素溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为柠檬酸铁和茶多酚混合溶液总体积2倍量的尿素，离心，沉淀加水复溶，水浴超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例3：柠檬酸铁/茶多酚/盐酸多柔比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比4:6:9的比例精密称取柠檬酸铁、茶多酚、盐酸多柔比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的柠檬酸铁溶液和茶多酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为柠檬酸铁和茶多酚混合溶液总体积30倍量的无水异丙醇，继续搅拌1～60min。将盐酸多柔比星溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为柠檬酸铁和茶多酚混合溶液总体积0.4倍量的尿素，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例4：硫酸亚铁/儿茶素/盐酸表柔比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比2:4:6的比例精密称取硫酸亚铁、儿茶素、盐酸表柔比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的硫酸亚铁溶液与儿茶素溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为硫酸亚铁和儿茶素混合溶液总体积20倍量的乙醇水混合物，继续搅拌1～60min。将盐酸表柔比星溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为硫酸亚铁和儿茶素混合溶液总体积50倍量的碳酸氢钠，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例5：硫酸亚铁/表儿茶素/盐酸表柔比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比2:4:6的比例精密称取硫酸亚铁、表儿茶素、盐酸表柔比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的硫酸亚铁溶液与表儿茶素溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为硫酸亚铁和表儿茶素混合溶液总体积40倍量的甲醇水混合物，继续搅拌1～60min。将盐酸表柔比星溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为硫酸亚铁和表儿茶素混合溶液总体积42倍量的碳酸氢钠，离心，沉淀加水复溶，水浴超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例6：柠檬酸铁铵/白藜芦醇/盐酸米托蒽醌三元复合纳米体系的制备
按照重量比1:5:10的比例精密称取柠檬酸铁铵、白藜芦醇、盐酸米托蒽醌分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的柠檬酸铁铵溶液与白藜芦醇溶液混合搅拌，搅拌条件下体积为柠檬酸铁铵和白藜芦醇混合溶液总体积60倍量的注入异丙醇水混合物，继续搅拌1～60min。将盐酸米托蒽醌溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为柠檬酸铁铵和白藜芦醇混合溶液总体积34倍量的六次甲基四胺，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例7：柠檬酸铁铵/白藜芦醇/盐酸表柔比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比1:5:10的比例精密称取柠檬酸铁铵、白藜芦醇、盐酸表柔比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的柠檬酸铁铵溶液与白藜芦醇溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为柠檬酸铁铵和白藜芦醇混合溶液总体积50倍量的无水甲醇，继续搅拌1～60min。将盐酸表柔比星溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为柠檬酸铁铵和白藜芦醇混合溶液总体积26倍量的六次甲基四胺，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例8：富马酸亚铁/苹果多酚/盐酸依达比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比2:6:5的比例精密称取富马酸亚铁、苹果多酚、盐酸依达比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的富马酸亚铁溶液和苹果多酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为富马酸亚铁和苹果多酚混合溶液总体积60倍量的无水乙醇，继续搅拌1～60min。将盐酸依达比星溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为富马酸亚铁和苹果多酚混合溶液总体积36倍量的碳酸氢铵，离心，沉淀加水复溶，水浴超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例9：富马酸亚铁/苹果多酚/盐酸阿柔比星三元复合纳米体系的制备
按照重量比2:6:5的比例精密称取富马酸亚铁、苹果多酚、盐酸阿柔比星分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的富马酸亚铁溶液和苹果多酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为富马酸亚铁和苹果多酚混合溶液总体积80倍量的乙醇水混合物，继续搅拌1～60min。将盐酸阿柔比星溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为 富马酸亚铁和苹果多酚混合溶液总体积50倍量的碳酸氢铵，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例10：氯化亚铁/鞣酸/吲哚菁绿三元复合纳米体系的制备
按照重量比1:5:4的比例精密称取氯亚化铁、鞣酸、吲哚菁绿分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯亚化铁溶液和鞣酸溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯化亚铁和鞣酸混合溶液总体积40倍量的无水异丙醇，继续搅拌1～60min。将吲哚菁绿溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯化亚铁和鞣酸混合溶液总体积34倍量的乙二胺四乙酸二钠，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例11：氯化亚铁/圣草酚/紫杉醇三元复合纳米体系的制备
按照重量比1:5:10的比例精密称取氯亚化铁、圣草酚、紫杉醇分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯亚化铁溶液和圣草酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯亚化铁和圣草酚混合溶液总体积50倍量无水甲醇，继续搅拌1～60min。将紫杉醇溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯亚化铁和圣草酚混合溶液总体积15倍量氨水，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例12：氯化亚铁/圣草酚/甲氨蝶呤三元复合纳米体系的制备
按照重量比1:5:10的比例精密称取氯亚化铁、圣草酚、甲氨蝶呤分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯亚化铁溶液和圣草酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯亚化铁和圣草酚混合溶液总体积70倍量异丙醇水混合物，继续搅拌1～60min。将甲氨蝶呤溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯亚化铁和圣草酚混合溶液总体积18倍量氨水，离心，沉淀加水复溶，水浴超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例13：氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑三元复合纳米体系的制备
按照重量比3:6:9的比例精密称取氯化铁、没食子酚儿茶素、美法仑分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯化铁溶液和没食子酚儿茶素溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯化铁和没食子酚儿茶素混合溶液总体积30倍量无水乙醇，继续搅拌1～60min。将美法仑溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯化铁和没食子酚儿茶素混合溶液总体积17倍量氨水，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例14：氯化铁/表没食子酚儿茶素/美法仑三元复合纳米体系的制备
按照重量比3:6:9的比例精密称取氯化铁、表没食子酚儿茶素、美法仑分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯化铁溶液和表没食子酚儿茶素溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯化铁和表没食子酚儿茶素混合溶液总体积45倍量无水甲醇，继续搅拌1～60min。将美法仑溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯化铁和表没食子酚儿茶素混合溶液总体积24倍量氨水，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例15：氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼三元复合纳米体系的制备
按照重量比5:6:8的比例精密称取氯化铁、葡萄多酚、昂丹司琼分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯化铁溶液和葡萄多酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯化铁和葡萄多酚混合溶液总体积40倍量无水乙醇，继续搅拌1～60min。将昂丹司琼溶液加 入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯化铁和葡萄多酚混合溶液总体积27倍量氨水，离心，沉淀加水复溶，探头超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例16：氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康三元复合纳米体系的制备
按照重量比5:6:8的比例精密称取氯化铁、葡萄多酚、盐酸伊立替康分别溶于纯化水，涡旋混匀，将上述制备的氯化铁溶液和葡萄多酚溶液混合搅拌，搅拌条件下注入体积为氯化铁和葡萄多酚混合溶液总体积100倍量乙醇水混合物，继续搅拌1～60min。将盐酸伊立替康溶液加入上述搅拌中的体系，继续搅拌1～60min，随后加入体积为氯化铁和葡萄多酚混合溶液总体积48倍量氨水，离心，沉淀加水复溶，水浴超声8～30min，制得三元复合纳米体系。
实施例17：三元复合纳米体系粒径测定
取实施例1-16制备得到的三元复合纳米体系1mL用水稀释到3mL，用粒径测定仪(Malvem Instruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表1。由表可知，制备得到的三元复合纳米体系，纳米体系粒径达到纳米级，且粒径分布均匀。
表1 三元复合纳米体系的表征
Figure PCTCN2019111940-appb-000001
实施例18：三元复合纳米体系的载药量
载药量检测方法：采用紫外吸光光度法，对含有共轭结构的治疗药物在其最大吸收波长处绘制峰面积与浓度的标准曲线。对载药后的三元复合纳米体系在上述最大吸收波长处测得峰面积，再按照标准曲线计算浓度，并以公式(1)计算载药量。由表2可知各个体系的载药量均在6.5％以上，证明该体系具有较高的载药效率，有利于提高药物在肿瘤部位的选择性聚集，提高药物的载药量，降低药物的副作用。
Figure PCTCN2019111940-appb-000002
注：M 1(mg)为含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物投入质量，M 2(mg)为上清液中含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物的质量，M 3(mg)为铁化合物投入的质量，M 4(mg)为多酚类化合物的投入质量。
表2 三元复合纳米体系的载药量
Figure PCTCN2019111940-appb-000003
实施例19：PI单染法检测不同体系对MCF7细胞的抑制作用
取MCF7细胞以5×10 5/孔接种于6孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入0.35μg/mL的游离含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物三元复合纳米溶液2mL，37℃孵育48h后，加入100μL PI，轻轻混匀， 避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。加入2mL标记缓冲液，立即上机(流式细胞仪)检测。测定各组的荧光强度，并以相同方法测定空白组荧光强度以及对照组荧光强度，n＝6，记录流式细胞仪的PI(％)数值。由表3可知三元复合纳米体系组的细胞毒性(PI％)明显强于游离药物，且该制剂还能联用光动力疗法，实现了化疗药物与光动力疗法的联合使用，具有良好的抗肿瘤效果。
表3 PI单染法检测不同体系对MCF7细胞的抑制作用
Figure PCTCN2019111940-appb-000004
Figure PCTCN2019111940-appb-000005
注：与游离药物组相比 **P<0.01，与无激光照射三元复合纳米体系组相比 ##P<0.01。
实施例20：PI单染法检测不同体系对人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的抑制作用
取MCF7/ADR细胞以5×10 5/孔接种于6孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入0.35μg/mL的游离含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物三元复合纳米溶液2mL，37℃孵育48h后，加入100μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。加入2mL标记缓冲液，立即上机(流式细胞仪)检测。测定各组的荧光强度，并以相同方法测定空白组荧光强度以及对照组荧光强度(n＝6)， 记录流式细胞仪的PI(％)数值。由表4可知三元复合纳米体系组的对于耐药性细胞株的治疗效果(PI％)明显强于游离药物，证明该三元复合纳米体系对于产生耐药性的肿瘤细胞也具有较好的治疗效果。
表4 PI单染法检测不同体系对MCF7/ADR细胞的抑制作用
Figure PCTCN2019111940-appb-000006
Figure PCTCN2019111940-appb-000007
注：与游离药物组相比 **P<0.01，与无激光照射三元复合纳米体系组相比 ##P<0.01。
实施例21:光热实验
采用红外热像仪对含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物三元复合纳米溶液的光热性能进行记录，以监测温度。将含有不同浓度的纳米粒(10μg/mL)的PBS分散体暴露于激光(808nm，0.5W/cm 2)下照射10min，并记录温度变化。由表5可知三元纳米体系组具有较好的光热转换能力，证明本发明的三元复合纳米体系可以用于光热治疗，开发了一种新型的光热材料。
表5 三元复合纳米体系的温度变化
Figure PCTCN2019111940-appb-000008
实施例22:ROS检测实验
取MCF7细胞以5×10 5/孔接种于6孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入0.35μg/mL的游离含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物三元复合纳米溶液2mL，37℃孵育48h后，加入DHE荧光探针，轻轻混匀，在孵箱中孵育30分钟。孵育结束后用PBS洗三遍，将细胞重悬于1mL的冰冷PBS，立即上机(流式细胞仪)检测。测定各组的荧光强度，并以相同方法测定空白组荧光强度以及对照组荧光强度，按公式(2)计算ROS的相对浓度。由表6得知三元复合纳米体系组能产生大量的ROS，表明是铁化合物与多分类化合物在细胞内发生芬顿反应诱导ROS的产生，并且经激光照射时联合光动力疗法，协同诱导产生大量ROS，对细胞具有更好的杀伤作用。
Figure PCTCN2019111940-appb-000009
表6 ROS检测实验
Figure PCTCN2019111940-appb-000010
Figure PCTCN2019111940-appb-000011
实施例23:LPO检测实验
取MCF7细胞以5×10 5/孔接种于6孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入0.35μg/mL的游离含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物-多酚类化合物-铁化合物三元复合纳米溶液2mL，37℃孵育48h后，用PBS洗3遍，用0.25％的胰酶消化细胞，1000r离心5min，用0.5mL的PBS将细胞重悬并转移至玻璃试管，向每个管中加入等体积的Extract R饱和甲醇并涡旋，随后向每个管中加入1mL冷氯仿，涡旋使之充分混合，并且在0℃下以1,500×g离心混合物5分钟，用巴斯德吸管或注射器针头，收集底部氯仿层。将氯仿层转移到另一个试管中并储存在冰上，加入一定量的显色液，用酶标仪在500nm波长下检测吸光值。测定各组的荧光强度，并以相同方法测定空白组荧光强度以及对照组荧光强度，按公式(3)计算LPO的相对浓度。由表7可知，三元复合纳米体系能诱导LPO的大量产生，与游离制剂组、对照组之间有着显著性差别，且光照组的对LPO的促进作用更为明显，表明三元纳米体系组可以产生LPO诱导铁死亡，且联合激光照射时更能进一步促进铁死亡的发生，实现了光疗与铁死亡的联合使用，并且光疗对铁死亡有着促进作用。
Figure PCTCN2019111940-appb-000012
表7 LPO检测不同体系对MCF7细胞中LPO的相对浓度
Figure PCTCN2019111940-appb-000013
Figure PCTCN2019111940-appb-000014
实施例24:药效学评价
将荷瘤小鼠分为22组，每组3只分别为阴性对照组(Control)、游离阿霉素组、氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素组、氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素+Laser组、游离吲哚菁绿组、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿组、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿+Laser组、游离紫杉醇组、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇组、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇+Laser组、游离甲氨蝶呤组、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤组、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤+Laser组、游离美法仑组、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑组、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑+Laser组、游离昂丹司琼组、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼组、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼+Laser组、游离盐酸伊立替康组、氯化铁/葡萄多酚/盐酸 伊立替康组、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康+Laser组，当小鼠的瘤体积长至100mm 3时，在第1,3,5天通过尾静脉注射游离阿霉素(5mg/kg),氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素组(阿霉素的剂量为2mg/kg)、氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素+Laser组(阿霉素的剂量为2mg/kg)、游离吲哚菁绿组(350μg/kg)、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿组(吲哚菁绿剂量140μg/kg)、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿+Laser组((吲哚菁绿剂量140μg/kg)、游离紫杉醇组(10mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇组(紫杉醇剂量4mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇+Laser组(紫杉醇剂量4mg/kg)、游离甲氨蝶呤组(3mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤组(甲氨蝶呤剂量1.2mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤+Laser组(甲氨蝶呤剂量1.2mg/kg)、游离美法仑组(7.5mg/kg)、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑组(美法仑剂量3mg/kg)、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑+Laser组(美法仑剂量3mg/kg)、游离昂丹司琼组(8mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼组(昂丹司琼剂量3.2mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼+Laser组(昂丹司琼剂量3.2mg/kg)、游离盐酸伊立替康组(2mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康组(伊立替康剂量0.8mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康+Laser组(伊立替康剂量0.8mg/kg)，对于联合激光治疗的实验组，用808nm激光以1W/cm2照射小鼠的肿瘤5分钟。于实验第21天，将小鼠安乐死，每天记录小鼠的体重和量瘤的大小，用于计算瘤的体积和重量和计算抑瘤效率。由表8可知三元复合纳米体系组对于荷瘤小鼠具有较好的治疗效果，这是由于制剂良好的纳米粒径通过EPR效应在肿瘤部位聚集，提高了游离药物的抗肿瘤效果，且降低了游离药物对小鼠的毒副作用。
表8 不同三元复合制剂的药效学评价
Figure PCTCN2019111940-appb-000015
Figure PCTCN2019111940-appb-000016
注：与Control组相比 **P<0.01，与游离药物组相比 ##P<0.01，与无激光制剂组相比 @@P<0.01
实施例25:毒性检测实验
将荷瘤小鼠分为22组，每组3只分别为阴性对照组(Control)、游离阿霉素组、氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素组、氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素+Laser组、游离吲哚菁绿组、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿组、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿+Laser组、游离紫杉醇组、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇组、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇+Laser组、游离甲氨蝶呤组、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤组、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤+Laser组、游离美法仑组、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑组、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑+Laser组、游离昂丹司琼组、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼组、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼+Laser组、游离盐酸伊立替康组、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康组、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康+Laser组，当小鼠的瘤体积长至100mm 3时，在第1,3,5天通过尾静脉注射游离阿霉素(5mg/kg),氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素组(阿霉素的剂量为2mg/kg)、氯化铁/鞣酸/盐酸阿霉素+Laser组(阿霉素的剂量为2mg/kg)、游离吲哚菁绿组(350μg/kg)、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿组(吲哚菁绿剂量140μg/kg)、氯化铁/鞣酸/吲哚菁绿+Laser组((吲哚菁绿剂量140μg/kg)、游离紫杉醇组(10mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇组(紫杉醇剂量4mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/紫杉醇+Laser组(紫杉醇剂量4mg/kg)、游离 甲氨蝶呤组(3mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤组(甲氨蝶呤剂量1.2mg/kg)、氯亚化铁/圣草酚/甲氨蝶呤+Laser组(甲氨蝶呤剂量1.2mg/kg)、游离美法仑组(7.5mg/kg)、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑组(美法仑剂量3mg/kg)、氯化铁/没食子酚儿茶素/美法仑+Laser组(美法仑剂量3mg/kg)、游离昂丹司琼组(8mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼组(昂丹司琼剂量3.2mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/昂丹司琼+Laser组(昂丹司琼剂量3.2mg/kg)、游离盐酸伊立替康组(2mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康组(伊立替康剂量0.8mg/kg)、氯化铁/葡萄多酚/盐酸伊立替康+Laser组(伊立替康剂量0.8mg/kg)，对于联合激光治疗的实验组，用808nm激光以1W/cm 2照射小鼠的肿瘤5分钟。于实验第21天，将小鼠安乐死，取心肝脾肺肾制备病理切片并进行病理学检查分析。由表9可知游离药物对于正常组织具有较高的毒副作用，三元复合纳米体系可以有效的改善其产生的毒副作用，这是由于多酚类化合物是一种良好的供氢体，在细胞内起到还原作用，减少由于ROS对于正常组织的损伤。表明该制剂不经具有良好的抗肿瘤作用而且对于正常组织具有较好的保护作用，具有广泛的使用价值。
表9毒性评价
Figure PCTCN2019111940-appb-000017
Figure PCTCN2019111940-appb-000018
注：“-”无损伤，“+”轻度损伤，“++”中度损伤。

Claims (10)

  1. 三元复合纳米体系，其特征在于，所述体系包括铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物，三者的重量比为1-4:2-10:5-20。
  2. 根据权利要求1所述的三元复合纳米体系，其特征在于，所述铁化合物为柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、硫酸亚铁、枸橼酸铁铵、富马酸亚铁、氯化亚铁和六水合氯化铁中的至少一种。
  3. 根据权利要求1所述的三元复合纳米体系，其特征在于，所述含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物为盐酸阿霉素、盐酸依达比星、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸阿柔比星、盐酸表柔比星、盐酸米托蒽醌、米托蒽醌甲磺酸盐、美法仑、昂丹司琼、吲哚菁绿、甲氨蝶呤、盐酸伊立替康和紫杉醇中的至少一种。
  4. 根据权利要求1所述的三元复合纳米体系，其特征在于，所述多酚类化合物为鞣酸、儿茶素、表儿茶素、没食子酚儿茶素、表没食子酚儿茶素、茶多酚、苹果多酚、圣草酚、葡萄多酚和白藜芦醇中的至少一种。
  5. 权利要求1-4任一所述三元复合纳米体系的制备方法，其特征在于，所述方法为铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物在溶液环境中自组装形成三元复合纳米体系。
  6. 根据权利要求5所述的三元复合纳米体系的制备方法，其特征在于，所述方法为铁化合物和多酚类化合物首先通过配位化学组装形成预组装基元，进而与含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物通过π-π共轭作用形成三元复合纳米体系。
  7. 根据权利要求6所述的三元复合纳米体系的制备方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
    (1)分别称取铁化合物、含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物和多酚类化合物，并配制成水溶液；
    (2)混合铁化合物和多酚类化合物溶液，混合过程中加入有机溶剂；
    (3)向步骤(2)的混合溶液中加入含苯环的小分子抗肿瘤活性化合物溶液，混匀后加入沉淀溶剂，离心、复溶、超声后收集产物。
  8. 根据权利要求7所述的三元复合纳米体系的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的有机溶剂为乙醇、乙醇水、甲醇、甲醇水、异丙醇、异丙醇水中的至少一种。
  9. 根据权利要求7所述的三元复合纳米体系的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的沉淀溶剂为氨水、碳酸钠、尿素、碳酸氢铵、六次甲基四胺、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠溶液中的至少一种。
  10. 权利要求1-4任一所述三元复合纳米体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
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