CN113521298B - 一种单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药材料 - Google Patents

一种单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药材料 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药材料，所述材料为载药树状大分子表面包覆单宁酸/铁配合物。本发明方法反应条件简单，易于分离纯化，制备的单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药平台稳定性好，可在肿瘤微环境响应性释放药物。将其通过尾静脉注射入小鼠体内后，不仅可以实现肿瘤的MR成像，还可以在化疗的同时引起肿瘤细胞铁死亡，具有显著的治疗效果及潜在的临床应用价值。

Description

一种单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药材料
技术领域
本发明属于功能性载药材料领域，特别涉及一种单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药材料。
背景技术
肿瘤是21世纪威胁人类生命健康的最大杀手之一，传统的治疗方法包括手术切除、放疗及化疗等。化疗是一种最为常见的癌症治疗方式，但传统化疗药物存在诸多缺陷，例如：水溶性差、生物利用度低、对正常组织具有较大的毒副作用等。目前，纳米技术的发展为肿瘤的精准诊断和治疗提供了有效手段，通过构建纳米药物递送体系，可显著提高药物各方面的性能，降低药物的毒副作用，提高治疗效果。聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)是一种高度支化、单分散的合成大分子，具有丰富的表面官能团及内部空腔，可以表面修饰靶向分子，或在其内部负载药物及造影剂构建诊疗一体化纳米平台。而高代数的PAMAM树状大分子具有更稳定的三维结构，在生物医学领域具有更好的应用前景。
设计具有肿瘤微环境响应型纳米平台可以实现在肿瘤部位靶向释放药物，降低药物对正常组织的毒副作用，提高药物利用度，从而提高化疗疗效。肿瘤微环境的微酸性及高表达H2O2的特征为设计响应型纳米平台提供了新思路。
丰加霉素是一类具有二醇结构的化疗药物，它能够作用于内质网并阻止内质网应激(ERS)恢复稳态。在肿瘤细胞中，由于转录和代谢异常以及细胞增殖过快等会导致细胞内环境稳态遭到破坏，引起持续的内质网应激反应(Chen et al.Nat.Rev.Cancer.,2020,21(2),71-88)。IRE1α-XBP1信号通路是内质网应激过程中进化最为保守的一条通路。在内质网应激发生时，IRE1α寡聚并进行自身磷酸化，导致构象变化，从而激活其RNase结构域，从细胞质溶胶中的XBP1 mRNA中切除26个核苷酸片段。这种非常规的剪接会产生一个修饰的同工型mRNA(XBP1s)，XBP1s编码活化的蛋白质XBP1(也称为XBP1s)可作为有效且多功能的转录因子在一定程度上恢复并维持内质网稳态，使肿瘤细胞适应这种持续的内质网应激状态并存活(Yoshida et al.Cell,2001,107(7),881-891)。而丰加霉素可以作用于IRE1α的核糖核酸内切酶结构域，阻断核糖核酸内切酶对XBP1 mRNA的剪接而不影响IRE1α磷酸化后的激酶活性(Ri et al.Blood Cancer J.,2012,2,)，从而抑制内质网应激的适应性调节，最终引起细胞凋亡。但是丰加霉素由于不具有选择性，因此将其单独作为化疗药物时毒副作用较强，阻碍了其临床应用。
铁死亡是一种新型的区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的程序性死亡方式，它依赖于细胞内的铁，而与其他金属无关(Dixon et al.CELL,2012,5(149),1060-1072)。铁死亡主要通过铁离子参与的“芬顿反应”产生活性氧(ROS)和脂质过氧化物(LPO)，高水平的ROS和LPO会对细胞成分造成氧化损伤，扰乱细胞代谢，具有较强的杀伤癌细胞效果。到目前为止，多种含铁的纳米平台(例如铁纳米金属玻璃、氧化铁和金属-多酚网络)已被用作铁死亡诱导剂，用于治疗癌症。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种单宁酸/铁配合物包覆的响应型树状大分子载药材料，实现了药物的响应性释放，降低了毒副作用，并且由铁介导的化学动力学治疗过程中引起的氧化应激加重了肿瘤细胞的内质网应激从而促进了丰加霉素引起的内质网途径凋亡。
本发明提供一种响应型树状大分子载药材料，所述材料为载药树状大分子表面包覆单宁酸/铁配合物。
所述载药树状大分子为：药物通过硼酸酯键负载在树状大分子上；所述药物为丰加霉素Toy，树状大分子为第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2。
进一步，所述材料具体为载药纳米平台是在第五代PAMAM树状大分子表面修饰苯硼酸，然后通过硼酸酯键将丰加霉素负载到树状大分子上，并进一步包覆单宁酸/铁配合物得到。
本发明提供一种响应型树状大分子载药材料的制备方法，包括：
(1)将4-羧基苯硼酸PBA溶解在溶剂中，加入EDC和NHS活化，然后将活化后的PBA溶液逐滴加入到剧烈搅拌的G5.NH2溶液中，搅拌反应、透析、冻干，得到G5.NH2-PBA；
(2)将G5.NH2-PBA溶解在水中，加入三乙胺搅拌，使反应体系呈弱碱性，然后逐滴滴加乙酸酐将G5.NH2-PBA乙酰化，搅拌反应、透析、冻干，得到G5.NHAc-PBA；
(3)将G5.NHAc-PBA溶液与丰加霉素Toy溶液混合，搅拌反应、透析、冻干，得到pH和H2O2响应的树状大分子载药平台G5.NHAc-Toy；
(4)将FeCl3溶液和G5.NHAc-Toy溶液，涡旋混匀，然后再加入单宁酸TA溶液，涡旋混匀，透析，得到响应型树状大分子载药材料G5.NHAc-Toy@TF。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中EDC、NHS、PBA与G5.NH2的摩尔比是90-110：90-110：18-22：0.9-1.1。
所述步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO，活化反应时间为2-4h；PBA与G5.NH2的搅拌反应温度为室温，反应时间为23-25h。
所述步骤(2)中三乙胺、乙酸酐与G5.NH2-PBA的摩尔比为90-110：90-110：18-22：0.9-1.1。
所述步骤(2)中加入三乙胺搅拌时间为25-35min；滴加乙酸酐后反应时间为23-25h。
所述步骤(3)中G5.NHAc-PBA与Toy的摩尔比为1：16-18；搅拌反应时间为46-50h；所述G5.NHAc-PBA溶液、丰加霉素Toy溶液的溶剂均为水。
所述步骤(4)中FeCl3溶液、G5.NHAc-Toy溶液、单宁酸TA溶液的溶剂均为水；所述TA、FeCl3与G5.NHAc-Toy的摩尔比为9-11：9-11：0.9-1.1。
所述步骤(1)、(2)、(3)和(4)中的透析为：用截留分子量为3500Da的透析袋在超纯水中透析三天。
本发明提供一种所述响应型树状大分子载药材料在制备肿瘤的化疗/铁死亡和MR成像药物中的应用。
本发明首先在树状大分子表面修饰4-羧基苯硼酸PBA，并进行乙酰化得到G5.NHAc-PBA，然后通过响应性硼酸酯键负载化疗药物丰加霉素得到G5.NHAc-Toy，并以G5.NHAc-Toy作为模板，在其表面进一步包覆单宁酸/铁络合物得到pH和H2O2双响应的纳米载药平台G5.NHAc-Toy@TF。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、核磁共振氢谱(1H NMR)、红外光谱(FTIR)、紫外可见吸收光谱(UV-vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-OES)、透射电子显微镜(TEM)、核磁共振成像分析仪等手段表征制备的包覆单宁酸/铁配合物的响应型树状大分子载药平台的物理及化学性质。通过CCK-8分析评价负载药物的纳米材料的细胞毒性；利用ICP-OES检测了细胞对材料的吞噬情况；利用GSH和GSSG检测试剂盒检测了材料对细胞内的GSH水平的影响；利用激光共聚焦显微镜评价了材料对细胞内的ROS和LPO水平的影响；利用流式细胞仪检测了材料对细胞内线粒体膜电位的影响；通过Western blot蛋白印迹评价了材料对内质网应激相关蛋白GRP78、p-IRE1α、XBP1、XBP1s和CHOP的表达情况。最后建立裸鼠皮下肿瘤模型进行抗肿瘤实验。
本发明提供的包覆单宁酸/铁配合物的响应型树状大分子纳米载药平台，以克服丰加霉素在使用时的毒副作用，抑制肿瘤细胞内质网应激恢复稳态，并且在联合铁离子引起的铁死亡后，铁离子引起的“芬顿反应”打破了细胞内氧化还原平衡加重细胞内质网应激，促进细胞内质网应激途径的凋亡，增强了治疗效果，基于Fe3+还可用于肿瘤的MR成像的特性，实现了化疗/铁死亡联合治疗及MR成像。
有益效果
(1)本发明工艺简单，成本较低，易于操作分离，具有良好的发展前景。
(2)本发明制备的纳米平台具有良好的稳定性、水溶性及生物相容性，可以在肿瘤微环境响应性释放Toy，有效降低了Toy的毒副作用，为构建安全、智能、高效的药物载体提供了新思路。
(3)本发明制备的纳米平台可以通过表面包覆的单宁酸和铁离子产生“芬顿反应”，破坏细胞内的氧化还原平衡引起铁死亡。
(4)本发明制备的纳米平台一方面可以抑制细胞内质网应激恢复稳态，一方面可以通过铁死亡过程中产生ROS并且消耗掉GSH打破细胞内氧化还原平衡加重内质网应激，导致细胞经内质网途径凋亡，增强对肿瘤的抑制效果。
(5)本发明制备的纳米平台通过尾静脉注射进入小鼠体内后，具有显著的抗肿瘤效果，可以实现化疗/铁死亡联合治疗和MR成像，具有潜在临床应用价值。
附图说明
图1为本发明制备的G5.NHAc-Toy@TF的合成及应用示意图。
图2为本发明中制备的G5.NHAc-Toy@TF在水中、PBS中以及DMEM培养基中的水动力学直径随时间变化的曲线图。
图3为本发明制备的G5.NH2-PBA(a)、G3.NHAc-PBA(b)、Toy(c)、G5.NHAc-Toy(d)的1H NMR图谱；
图4为本发明制备的G5.NH2-PBA、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy的FTIR图谱；
图5为本发明制备的G5.NHAc-Toy@TF的TEM图(a和b)以及粒径分布直方图(c)；
图6为本发明制备的G5.NHAc-Toy@TF(DPTTF)的T1弛豫时间的倒数随Fe浓度变化的线性关系图；
图7为本发明制备的G5.NHAc-Toy和G5.NHAc-Toy@TF在不同条件下Toy的释放曲线图(a)和Fe释放曲线图(b)；
图8为Toy、G5.NHAc-Toy和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育24h后的细胞活力图；
图9为FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育不同时间后细胞吞噬的Fe元素含量分析图；
图10为Toy、TA、FeCl3、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育6h后细胞内GSH水平分析图；
图11为Toy、TA、FeCl3、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育6h后细胞内ROS水平分析图；
图12为Toy、TA、FeCl3、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育6h后细胞内LPO水平分析图；
图13为Toy、TA、FeCl3、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育6h后细胞内线粒体膜电位变化流式分析图；
图14为Toy、TA、FeCl3、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育6h后细胞内JC-1红/绿荧光比值定量分析图；
图15为Toy、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF与4T1细胞共孵育24h后对细胞中GRP78、p-IRE1α、XBP1、XBP1s和CHOP蛋白的Western blot试验结果图，其中(a)为Western blot的蛋白条带图，(b)、(c)、(d)、(e)和(f)为蛋白条带的灰度定量图；
图16为经尾静脉注射PBS、Toy、G5.NHAc-Toy、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF治疗肿瘤，记录14天内的肿瘤体积变化图(a)和体重变化图(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。G5.NH2购自美国Dendritech公司。PBA、EDC、NHS、TA与FeCl3购自百灵威科技有限公司(中国上海)。Toy购自上海伟寰生物科技有限公司(中国上海)。4T1细胞(鼠类乳腺癌细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和胰蛋白酶购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自上海七海生物科技有限公司(中国上海)。GSH与GSSH检测试剂盒、ROS检测试剂盒、JC-1检测试剂盒购自上海碧云天生物公司(中国上海)。裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化系统(Cascada I，PALL，中国北京)进行净化。
实施例1
(1)称取4-羧基苯硼酸(PBA)6.45mg，溶于5mL DMSO。称取37.3mg EDC和22.4mgNHS，分别溶于5mL DMSO中。先将EDC溶液滴加到PBA溶液中室温搅拌30min，然后将NHS溶液滴加到反应液中持续搅拌3h，活化PBA中的羧基。然后，称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH2)50mg，溶于10mL DMSO中，将上述经活化的PBA溶液逐滴加入到剧烈搅拌的G5.NH2溶液中，室温下持续搅拌反应1天。待反应结束后，将反应溶液转移到截留分子量为3500Da的透析袋中，于超纯水中透析3天。最后经冷冻干燥得到产物G5.NH2-PBA，密封储存于-20℃。
(2)称取50mg G5.NH2-PBA溶解在10mL超纯水中，然后在剧烈搅拌的情况下，向溶液中逐滴加入186μL三乙胺，使反应体系呈弱碱性，室温搅拌30min后，向反应体系中逐滴加入105μL乙酸酐，持续搅拌24h。反应结束后，使用截留分子量为3500Da的透析袋于超纯水中透析3天，冷冻干燥得到产物G5.NHAc-PBA，密封储存于-20℃。
(3)称取15mg G5.NHAc-PBA和2.9mg Toy分别溶于5mL超纯水中并混合，搅拌反应2天。反应结束后，使用截留分子量为3500Da的透析袋于超纯水中透析3天，经冷冻干燥得到产物G5.NHAc-Toy，密封储存于-20℃。
(4)称取33mg G5.NHAc-Toy溶于8mL超纯水中，并称取17mg TA和1.62mg FeCl3分别溶解在1mL超纯水中配制成10mM的溶液。将配制好的FeCl3溶液和G5.NHAc-Toy溶液混合，涡旋混匀；然后加入TA溶液，涡旋混匀，并使用截留分子量为3500Da的透析袋于超纯水中透析3天，得到G5.NHAc-Toy@TF溶液。
实施例2
取实施例1中合成的G5.NH2-PBA、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy各1mg，分别溶于1mL超纯水中，同时取250μL对比例1中合成的G5.NHAc-PBA@TF和实施例1中合成的G5.NHAc-Toy@TF溶于750μL超纯水，用于测定表面电势、水动力学直径及分散系数。结果如表1所示，G5.NH2-PBA的电势为25.5mV，乙酰化后G5.NHAc-PBA电势变为7.2mV，电势的下降证明了G5.NH2-PBA的剩余氨基被成功乙酰化。当G5.NHAc-PBA负载化疗药物Toy后，电势由正变负，降至-4.4mV，证明了Toy的成功负载。G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF的电势分别降至-9.7mV和-13.0mV，同时，水合粒径分别降至67.9nm和68.7nm，证明了G5.NHAc-PBA和G5.NHAc-Toy的表面成功包覆了TF的络合物，减弱了树状大分子的聚集状态，从而使其水合粒径减小。G5.NHAc-Toy@TF在各种溶液(水、PBS、DMEM培养基)中的水动力学直径在一周时间内几乎不变(如图2所示)，证明了G5.NHAc-Toy@TF具有良好的胶体稳定性。
表1
Sample ζ-potential(mV) Size(nm) PDI
G5.NH<sub>2</sub>-PBA 25.5±1.0 81.4±4.9 0.37±0.11
G5.NHAc-PBA 7.2±0.6 81.1±1.8 0.37±0.06
G5.NHAc-Toy -4.4±0.3 82.3±0.9 0.44±0.03
G5.NHAc-PBA@TF -9.7±0.5 67.9±2.4 0.40±0.07
G5.NHAc-Toy@TF -13±0.8 68.7±5.4 0.47±0.05
实施例3
取实施例1中制备的G5.NH2-PBA、G5.NHAc-PBA和G5.NHAc-Toy各6mg，分别溶解于600μL氘代水中，然后使用核磁共振波谱仪测定材料的核磁氢谱。G5.NH2-PBA的核磁结果如图3(a)所示，在化学位移2.25-3.4ppm处的质子峰代表G5的亚甲基质子峰，在化学位移7.5-7.8ppm处的质子峰代表了PBA分子结构中苯环上的质子峰，表明PBA已成功修饰在G5表面。通过对G5和PBA的质子峰区域进行积分，计算出每个G5表面修饰了17.5个PBA分子。G5.NHAc-PBA的核磁结果如图3(b)所示，乙酰化反应后，在1.87ppm的位置上出现了一个新的特征峰，这是乙酰基团中-CH3的质子峰。Toy和G5.NHAc-Toy的核磁结果如图3(c-d)所示，Toy在6.1ppm处有特征峰，而图3(d)中在相同位置出现了新的特征峰，证明了G5.NHAc-Toy的成功制备，通过计算得到，每个G5上连接的Toy数量为8.5个。
实施例4
取实施例1中制备的G5.NH2-PBA、G5.NHAc-PBA、G5.NHAc-Toy进行FTIR表征，如图4所示，曲线1代表G5.NH2-PBA，曲线2代表G5.NHAc-PBA，曲线3代表的是G5.NHAc-Toy。3条曲线中，1639cm-1和1556cm-1处的峰属于G5.NH2的氨基与PBA的羧基结合产生的酰胺键。在曲线3的2163cm-1处的峰属于Toy的-CN的伸缩振动吸收峰；表明Toy与G5.NHAc-PBA的成功结合。红外光谱图结果证明了Toy通过硼酸酯键与G5.NHAc-PBA的连接，形成G5.NHAc-Toy复合物。
实施例5
BCA蛋白定量试剂盒利用蛋白质分子的还原性将试剂盒中试剂B的Cu2+还原为Cu+，产生的Cu+可以与试剂盒中的试剂A(BCA)结合形成紫色的络合物，该络合物在540-595nm处具有紫外吸收，可以根据吸光度计算出蛋白浓度。由于TA同样具有还原性，因此可以利用BCA蛋白定量试剂盒测定实施例1中制备的G5.NHAc-Toy@TF中TA的含量(Taha et al.NanoLett.,2019,11(19),8333-8341)。将BCA试剂盒中的试剂A、试剂B以50：1的体积比混合制备BCA工作液。称取0.1mg的G5.NHAc-Toy@TF分散在HCl中(0.05M，200μL)，使单宁酸-铁配合物解离，释放TA。随后，将配置好的BCA工作液与上述溶液以8：1的体积比混合，37℃孵育30min，在570nm处测定溶液的吸光值，经计算得，G5.NHAc-Toy@TF中TA的质量分数为34.5％。
称取1mg的G5.NHAc-Toy@TF用1mL王水消化3h，通过ICP-OES测试法测定G5.NHAc-Toy@TF中Fe元素的含量。经计算得，Fe的质量分数为1.2％。
实施例6
取实施例1中制备的G5.NHAc-Toy@TF溶解于超纯水中，配制成浓度为1mg/mL的溶液，滴到有碳膜的铜网表面，置于室温下干燥，制得样品。然后采用JEM-2010F型透射电子显微镜在180kV下检测样品。G5.NHAc-Toy@TF的TEM图片和粒径分布直方图如图5(a-c)所示，G5.NHAc-Toy@TF呈球形，尺寸为50.2±2.1nm。
实施例7
为测试制备的G5.NHAc-Toy@TF的磁共振成像性能，配置不同Fe元素浓度的G5.NHAc-Toy@TF溶液(Fe元素浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mM)。通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Fe元素浓度下的T1弛豫时间，将弛豫时间的倒数与Fe浓度进行线性拟合，其斜率即为弛豫率r1。如图6所示，G5.NHAc-Toy@TF的r1为4.5650mM-1s-1，表明G5.NHAc-Toy@TF具有良好的T1 MR成像效果。
实施例8
分别配制pH＝7.4和pH＝5.5的含或不含10mM H2O2的缓冲溶液，分析G5.NHAc-Toy中Toy的响应性释放性能。将制备的G5.NHAc-Toy用1mL上述不同的缓冲溶液配置为3mg/mL的溶液并置入透析袋中(分子截留量为3500Da)。然后将装有样品的透析袋置于装有9mL不同缓冲液的容器中，于37℃的恒温摇床中振荡。在不同的时间点吸取透析袋外液1mL，再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液，并测量取出的液体在279nm处的吸光值。缓释结束后，绘制G5.NHAc-Toy在不同条件下的药物释放曲线。如图7(a)所示，G5.NHAc-Toy在pH＝7.4(无H2O2)的缓冲溶液中药物释放缓慢，释放率为9.9％。在pH＝5.5(无H2O2)的缓冲溶液中，G5.NHAc-Toy在48h内有接近30％的丰加霉素被释放，这是由于硼酸酯键在酸性条件下响应解离释放Toy。然而，在pH＝7.4且含有10mM H2O2的缓冲溶液中，Toy的释放率达到38％，并在pH＝5.5且含有10mM H2O2的缓冲溶液中实现了最高释放率56％，说明G5.NHAc-Toy中Toy的释放具有显著的H2O2响应性，这是由于H2O2使苯硼酸酯键断裂从而引起药物释放。这些数据证明G5.NHAc-Toy具有pH响应性和H2O2响应性，能够在肿瘤微环境中快速释放Toy，有效杀死肿瘤细胞。
实施例9
分别配制pH＝7.4和pH＝5.5的缓冲溶液，分析G5.NHAc-Toy@TF中Fe3+的响应性释放性能。将制备的G5.NHAc-Toy@TF用1mL不同的缓冲溶液溶解，配置为3mg/mL的溶液并置入透析袋中(分子截留量为3500Da)。然后将装有样品的透析袋置于装有9mL不同缓冲溶液的容器中，于37℃的恒温摇床中振荡。在不同的时间点吸取透析袋外液1mL，再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液，并通过ICP-OES测量取出的液体中Fe元素的含量。缓释结束后，绘制G5.NHAc-Toy@TF在不同条件下的Fe3+释放曲线。如图7(b)所示，在pH＝7.4的缓冲溶液中，G5.NHAc-Toy@TF中的Fe3+有少量的释放，48h释放率为8.4％；而在pH＝5.5的缓冲溶液中，G5.NHAc-Toy@TF在48h内有接近40％的Fe3+被释放，这说明了G5.NHAc-Toy@TF具有pH响应性，能够在肿瘤微环境中解离包覆的TF，快速释放Fe3+，进而释放Toy实现肿瘤的化疗与铁死亡。
实施例10
以4T1细胞为模型细胞来检测实施例1中制备的Toy、G5.NHAc-Toy、和G5.NHAc-Toy@TF的细胞毒性。收集对数生长期的4T1细胞，以1×104个细胞每孔的密度接种在3个96孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育12h。弃去原培养基，每个孔板分别加入含有不同浓度的Toy、G5.NHAc-Toy以及G5.NHAc-Toy@TF(Toy浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25μg/mL)的完全培养基。之后将孔板放置在5％CO2、37℃条件下孵育24h，弃去原培养基，加入含10％(v/v)CCK-8的DMEM培养基，继续培养2-4h。最后用多功能酶标仪于波长450nm处测试各孔的吸光值，以PBS处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。结果如图8所示，在实验浓度范围内，随着Toy浓度的增加，各组材料的细胞毒性均逐渐增强。这证明了Toy在肿瘤细胞内通过抑制内质网应激的IRE1α-XBP1信号通路，促使细胞发生内质网途径的细胞凋亡。而在相同Toy浓度下，G5.NHAc-Toy@TF组的细胞毒性比G5.NHAc-Toy组更高，这可能是由于包覆的单宁酸/铁配合物在肿瘤细胞中引起“芬顿反应”导致细胞发生铁死亡造成的。
实施例11
以4T1细胞为细胞模型来评价细胞对FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF的吞噬能力。按照1×105个细胞每孔的密度接种在12孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育12h。弃去原培养基，分别加入含有FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF(Fe的浓度为40μM)的培养基与细胞在5％CO2、37℃条件下共培养不同时间(1、3、6、12h)。之后将孔板中的细胞消化、离心并计数，分别加入1mL王水消化3h，终止消化后通过ICP-OES检测细胞内Fe元素的含量。结果如图9所示，随着时间的延长，各组细胞均显示逐渐升高的Fe元素含量。与PBS组相比，G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF处理的细胞内Fe元素含量明显增加，表明合成的纳米材料能够被细胞吞噬。
实施例12
以4T1细胞为细胞模型来评价不同材料对细胞内谷胱甘肽GSH水平的影响。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基，每个孔中分别加入含10％PBS的培养基或含有G5.NHAc-PBA(G5.NHAc-PBA浓度为3.8μM)；Toy、G5.NHAc-Toy(Toy浓度为30μM)；TA(浓度为30μM)；FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF、G5.NHAc-Toy@TF(Fe的浓度为30μM)的培养基与细胞在5％CO2、37℃条件下孵育6h。其中，各组材料的浓度与G5.NHAc-Toy@TF中Toy浓度为30μM时对应。之后，将所有孔板中的细胞消化、离心、收集，在液氮和37℃条件下反复冻融破碎，并使用GSH和GSSG检测试剂盒(碧云天，中国)检测细胞内GSH的含量。结果如图10所示，G5.NHAc-PBA、Toy和G5.NHAc-Toy均对细胞内GSH的水平无明显影响。FeCl3使细胞内GSH水平明显降低，这是由于Fe3+在细胞内可以通过“芬顿反应”产生活性氧ROS，从而消耗GSH，此外Fe3+与Fe2+之间的转化也会消耗GSH。与G5.NHAc-PBA和G5.NHAc-Toy相比，G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF均使细胞内的相对GSH浓度显著降低，说明制备的纳米材料可以通过铁离子引起的铁死亡过程而消耗细胞内GSH，影响细胞内氧化还原状态。
实施例13
以4T1细胞为细胞模型来评价不同材料对细胞内ROS水平的影响。将细胞以每皿2×105个细胞的密度接种到共聚焦细胞培养皿中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基，每个孔中分别加入含10％PBS的培养基或含有G5.NHAc-PBA(G5.NHAc-PBA浓度为3.8μM)；Toy、G5.NHAc-Toy(Toy浓度为30μM)；TA(浓度为30μM)；FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF、G5.NHAc-Toy@TF(Fe的浓度为30μM)的培养基与细胞在5％CO2、37℃条件下孵育6h。其中，各组材料的浓度与G5.NHAc-Toy@TF中Toy浓度为30μM时对应。弃去原培养基，与用无血清培养基稀释的DCFH-DA探针共孵育30min。弃去培养基，用PBS洗三次后，用2.5％的戊二醛溶液固定15min，再用PBS洗三次后，用DAPI染色10min，结束后用PBS洗三次，然后通过激光共聚焦显微镜观察实验结果。DCFH-DA探针在细胞内能够被ROS氧化成显示绿色荧光的DCF。结果如图11所示，G5.NHAc-PBA、Toy和G5.NHAc-Toy组细胞内ROS水平均无明显变化。FeCl3组细胞内荧光强度显著增强，而G5.NHAc-PBA@TF和G5.NHAc-Toy@TF组细胞显示出最强的绿色荧光，表明在纳米材料表面同时包覆TA和Fe会诱导细胞产生更多的ROS。
实施例14
以4T1细胞为细胞模型来评价不同材料对细胞内脂质过氧化物LPO水平的影响。将细胞以每皿2×105个细胞的密度接种到共聚焦细胞培养皿中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基，每个孔中分别加入含10％PBS的培养基或含有G5.NHAc-PBA(G5.NHAc-PBA浓度为3.8μM)；Toy、G5.NHAc-Toy(Toy浓度为30μM)；TA(浓度为30μM)；FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF、G5.NHAc-Toy@TF(Fe的浓度为30μM)的培养基与细胞在5％CO2、37℃条件下孵育6h。其中，各组材料的浓度与G5.NHAc-Toy@TF中Toy浓度为30μM时对应。弃去原培养基，与用无血清培养基稀释的C11-BODIPY 581/591探针共孵育20min。弃去培养基，用PBS洗三次后，用2.5％的戊二醛溶液固定15min，再用PBS洗三次后，用DAPI染色10min，结束后用PBS洗三次，然后通过激光共聚焦显微镜观察实验结果。结果如图12所示，探针显示红色荧光时，代表探针未被LPO氧化；探针显示绿色荧光时，代表探针被细胞内产生的LPO氧化。G5.NHAc-PBA、Toy和G5.NHAc-Toy组显示明显的红色荧光与极弱的绿色荧光，表明了细胞内LPO水平没有明显增强。而与FeCl3共孵育的细胞的红色荧光显著减弱，同时，绿色荧光显著增强，表明Fe3 +与H2O2反应后转变为Fe2+，而Fe2+可以与细胞膜脂质反应生成LPO。G5.NHAc-PBA@TF与G5.NHAc-Toy@TF组具有最强的绿色荧光，表明TA和Fe的协同作用诱导细胞内产生更多LPO，实现了增强的“芬顿反应”,可实现增强的肿瘤细胞铁死亡。
实施例15
以4T1细胞为细胞模型来评价不同材料对细胞内线粒体膜电位的影响。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基，每个孔中分别加入含10％PBS的培养基或含有G5.NHAc-PBA(G5.NHAc-PBA浓度为3.8μM)；Toy、G5.NHAc-Toy(Toy浓度为30μM)；TA(浓度为30μM)；FeCl3、G5.NHAc-PBA@TF、G5.NHAc-Toy@TF(Fe的浓度为30μM)的培养基与细胞在5％CO2、37℃条件下孵育12h。其中，各组材料的浓度与G5.NHAc-Toy@TF中Toy浓度为30μM时对应。弃去原培养基，用PBS清洗三次，与无血清培养基稀释的线粒体膜电位检测探针(JC-1)共孵育20min，弃去原培养基，用JC-1缓冲液清洗三次，然后将所有孔板中的细胞消化、离心、收集，重悬于PBS中，通过流式细胞仪检测细胞的红色/绿色荧光强度。荧光探针JC-1在线粒体膜电位较高时，聚集在线粒体的基质中，显示红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，显示绿色荧光。结果如图13-14所示，经G5.NHAc-PBA处理后的细胞中红/绿荧光比例与PBS组相似，表明G5.NHAc-PBA不会引起线粒体膜电位变化。而经Toy与G5.NHAc-Toy处理后的细胞中红/绿荧光比例有所下降，这可能是由于Toy影响了内质网应激的状态，进而对线粒体膜电位产生了影响。经TA与FeCl3处理后的细胞中，有更多的红色荧光向绿色荧光转变，表明TA与FeCl3可以通过产生ROS影响线粒体膜电位。而经G5.NHAc-PBA@TF与G5.NHAc-Toy@TF处理后的细胞中红/绿荧光比例最低，表明G5.NHAc-PBA@TF与G5.NHAc-Toy@TF可以显著降低线粒体膜电位，诱导线粒体功能障碍。
以上实验结果表明，制备的G5.NHAc-Toy@TF可以下调细胞内GSH水平，诱导细胞内ROS及LPO的产生，改变细胞内氧化还原平衡状态，并进一步引起线粒体功能障碍，从而导致细胞铁死亡，有效抑制癌细胞生长。
实施例16
以4T1细胞为细胞模型来评价不同材料对内质网应激相关蛋白表达水平的影响。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，置于5％CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基，每个皿中分别加入含10％PBS的培养基或含有Toy、G5.NHAc-Toy(Toy浓度为8μM)；G5.NHAc-PBA@TF、G5.NHAc-Toy@TF(Fe的浓度为8μM)的培养基与细胞在5％CO2、37℃条件下孵育24h。其中，各组材料的浓度为G5.NHAc-Toy@TF中Toy浓度为8μM时对应的浓度。然后将所有孔板的细胞消化、离心、收集，将细胞在冰上裂解，并于4℃，12000rpm离心5min，收集上清蛋白液，测定蛋白质浓度，随后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、ECL化学显影剂定影实验，并对细胞内的GRP78、p-IRE1α、XBP1、XBP1s和CHOP的含量进行研究(图15(a))。结果如图15(b-c)所示，内质网应激标志蛋白GRP78和p-IRE1α的表达经各组材料处理均有不同程度的上调，这是由于Toy可以抑制内质网恢复稳态，同时TA与Fe可以破坏细胞内氧化还原平衡，使细胞内发生氧化应激，从而加重了细胞的内质网应激水平。加重的细胞内质网应激会使XBP1u的转录增强，而Toy又抑制了p-IRE1α对XBP1u的剪接，从而导致XBP1u在细胞内含量上升，XBP1s的表达降低。如图15(d-e)所示，经G5.NHAc-Toy@TF处理后细胞内XBP1u的含量增加，XBP1s的表达显著降低。图15(f)表明，经各组材料处理后，内质网应激途径诱导凋亡的标志蛋白CHOP的表达均出现了不同程度的上升，这是由于内质网恢复稳态的信号通路被Toy抑制，以及TA和Fe导致的加重的内质网应激，使细胞经内质网途径凋亡。
实施例17
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4周雌性BALB/C裸鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。在裸鼠体内构建4T1皮下瘤模型，将2×106个4T1细胞接种到小鼠的右后腿，待肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为5组(每组6只)。具体分组如下：对照组(PBS，100μL)；G5.NHAc-PBA@TF(Fe＝0.4mg kg-1，100μL)；Toy(Toy＝2mg kg-1，100μL)；G5.NHAc-Toy(Toy＝2mg kg-1，100μL)；G5.NHAc-Toy@TF(Toy＝2mgkg-1，100μL)，注射方式为尾静脉注射。开始治疗的当天记为第1天，每周治疗两次，每2天记录一次老鼠体重和肿瘤尺寸。结果如图16(a)，G5.NHAc-PBA@TF组、Toy组、G5.NHAc-Toy组和G5.NHAc-Toy@TF组均表现出不同程度的抑制肿瘤效果。相对于PBS组，G5.NHAc-PBA@TF组的相对肿瘤体积明显减小，表明包覆的TA和Fe可以通过“芬顿反应”抑制肿瘤生长。G5.NHAc-Toy组的体内抗肿瘤效果高于Free Toy组，这可能是由于G5.NHAc-Toy具有EPR效应及延长的血液循环时间，证明G5.NHAc-PBA可以作为良好的药物载体，提高Toy的生物利用度。G5.NHAc-Toy@TF组经治疗后的肿瘤体积最小，这是由于化疗与铁死亡的协同作用使治疗效果最好。如图16(b)可以看出，各组裸鼠的体重有相似的变化趋势，均略有增加，表明材料的生物相容性良好。
对比例1
称取30mg G5.NHAc-PBA溶于8mL超纯水中，并称取17mg TA和1.62mg FeCl3分别溶解在1mL超纯水中配制成10mM的溶液。将配制好的FeCl3溶液和G5.NHAc-PBA溶液混合，涡旋混匀；然后加入TA溶液，涡旋混匀，并使用截留分子量为3500Da的透析袋于超纯水中透析3天，得到G5.NHAc-PBA@TF溶液。

Claims (6)

1.一种响应型树状大分子载药材料，其特征在于，所述材料为载药树状大分子表面包覆单宁酸/铁配合物；所述载药树状大分子为：药物通过硼酸酯键负载在树状大分子上；所述药物为丰加霉素Toy，树状大分子为第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2。
2.一种响应型树状大分子载药材料的制备方法，包括：
(1)将4-羧基苯硼酸PBA溶解在溶剂中，加入EDC和NHS活化，然后将活化后的PBA溶液加入到G5.NH2溶液中，搅拌反应、透析、冻干，得到G5.NH2-PBA；其中EDC、NHS、PBA与G5.NH2的摩尔比是90-110：90-110：18-22：0.9-1.1；活化反应时间为2-4h；PBA与G5.NH2的搅拌反应温度为室温，反应时间为23-25h；
(2)将G5.NH2-PBA溶解在水中，加入三乙胺搅拌，然后滴加乙酸酐，搅拌反应、透析、冻干，得到G5.NHAc-PBA；其中三乙胺、乙酸酐与G5.NH2-PBA的摩尔比为730-770：620-630：0.9-1.1；加入三乙胺搅拌时间为20-40min；滴加乙酸酐后反应时间为23-25h；
(3)将G5.NHAc-PBA溶液与丰加霉素Toy溶液混合，搅拌反应、透析、冻干，得到G5.NHAc-Toy；G5.NHAc-PBA与Toy的摩尔比为1：16-18；搅拌反应时间为46-50h；
(4)将FeCl3溶液和G5.NHAc-Toy溶液混匀，然后再加入单宁酸TA溶液，混匀，透析，得到响应型树状大分子载药材料G5.NHAc-Toy@TF；其中所述TA、FeCl3与G5.NHAc-Toy的摩尔比为9-11：9-11：0.9-1.1。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中G5.NHAc-PBA溶液、丰加霉素Toy溶液的溶剂均为水。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中FeCl3溶液、G5.NHAc-Toy溶液、单宁酸TA溶液的溶剂均为水。
6.一种权利要求1所述响应型树状大分子载药材料在制备肿瘤的化疗/铁死亡和MR成像药物中的应用。
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