CN111671897A - 一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α siRNA复合物的制备 - Google Patents

一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α siRNA复合物的制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF‑1αsiRNA复合物的制备方法。该制备方法包括：G5.NH2‑PS20溶液制备；{(Au0)25‑G5.NH2‑PS20}制备；{(Au0)25‑G5.NH2‑PS20}/si‑HIF‑1α制备。该方法制备的基因载体不仅安全性高、易合成、产率高，而且还具有良好的基因转染效率，并且可用于含血清环境的siRNA转染。

Description

一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α siRNA复合物的制备
技术领域
本发明属于纳米材料基因载体制备领域，特别涉及一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α siRNA复合物的制备方法。
背景技术
目前，癌症的常规治疗主要包括手术、化疗、放疗等，但这些治疗手段都存在其各自的局限性。例如，手术治疗存在切除残留、易复发等问题，且只能用于局部肿瘤治疗，不适用于癌症晚期患者；而化疗通常存在药物副作用大、肿瘤耐药性等问题；放射治疗在肿瘤治疗中的作用和地位日益突出，已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但是由于肿瘤的乏氧环境导致其对实体瘤的放疗敏感性较低，削减了放疗的治疗效果。因此，针对肿瘤放疗中存在的关键问题，改善肿瘤的乏氧环境提高放射敏感性成为肿瘤放射治疗的研究重点。
研究表明，90％的实体瘤都存在乏氧区，而支持肿瘤在乏氧条件下继续生长的关键因子就是乏氧诱导因子(HIFs)。一方面，HIFs的存在使得肿瘤细胞能够适应乏氧微环境，从而能在缺氧条件下继续增殖；另一方面，HIFs的表达(主要是HIF-1α)抑制活性氧(ROS)生成，从而使得肿瘤表现出放疗抗拒。于去年获得诺贝尔生理学或医学奖的三位科学家威廉·凯林(William G.Kaelin,Jr.)、彼得·拉特克利夫(Peter J.Ratcliffe)以及格雷格·塞门扎(Gregg L.Semenza)所提出的氧感知通路指出，通过下调HIF-1α的表达有望对抗恶性肿瘤。具体而言，就是用HIF-1α siRNA去沉默HIF-1α的表达，破坏肿瘤适应乏氧环境的关键枢纽，从而抑制肿瘤生长，增强放疗敏感性。而目前常见的基因转染载体普遍存在生物安全性、免疫原性或者转染效率等方面的问题。因此，寻找安全、高效的转染载体，保证HIF-1α siRNA的成功转染和表达是实现乏氧抑制和放疗增敏的关键。
聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子是一种高度支化、结构明确的新型超支化聚合物，具有独特的单分散性和丰富的表面氨基官能团，其作为基因载体具有基因压缩包覆能力强、免疫原性低、转染效率高等突出优势，有一种优良的基因传递载体。研究表明，利用树状大分子的内部空腔负载纳米金颗粒，可进一步提高基因负载能力，并显著提高其转染效率。
丙烷磺内酯(1,3-PS)是一种同时含有阴、阳离子基团的两性离子。作为一种新型的抗污修饰材料，1,3-PS表现出比传统抗污材料聚乙二醇更好的生物相容性和稳定性。此外，本课题组研究发现，修饰了两性离子的树状大分子因其较好的抗污性能，而具有更长的血液循环时间和更好的基因传递效率，可用于血清增强的基因传递载体(ActaBiomater.2019,99,320-329)，大大优于传统的非病毒载体。
检索国内外相关文献和专利结果表明，用包裹纳米金颗粒的树状大分子作为纳米平台，在其表面修饰两性离子丙烷磺内酯并负载HIF-1α siRNA，用于肿瘤增强放疗的研究，目前尚未有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α siRNA复合物的制备方法，以克服现有技术中基因转染载体转染效率不好等缺陷。
本发明提供一种聚酰胺-胺树状大分子复合物，所述复合物为1,3-PS修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹金纳米颗粒负载HIF-1α siRNA。
本发明还提供一种聚酰胺-胺树状大分子复合物的制备方法，包括：
(1)将G5.NH2水溶液与1,3-PS混合，搅拌，得到G5.NH2-PS20溶液，其中，G5.NH2与1,3-PS摩尔比为1:15～1:25；
(2)将HAuCl4溶液滴加到步骤(1)中G5.NH2-PS20溶液中，搅拌，加入NaBH4溶液，继续反应，透析、冷冻干燥，得到{(Au0)25-G5.NH2-PS20}，其中，G5.NH2与HAuCl4溶液中所含Au的摩尔比为1:20～1:30，NaBH4与HAuCl4的摩尔比为3:1～5:1；
(3)将步骤(2)中{(Au0)25-G5.NH2-PS20}溶于PBS缓冲溶液中，然后与HIF-1α siRNA溶液共孵育，得到{(Au0)25-G5.NH2-PS20}/si-HIF-1α，即聚酰胺-胺树状大分子复合物，其中，{(Au0)25-G5.NH2-PS20}与HIF-1α siRNA的N/P为0.25:1～60:1。
所述步骤(1)中搅拌温度为30±2℃，搅拌时间为1-2天。
所述步骤(2)中将HAuCl4溶液滴加到步骤(1)中G5.NH2-PS20溶液中是在冰浴条件下进行。
所述步骤(2)中NaBH4溶液为预冷的NaBH4溶液。
所述步骤(2)中搅拌时间为13-20min；继续反应时间为2-4h。
所述步骤(2)中透析为：采用截留分子量为500的透析袋，在2L蒸馏水中透析3天，每天换水3次。
所述步骤(3)中HIF-1α siRNA的序列为5’-ATGACATGAAAGCACAGAT-3’。
所述步骤(3)中HIF-1α siRNA溶液的溶剂为DEPC水。
所述步骤(3)中共孵育时间为15～30min。
所述步骤(3)中N/P为G5.NH2的伯氨基与HIF-1α siRNA骨架上磷酸基团摩尔比。
本发明还提供一种聚酰胺-胺树状大分子复合物用于基因转染的方法。包括：将聚酰胺-胺树状大分子复合物进行细胞转染。
所述转染的时间为3～5h。
本发明还提供一种聚酰胺-胺树状大分子复合物在制备基因治疗和放疗的联合治疗药物中的应用。
本发明还提供一种聚酰胺-胺树状大分子复合物在制备放疗增敏药物中的应用。
本发明以树状大分子作为纳米平台，表面修饰两性离子1,3-PS、内部包裹金纳米颗粒，形成具有抗非特异性蛋白吸附能力、高转染效率以及放疗增敏效果的纳米载体。本发明利用树状大分子表面丰富的氨基，首先将两性离子1,3-PS连接到G5.NH2的外围，进一步包裹纳米金颗粒。两性离子1,3-PS的修饰不仅可以降低G5.NH2的细胞毒性，而且能够很好的减少带正电的G5.NH2在血清中引起的蛋白吸附。包裹的纳米金颗粒不仅可以降低G5.NH2的细胞毒性、显著增强载体的转染效率，还可同负载的HIF-1α siRNA共同发挥放疗增敏作用。
本发明以功能化的树状大分子作为纳米载体，负载HIF-1α siRNA，以人非小细胞肺癌(A549)为研究对象，通过siRNA转染诱导肿瘤内HIF-1α沉默。通过核磁共振(1H-NMR)对修饰在树状大分子上的1,3-PS的数量进行了表征；紫外可见光谱(UV-vis)对Au的成功包裹进行了表征；通过抗非特异性蛋白吸附实验分析载体的抗污性能；通过透射电镜(TEM)分析材料的尺寸大小；通过凝胶阻滞实验和电势粒径检测对载体负载HIF-1α siRNA的能力进行了表征；通过CCK-8实验对载体及载体/si-HIF-1α复合物的细胞毒性进行表征；通过流式细胞仪对载体负载HIF-1α siRNA后的转染能力进行了定量分析；通过共聚焦显微镜对载体负载HIF-1α siRNA后的转染能力进行了定性分析；通过CCK-8及克隆形成试验检测载体及载体/si-HIF-1α复合物的细胞增殖情况从而分析放疗增敏效果；通过检测相对ROS生成量来分析载体及载体/si-HIF-1α复合物的放疗增敏效果。
有益效果
(1)本发明所制备的基因载体不仅安全性高、易合成、产率高，而且还具有良好的基因转染效率，并且可用于含血清环境的siRNA转染；
(2)本发明所制备的载体，其中的纳米金成分和HIF-1α siRNA介导的HIF-1α低表达均可实现放疗增敏，从而达到基因治疗和增强放疗的联合治疗效果，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明制备{(Au0)25-G5.NH2-PS20}及{(Au0)25-G5.NH2-PS20}/siRNA复合物的过程示意图；
图2为本发明制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}的1H NMR图谱；
图3为本发明制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}的UV-vis图谱；
图4为本发明制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}的TEM及粒径分布直方图；
图5为本发明制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}的抗蛋白吸附能力测试结果图(具体为BSA和{(Au0)25-G5.NH2-PS20}混合前及混合后的吸收值的差值与{(Au0)25-G5.NH2-PS20}材料的浓度之间的关系)；
图6为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物的凝胶阻滞实验，其中2～8分别代表N/P比值为0.5、1、2、3、4、5的载体/si-HIF-1α复合物，1代表裸si-HIF-1α；
图7为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物在不同N/P比值下的表面电势图(a)和水动力学粒径图(b)；
图8为本发明制备的载体、载体/si-HIF-1α复合物的细胞毒性测试结果图，其中对照组为PBS缓冲液处理的细胞；
图9为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物的细胞摄取能力测试结果图，其中对照组为PBS缓冲液和裸si-HIF-1α处理的细胞；
图10为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物的胞内定位实验图，其中对照组为PBS缓冲液和裸siRNA处理的细胞；
图11为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物的孵育细胞24小时后进行放疗处理(用RT表示)的CCK-8活力测试结果，其中对照组为PBS缓冲液处理的细胞；
图12为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物在放疗条件下的平板克隆形成试验结果图，其中(a)为平板克隆染色结果，(b)和(c)分别为对应的克隆数和存活分数直方图，对照组为非RT处理的细胞，空白对照组为PBS缓冲液处理的细胞；
图13为本发明制备的载体/si-HIF-1α复合物的ROS相对生成量检测结果图，其中对照组为非RT处理的细胞，空白对照组为PBS缓冲液处理的细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)50mg，溶于50mL超纯水中，随后加入3.51μL的1,3-PS，温度(30±2℃)搅拌1天得到G5.NH2-PS20粗产品。
在上述得到的G5.NH2-PS20中逐滴加入687μL HAuCl4(30mg/mL)，冰浴状态下搅拌反应15min后，加入过量预冷的NaBH4溶液(5.67mg，1mg/mL)继续反应3h，然后使用截留分子量为500的透析袋透析3天，透析液经冷冻干燥后得到载体{(Au0)25-G5.NH2-PS20}。
将上述得到的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}溶于PBS缓冲液，将HIF-1α siRNA溶于DEPC水，将二者孵育20min(其中HIF-1α siRNA的浓度为1μg/mL，N/P＝20)，即可得{(Au0)25-G5.NH2-PS20}/si-HIF-1α复合物。
实施例2
对实施例1所制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}进行表征。{(Au0)25-G5.NH2-PS20}的1HNMR表征结果如图2所示，在化学位移2.25-3.4ppm处的质子峰代表G5.NH2的亚甲基质子峰，在化学位移1.93ppm处的质子峰代表1,3-PS分子结构中位于2号碳原子上亚甲基的质子峰，表明1,3-PS已成功修饰在G5.NH2表面。通过对G5.NH2和1,3-PS的质子峰区域进行积分，计算出每个G5.NH2表面修饰了20.35个1,3-PS分子。通过紫外可见光谱(UV-vis)对{(Au0)25-G5.NH2-PS20}进行表征，如图3所示，在510nm出现的吸收峰是Au纳米颗粒的等离子体共振峰，这证明了Au纳米颗粒被成功包裹。通过透射电子显微镜(TEM)可观察Au纳米颗粒的形貌和尺寸大小，如图4所示，可看到纳米Au颗粒大小均一，平均直径在1.60nm左右。
实施例3
称取实施例1所制备的材料{(Au0)25-G5.NH2-PS20}溶解到超纯水中，配置母液浓度为4mg/mL的PBS溶液，然后分别稀释为2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.25mg/mL。称取牛血清白蛋白(BSA)配制成1mg/mL的PBS溶液。吸取BSA溶液加入到配制好的不同浓度的材料溶液，使其终浓度分别为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL和0.125mg/mL。充分混匀后，通过紫外分光光度计分别测试其在278nm处的紫外吸收值。而后，将混合溶液放置于37℃培养箱中2h，8000rpm离心5min后去除沉淀，测量其在278nm处的紫外吸收值。如图5所示，不同浓度由低至高紫外吸收差值分别为：0.0080、0.0245、0.0418、0.1765说明1,3-PS能赋予材料更好的抗蛋白吸附性能。
实施例4
将实施例1所制备的载体与HIF-1α siRNA以不同的N/P制备载体/si-HIF-1α复合物，并进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有4S Green plus(一种替代溴化乙锭的安全核酸染料)的1％的琼脂糖凝胶，随后称取实施例1制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}溶解于超纯水中，按照N/P比分别为0：1、0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、3：1、4：1和5：1，HIF-1α siRNA为1μg/孔来配制复合物，室温孵育20min。随后加入6×上样缓冲液，混合均匀后，向孔内依次加入不同N/P的含上样缓冲液的复合物溶液。于80V电压电泳30min，然后通过凝胶成像仪于312nm处拍照分析。结果如图6所示，实施例1所制备的载体在N/P＝2时可以与si-HIF-1α很好的复合，阻滞其迁移。压缩、负载siRNA的能力是将si-HIF-1α成功传递进靶细胞的前提。
实施例5
将实施例1所制备的{(Au0)25-G5.NH2-PS20}溶解于超纯水中，按照N/P分别为1：1、2：1、5：1、10：1与5μg si-HIF-1α制备成不同N/P的载体/si-HIF-1α复合物，室温下孵育20min，然后加入超纯水，使其终体积为1mL。最后通过马尔文激光粒度仪在633nm(Malvern，MK)激光波长处检测复合物的粒径和表面电势。结果如图7所示，在N/P＝1时载体/si-HIF-1α复合物的电势为负值，当N/P＝2时，电势为正值，随着N/P的增加，电势没有显著增加但均为正值。该结果也印证了凝胶阻滞实验的结果，即当N/P＝2时，HIF-1α siRNA可被载体完全包覆。而复合物的粒径大小在一定N/P范围内都在200nm左右，该尺寸有利于细胞的吞噬。
实施例6
以A549细胞为模型细胞来检测实施例1所制备的载体以及载体/si-HIF-1α复合物的细胞毒性。以10000/孔的密度将A549细胞种于96孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的F-12K完全培养基，在37℃、5％CO2浓度下过夜培养。然后将培养基换为载体浓度分别为0、500、1000、2000、3000nM的含载体或载体/1μg si-HIF-1α复合物的完全培养基，在37℃、5％CO2浓度下共培养24h后，倒掉培养基，加入含10％的CCK-8(10μL)的F-12K培养基，在培养箱继续培养3h。最后用酶标仪测试每孔的吸光度，波长为450nm，其中以PBS缓冲液处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。结果如图8所示，随着载体浓度的增加，单独的载体逐渐显示出细胞毒性，表现为细胞活力降低；而载体/si-HIF-1α复合物几乎没有细胞毒性，显示出复合物良好的生物相容性。
实施例7
以A549细胞为模型细胞，利用细胞吞噬实验来定量评价实施例1所制备的载体的转染效果。以1×105/孔的密度将A549细胞种于24孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的F-12K培养基，随后在37℃、5％CO2浓度下过夜培养直到细胞铺展程度达到60-70％。然后，按每孔1μg/mL HIF-1α siRNA、N/P值为5、10、20、40、60的比例制备载体/si-HIF-1α复合物，PBS组作为空白对照，孵育20min后加入细胞中，待转染细胞4h后，用胰酶消化并收集细胞，通过流式细胞仪检测释放的绿色荧光，以表征细胞对载体/si-HIF-1α复合物的细胞摄取情况。设定FSH-H/SSC-H为细胞门，FL1-H为荧光通道。如图9所示为流式细胞仪检测的细胞摄取结果(荧光强度越大说明进入细胞的能力越强)，结果表明：单独的si-HIF-1α和N/P＝5时的复合物几乎检测不到绿色荧光，表明他们均不能被细胞摄取，而随着N/P的增加，荧光强度呈现出先增强后减弱的趋势，并且当N/P＝20时，检测到最强的荧光强度，表明在该N/P下载体/si-HIF-1α复合物最易被细胞摄取，转染效率最高。
实施例8
以A549细胞为模型细胞，利用胞内定位实验定性评价实施例1所制备的载体的转染效果。以2x 105/孔的密度将A549细胞种于confocal皿，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的F-12K培养基，随后在37℃、5％CO2浓度下过夜培养直到细胞铺展程度达到60-70％。按每孔1μg/mL、N/P＝20制备载体/si-HIF-1α复合物，以PBS组，单独的HIF-1α siRNA为对照。孵育20min后，将上述三种材料加入皿中与细胞共培养，待转染细胞4h后，用激光共聚焦显微镜观察拍摄。胞内定位结果如图10所示，单独的si-HIF-1α几乎无法进入细胞，而载体/si-HIF-1α复合物可成功进入细胞，表明N/P＝20时，载体具有较高的转染效率。
实施例9
以A549细胞为模型细胞，利用CCK-8实验来评价实施例1所制备的载体以及载体/si-HIF-1α复合物的放疗增敏效果。以5000/孔的密度将A549细胞种于96孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的F-12K完全培养基，37℃、5％CO2浓度下过夜培养。然后按siRNA为1μg/孔、载体终浓度分别为0、1000、2000、3000nM的梯度浓度制备载体/si-HIF-1α复合物、载体/si-ctrl复合物(si-ctrl为si-HIF-1α的阴性对照siRNA)，在37℃、5％CO2浓度下共培养24h，随后对细胞进行0Gy和6Gy的放疗处理(用RT表示)，继续培养48h后，将培养基换为含10％的CCK-8(10μL)的F-12K培养基，在培养箱继续培养3h，最后用酶标仪测试每孔的吸光度，波长为450nm，其中以PBS缓冲液处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。结果如图11所示，相比于PBS+RT组，载体/si-ctrl复合物+RT组(3000nM)和载体/si-HIF-1α复合物+RT组均表现出较好的抑制癌细胞增殖的效果；而相比于载体/si-ctrl复合物+RT组，载体/si-HIF-1α复合物+RT组表现出更好的抑制癌细胞增殖的效果，这是因为载体自身所含的纳米金颗粒由于重金属效应和HIF-1αsiRNA均表现出放疗增敏的效果，从而增强了对癌细胞的抑制。
实施例10
以A549细胞为模型细胞，通过克隆形成试验来评价实施例所制备的载体以及载体/si-HIF-1α复合物的放疗增敏效果。以2000/孔的密度将A549细胞种于6孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的F-12K完全培养基，37℃、5％CO2浓度下过夜培养。按N/P＝20制备载体/si-ctrl复合物、载体/si-HIF-1α复合物，以PBS处理的细胞作为空白对照，孵育20min后与细胞共培养。24h后对细胞进行0Gy和6Gy的放射处理，之后继续培养10-12天，待出现肉眼可见的克隆时停止培养，用0.1％的结晶紫溶液染色后拍照和计数。如图12(a)-(c)，图(b)和图(c)分别为对应的克隆数和存活分数直方图，克隆数和存活分数越小说明放疗增敏的效果越好，同PBS+RT组性比，载体/si-ctrl复合物+RT组和载体/si-HIF-1α复合物+RT组均表现出较好的抑制癌细胞增殖的效果，而相比于载体/si-ctrl复合物+RT组，载体/si-HIF-1α复合物+RT组表现出更好的抑制癌细胞增殖的效果，同实施例9中CCK-8活力的结果一致，说明载体和载体/si-HIF-1α复合物均能实现放疗增敏，并且载体/si-HIF-1α复合物可实现增强的放疗增敏效果。
实施例11
以A549细胞为模型细胞，利用检测相对ROS生成量验证实施例1所制备的载体以及载体/si-HIF-1α复合物的放疗增敏作用。以2×105/孔的密度将A549细胞种于12孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的F-12K培养基，随后在37℃、5％CO2浓度下过夜培养直到细胞铺展程度达到60-70％。按N/P＝20制备载体/si-ctrl复合物、载体/si-HIF-1α复合物，以PBS处理的细胞作为空白对照，孵育20min后与细胞共培养。培养24h后对细胞进行6Gy的放射处理。然后，按照1：1000的稀释比例，用PBS缓冲液制备荧光探针(DCFH-DA)稀释液并刺激细胞1h，随后用胰酶消化并收集细胞。最后利用流式细胞仪检测释放的绿色荧光，通过FL1-H荧光通道进行检测。结果如图13所示，可以看出，与PBS+RT组相比，载体/si-ctrl复合物+RT组和载体/si-HIF-1α复合物+RT组的相对ROS生成量逐渐增多，并且载体/si-HIF-1α复合物的相对ROS生成量最多，说明载体(主要是载体中的纳米金成分)和HIF-1α siRNA均能实现放疗增敏，而载体/si-HIF-1α复合物+RT组表现出最佳的放疗增敏效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 东华大学
上海市第一人民医院
<120> 一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α
siRNA复合物的制备
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacatgaa agcacagat 19

Claims (10)

1.一种聚酰胺-胺树状大分子复合物，其特征在于，所述复合物为1,3-PS修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹金纳米颗粒负载HIF-1αsiRNA。
2.一种聚酰胺-胺树状大分子复合物的制备方法，包括：
(1)将G5.NH2水溶液与1,3-PS混合，搅拌，得到G5.NH2-PS20溶液，其中，G5.NH2与1,3-PS摩尔比为1:15～1:25；
(2)将HAuCl4溶液滴加到步骤(1)中G5.NH2-PS20溶液中，搅拌，加入NaBH4溶液，继续反应，透析、冷冻干燥，得到{(Au0)25-G5.NH2-PS20}，其中，G5.NH2与HAuCl4溶液中所含Au的摩尔比为1:20～1:30，NaBH4与HAuCl4的摩尔比为3:1～5:1；
(3)将步骤(2)中{(Au0)25-G5.NH2-PS20}溶于PBS缓冲溶液中，然后与HIF-1αsiRNA溶液共孵育，得到{(Au0)25-G5.NH2-PS20}/si-HIF-1α，即聚酰胺-胺树状大分子复合物，其中，{(Au0)25-G5.NH2-PS20}与HIF-1αsiRNA的N/P为0.25:1～60:1。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中搅拌温度为30±2℃，搅拌时间为1-2天。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中将HAuCl4溶液滴加到步骤(1)中G5.NH2-PS20溶液中是在冰浴条件下进行。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中搅拌时间为13-20min；继续反应时间为2-4h。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中透析为：采用截留分子量为500的透析袋，在2L蒸馏水中透析3天，每天换水3次。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中HIF-1αsiRNA的序列为5’-ATGACATGAAAGCACAGAT-3’；HIF-1αsiRNA溶液的溶剂为DEPC水。
8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中共孵育时间为15～30min。
9.一种如权利要求1所述复合物用于基因转染的方法。
10.一种如权利要求1所述复合物在制备基因治疗和放疗的联合治疗药物或放疗增敏药物中的应用。
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