CN114984248B - 一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子 - Google Patents

一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核‑壳树状大分子，所述包裹纳米金颗粒的核‑壳树状大分子材料为纳米载体，递送pDNA形式的CRISPR/Cas系统。本发明具有易制备、产率高、低毒安全、响应性释放等优点，而且有良好的基因转染效率，在实现肿瘤基因治疗、免疫治疗方面具有潜在的应用前景。

Description

一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应 核-壳树状大分子
技术领域
本发明属于功能性纳米材料领域，特别涉及一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子。
背景技术
新兴的CRISPR/Cas基因编辑技术可实现在分子水平上对基因进行操作，具有设计简单、易于操作、特异性好、效率高等优点，广泛应用于肿瘤发生、发展和转移的潜在机制以及临床治疗的研究。CRISPR/Cas系统已经越来越多地应用于肿瘤治疗研究，在基因水平的肿瘤治疗方面具有广阔的前景。尽管病毒载体广泛用于高效递送CRISPR/Cas系统，但是高浓度时具有潜在毒性等缺点限制了其应用，因此，利用纳米技术研发的非病毒纳米载体可以将CRISPR/Cas系统高效递送到体内，为CRISPR/Cas技术在临床领域的应用提供了新途径。
树状大分子(dendrimers)又可称为树状聚合物或树状高分子，由于聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)树状大分子具有高度可修饰性、结构可控、无免疫原性和良好的稳定性等特点，其作为载体材料越来越受到研究者们的关注，然而作为基因载体，其自身存在刚性不足的问题。
检索国内外相关文献和专利结果表明，利用苯硼酸酯键构建双响应的核-壳树状大分子包裹纳米金颗粒为载体递送CRISPR/Cas系统，应用于肿瘤的免疫治疗研究，目前尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子。
本发明的一种包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料，所述材料为乳糖酸修饰且内部包裹纳米金颗粒的第五代聚酰胺-胺树状大分子为核，四溴甲基苯硼酸修饰的第三代聚酰胺-胺树状大分子为壳的材料。
本发明的一种包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料的制备方法，包括：
(1)乳糖酸LA、EDC、NHS反应，得到活化的乳酸糖LA；将第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液PAMAM G5、活化的乳糖酸LA混合，室温搅拌反应，透析、冷冻干燥，得到第五代树状大分子-乳糖酸G5-LA；
(2)将G5-LA的水溶液中加入氯金酸水溶液，冰浴搅拌混合，加入硼氢化钠水溶液，冰浴搅拌反应，然后透析，冷冻干燥，得到干燥的包裹纳米金的第五代树状大分子-乳糖酸(Au0)25-G5-LA；
(3)将四溴甲基苯硼酸PBA溶液、第三代聚酰胺-胺树状大分子PAMAM G3溶液混合，水浴搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到第三代树状大分子-苯硼酸G3-PBA；
(4)将(Au0)25-G5-LA的水溶液、G3-PBA的水溶液混合，室温搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料(Au0)25-G5-LA/PBA-G3，记为AuCSTDs。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中G5与乳糖酸LA的摩尔比为1:10～1:30；所述室温搅拌反应时间为46-48h；所述活化的乳糖酸LA具体为：将乳糖酸LA的水溶液中加入EDC溶液，室温搅拌反应30-40min，再加入NHS溶液室温搅拌反应3-4h，得到活化的乳糖酸LA；其中乳糖酸LA与EDC、NHS的摩尔比为1:10-20：10-20。
所述步骤(1)中透析为：选取截留分子量为500Da的透析袋，透析溶液为超纯水，体积为2L，透析三天，每天换水3次。
所述步骤(2)中G5-LA的水溶液中加入氯金酸水溶液，冰浴搅拌混合15-30min，加入硼氢化钠水溶液，冰浴搅拌反应3-4h；所述G5-LA和氯金酸的摩尔比为1:25～1:50；氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1:3-4。
进一步优选地，所述G5-LA和氯金酸的摩尔比为1:25或1:50。
所述步骤(2)中透析为：选取截留分子量为1000Da的透析袋，透析溶液为超纯水，体积为2L，透析三天，每天换水3次。
所述步骤(3)中水浴65-75℃搅拌反应时间为22-24h；所述四溴甲基苯硼酸PBA溶液的溶剂为二氯亚砜DMSO；所述G3和PBA的摩尔比为1:24～1:36。
进一步优选地，所述G3和PBA的摩尔比为1:24或1:36。
所述步骤(3)中透析为：选取截留分子量为1000Da的透析袋，透析溶液为超纯水，体积为2L，透析三天，每天换水3次。
所述步骤(4)中室温搅拌反应22-24h；(Au0)25-G5-LA和G3-PBA的摩尔比为1:10～1:15。
进一步优选地，所述(Au0)25-G5-LA和G3-PBA的摩尔比为1:10。
所述步骤(4)中透析为：选取截留分子量为10000Da的透析袋，透析溶液为超纯水，体积为2L，透析三天，每天换水3次。
本发明的一种递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料，所述包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料为纳米载体，递送pDNA形式的CRISPR/Cas系统。
本发明的一种递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料的制备方法，包括：
将所述包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料溶解在水中，然后与含有CRISPR/Cas系统的PD-L1 pDNA溶液共孵育15-20min，得到递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料Au CSTDs/PD-L1 pDNA。
所述包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料与PD-L1 pDNA的N/P为0.125:1～30:1；所述水为DEPC水；
所述PD-L1 pDNA为PX330，其中Cas蛋白类型为spCas9，靶点序列的序列为TCCAAAGGACTTGTACGTGG；PD-L1 pDNA溶液的溶剂为DEPC水。
本发明的一种所述递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料在制备肿瘤的基因治疗或免疫治疗材料中的应用。
本发明在第五代树状大分子G5表面修饰乳糖酸并在其内部包裹金纳米颗粒作为核，在第三代树状大分子G3表面修饰苯硼酸作为壳，并利用苯硼酸酯键构建核-壳结构的树状大分子纳米平台，进而作为纳米载体用于递送pDNA形式的CRISPR/Cas系统。这一载体不仅可以通过最外层苯硼酸的靶向作用被肿瘤细胞主动摄取，同时苯硼酸酯键还具有pH响应和过氧化氢响应，进一步提高CRISPR/Cas系统的递送效率。
本发明以功能化的树状大分子作为纳米载体，负载含有CRISPR/Cas系统的PD-L1pDNA，以黑色素瘤(B16-F10)为研究对象，通过转染pDNA来切除肿瘤内的PD-L1基因，实现肿瘤的免疫治疗。通过核磁共振(1H NMR)对修饰在树状大分子上的LA和PBA的数量进行了表征；二维核磁(2D ROESY)和傅立叶变换红外吸收光谱(FT-IR)对通过苯硼酸酯键构建的核-壳结构树状大分子进行表征；使用透射电子显微镜(TEM)、紫外可见吸收光谱(UV-vis)、Zeta电势、水合粒径测试等方法表征材料的物理化学性质；通过凝胶阻滞实验和电势粒径检测对载体负载PD-L1 pDNA的能力进行了表征；然后通过CCK8法来评价该材料的细胞毒性；通过荧光显微镜及流式细胞仪对载体负载PD-L1 pDNA后的转染能力进行了定性及定量分析；通过共聚焦显微镜及流式细胞仪对载体负载PD-L1 pDNA后的细胞吞噬能力进行了定性及定量分析；最后通过Western Blot测试分析了载体/PD-L1 pDNA复合物对肿瘤细胞中PD-L1的切除效率。
本发明通过乳糖酸修饰且内部包裹纳米金颗粒的第五代聚酰胺-胺树状大分子作核，四溴甲基苯硼酸修饰的第三代聚酰胺-胺树状大分子作壳，利用苯硼酸酯键链接，构建pH和H2O2双响应的核-壳树状大分子。本发明制备的双响应的核-壳树状大分子作为递送CRISPR/Cas系统载体时，具有易制备、产率高、低毒安全、响应性释放等优点，而且有良好的基因转染效率，在实现肿瘤基因治疗、免疫治疗方面具有潜在的应用前景。
有益效果
(1)本发明制备方法具有条件温和、易于操作、转染效率高等优点，在肿瘤基因免疫治疗方面有良好的应用前景；
(2)本发明制备的核-壳结构树状大分子对高表达唾液酸的肿瘤细胞(如黑色素瘤)具有靶向性，这是由于材料表面的苯硼酸可以在肿瘤微环境中，稳定地结合具有邻二醇结构的唾液酸，从而实现肿瘤细胞的特异性识别，使材料可以有效的在肿瘤部位富集，可用于癌细胞的靶向治疗；
(3)本发明制备的核-壳结构树状大分子具有pH和过氧化氢双响应特性，在低pH值和高过氧化氢浓度的肿瘤细胞内部响应解离核-壳结构，能实现pDNA的快速智能释放，提高转染效率，并为进一步研究肿瘤微环境下的智能释放提供了新思路。
附图说明
图1为本发明的工艺流程示意图；
图2为本发明制备的(Au0)25-G5-LA(A)、G3-PBA(B)、Au CSTDs(C)的1H NMR图谱；
图3为本发明制备的Au CSTDs的2D ROESY图谱；
图4为本发明制备的Au CSTDs的紫外可见光谱(UV-vis)；
图5为本发明制备的Au CSTDs的高分辨TEM图和粒径分布直方图；
图6为本发明制备的(Au0)25-G5-LA(A)、G3-PBA(B)和Au CSTDs(D)的傅立叶变换红外吸收光谱(FT-IR)；
图7为本发明制备的Au CSTDs在不同pH条件下的荧光光谱图(A)、Au CSTDs加过氧化氢后不同时间下的荧光光谱图(B)；
图8为本发明制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物的凝胶阻滞试验电泳图(A)(其中泳道1为DNA marker，泳道2为裸PD-L1 pDNA，泳道3-8分别对应0.125、0.25、0.5、1、2、5：1的N/P比下的纳米复合物)和Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在不同pH及过氧化氢条件下的凝胶阻滞试验电泳图(B)(其中泳道1为DNA marker，泳道2为裸PD-L1 pDNA，泳道3-5为不同条件下的纳米复合物，泳道3：pH＝5.4且含有0.1mM H2O2的磷酸缓冲液，泳道4：pH＝6.4且含有0.1mM H2O2的磷酸缓冲液，泳道5:pH＝7.4且不含H2O2的磷酸缓冲液，N/P都为1)；
图9为本发明制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA在不同氮磷比下的表面电势图(A)和水动力学直径图(B)以及Au CSTDs/PD-L1 pDNA在不同pH及过氧化氢条件下的水动力学直径图(C)；
图10为本发明制备的Au CSTDs、Au CSTDs/PD-L1 pDNA和Au CSTDs/NC pDNA对L929细胞(A)和B16-F10细胞(B)的细胞活力测试(其中NC pDNA为无活性的阴性对照质粒，分子量与PD-L1 pDNA相同)；
图11为不同N/P比下Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在B16-F10细胞中的绿色荧光蛋白基因转染的荧光显微镜图；
图12为不同N/P比下流式细胞仪表征Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在B16-F10细胞中的绿色荧光蛋白基因转染效率的流式定量图；
图13为最佳N/P比下共聚焦显微镜表征B16-F10细胞对Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物吞噬能力的评价结果图(其中a为PBS组，b为裸PD-L1 pDNA组，c-f吞噬时间分别1、2、4、6个小时)；
图14为本发明制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物对B16-F10细胞中PD-L1蛋白的WesternBlot试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。第三代和第五代氨基端聚酰胺胺树状大分子购买于Dendritech(米德兰，美国)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二酰亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺，硼氢化钠和氯化金购买于sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里)。乳糖酸购买于北京百灵威科技有限公司(中国，上海)。4-溴甲基苯硼酸和二甲基亚砜(DMSO)购买于上海凌峰化学试剂有限公司。其他试剂和药品均购买于国药控股化学试剂有限公司(中国，上海)。再生纤维素透析膜(截留分子量为1000和10000)购买于上海源叶生物科技有限公司(中国，上海)。一级氨基氮测定试剂盒购买于Megazyme(布雷，爱尔兰)。B16-F10细胞(鼠类黑色素瘤细胞系)和L929细胞(小鼠上皮样成纤维细胞系)来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。DMEM培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium，GIBCO，Invitrogen，Carlsbad，CA)，胎牛血清(FBS，GIBCO)，青霉素-链霉素(HyClone，Thermo Scientific，Logan，UT)和胰蛋白酶0.25％溶液(HyClone)购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国，杭州)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)来自7SeaBiotech Co.,Ltd.(中国，上海)。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化系统(Cascada I，PALL，北京，中国)进行净化。
实施例1
(1)分别称取5.51mg LA、44.22mg EDC·HCl和26.55mg NHS溶于1mL的超纯水中，将EDC·HCl溶液逐滴加入到LA溶液中，室温搅拌30min后，逐滴加入NHS溶液，继续室温搅拌3-4h。称取20mg G5溶于1mL的超纯水中，逐滴加入到活化的LA溶液中，继续室温搅拌反应2天。待反应结束后，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G5-LA，储存于-20℃。
(2)称取20mg G5-LA溶于2mL的超纯水中，在冰浴条件下逐滴加入246.36μL的氯金酸水溶液(30mg/mL)，冰浴搅拌混合15-30min。称取2.03mg硼氢化钠溶于1mL的超纯水中，预冷后迅速倒入到上述混合溶液中，继续冰浴搅拌反应3-4h。待反应结束后，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的(Au0)25-G5-LA，储存于-20℃。
(3)分别称取40mg G3和29.85mg PBA溶于1mL的DMSO溶液中，将PBA溶液逐滴加入到G3溶液中，水浴70℃搅拌反应1天。待反应结束后，将得到的产物转移至截留分子量为1000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G3-PBA，储存于-20℃。
(4)按摩尔比为1：10的比例，分别称取步骤(2)和步骤(3)得到的产物溶于2mL的超纯水中，将(Au0)25-G5-LA溶液逐滴加入到G3-PBA溶液中，室温搅拌反应1天。待反应结束后，将得到的产物转移至截留分子量为10000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的(Au0)25-G5-LA/PBA-G3(即Au CSTDs)，储存于-20℃。
(5)将步骤(4)得到的Au CSTDs用DEPC水配置成2mg/mL，按照不同的N/P比(0.125、0.25、0.5、1、2、5)与1μgPD-L1 pDNA混合，放入37℃培养箱孵育15-20min，得到Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物。
(6)将步骤(4)得到的Au CSTDs用DEPC水配置成2mg/mL，按照N/P＝15与PD-L1pDNA混合，37℃培养箱孵育15-20min，得到Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物。
实施例2
对实施例1中制备的(Au0)25-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs进行核磁表征，1H NMR表征结果如说明书附图2-A所示：在化学位移2.2-3.4ppm的特征吸收峰是G5结构中的亚甲基质子峰，在化学位移3.5-4.5ppm处的特征吸收峰是LA结构中的亚甲基质子峰，表明LA已成功修饰在G5分子表面。通过对吸收峰面积进行积分，计算得到一个G5分子表面连接了8.41个LA分子。说明书附图2-B所示，在化学位移2.2-3.4ppm的特征吸收峰是G3结构中的亚甲基质子峰，在化学位移7.0-7.7ppm处的两个特征吸收峰是PBA中苯环结构上的质子峰，表明PBA已成功修饰在G3分子表面，通过面积积分可知一个G3表面修饰了10.33个PBA。如说明书附图2-C：通过对LA和PBA的特征峰进行积分，一个(Au0)25-G5-LA表面连接了6.91个G3-PBA分子。
对实施例1中制备的Au CSTDs进行2D NOESY表征，结果如说明书附图3所示：化学位移3.5-4.5ppm处LA的基团与化学位移7.0-7.7ppm处PBA的基团出现了明显的相关交叉信号(灰色区域)，由此可以说明LA分子与PBA分子发生了相互作用，紧密结合。同时证明了主体分子(Au0)25-G5-LA与客体分子G3-PBA通过苯硼酸酯键作用成功构建了核-壳结构树状大分子Au CSTDs。
实施例3
对实施例1中制备的G5-LA、(Au0)25-G5-LA和Au CSTDs进行紫外可见吸收光谱测试，即将实施例1中制备的G5-LA、(Au0)25-G5-LA和Au CSTDs配置成浓度为0.1mg/mL的溶液，用紫外分光光度仪测量材料在波长300-800纳米的紫外吸收。结果如说明书附图4所示，(Au0)25-G5-LA和Au CSTDs溶液在500-550nm波长范围内均显示出明显的特征吸收峰，特别是在520nm左右处显示了金纳米颗粒的表面等离子体共振吸收峰，G5-LA则没有特征吸收峰出现，证明所合成的(Au0)25-G5-LA和Au CSTDs均成功包裹了金纳米颗粒。
对实施例1中制备的Au CSTDs进行TEM测试，即将实施例1中制备的Au CSTDs配置成浓度为0.5mg/mL的溶液，取5μL滴在透射电镜超薄铜网上，用日本JEOL电子显微镜进行形貌观察。结果如说明书附图5所示，Au CSTDs的金核粒径为1.93nm。
实施例4
对实施例1中制备的(Au0)25-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs进行FT-IR分析，即分别称取实施例1中制备的(Au0)25-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs固体各0.1mg，用傅里叶变换红外光谱仪测试材料所含基团。结果如说明书附图6所示，在1080cm-1处的特征峰为来自(Au0)25-G5-LA中乳糖酸的糖环骨架振动吸收峰，证明乳糖酸成功修饰到G5表面；在1540cm-1处的特征峰为来自G3-PBA中苯硼酸的苯环C＝C振动吸收峰，证明苯硼酸成功修饰到G3表面；同时在核-壳结构树状大分子Au CSTDs中可以观察到1080cm-1与1540cm-1处有吸收峰，这证明了(Au0)25-G5-LA和G3-PBA成功键合，Au CSTDs成功制备。
实施例5
对实施例1中制备的Au CSTDs进行荧光光谱分析，即称取四份实施例1中制备的AuCSTDs固体1mg，分别溶于pH＝7.4、pH＝6.4、pH＝5.4的磷酸缓冲液以及0.1mM H2O2溶液(pH＝7.4)中，配置成浓度为1mg/mL的溶液，用荧光光谱仪测试溶液的激发光谱(发射波长为388nm)。结果如说明书附图7-A所示，随着pH值的降低，最大吸收波长302nm处的荧光强度升高，证明(Au0)25-G5-LA/PBA-G3核-壳结构树状大分子在弱酸及酸性环境中由于苯硼酸酯键的断裂而解离。参见说明书附图7-B所示，随着时间的降低，最大吸收波长302nm处的荧光强度降低，证明(Au0)25-G5-LA/PBA-G3核-壳结构树状大分子中在H2O2的存在下由于PBA与H2O2的反应而解离。
实施例6
对实施案例1步骤(5)中制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。将Au CSTDs溶液按照不同N/P比0.125、0.25、0.5、1、2、5与PD-L1 pDNA(1μg/孔)混合，孵育20min，配制成Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物，并以DNA marker和裸PD-L1 pDNA为对照。然后将对应的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物染料混合后分别加到琼脂糖凝胶的孔中，用凝胶成像仪对PD-L1 pDNA在凝胶中的迁移进行分析(电压80V，时间40min)。参见说明书附图8-A所示，在N/P比大于等于1时，Au CSTDs能够完全的将PD-L1 pDNA压缩，阻止PD-L1 pDNA电迁移。
对实施案例1步骤(5)中制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物进行不同条件下的凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。将Au CSTDs溶液(N/P＝1)与PD-L1 pDNA(1μg/孔)混合，孵育20min，配制成AuCSTDs/PD-L1 pDNA复合物，随后取三个溶液分别加入0.1mM H2O2(pH＝5.4)、0.1mM H2O2(pH＝6.4)和磷酸缓冲液(pH＝7.4)，让复合物处于不同的条件。然后将对应的Au CSTDs/PD-L1pDNA复合物与染料混合后分别加到琼脂糖凝胶的孔中，并以DNA marker和裸PD-L1 pDNA作对照，用凝胶成像仪对PD-L1 pDNA在凝胶中的迁移进行分析(电压80V，时间40min)。参见说明书附图8-B所示，在N/P比等于1时，PD-L1 pDNA在磷酸缓冲液(pH＝7.4)中能够完全被压缩，PD-L1 pDNA在0.1mM H2O2(pH＝6.4)在大部分被压缩，PD-L1 pDNA在0.1mM H2O2(pH＝5.4)只有小部分被压缩，因此，Au CSTDs在弱酸及酸性环境下和H2O2的存在下，Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在N/P＝1时可解离，Au CSTDs可响应性释放PD-L1 pDNA。
实施例7
对实施案例1步骤(5)中制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物进行水动力学直径和表面电势表征，即将实施例1中制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物用超纯水进行稀释至终体积为1mL，用马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)进行表征。参见说明书附图9-A和附图9-B所示，在不同的N/P比条件下，复合物的水动力学粒径都大致在100～200nm之间，且复合物的表面电势都在22～28mV之间，粒径和电势总体上呈现稳定状态且都处于合适的基因传递范围内，适合被细胞吸附和内吞，有利于细胞内基因的传递。
对实施案例1步骤(5)中制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物进行不同条件下的水动力学直径表征，即将实施例1中制备的Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物分别用0.1mM H2O2(pH＝5.4)、0.1mM H2O2(pH＝6.4)和磷酸缓冲液(pH＝7.4)进行稀释至终体积为1mL，通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光)进行表征。参见说明书附图9-C所示，在不同的N/P比条件下，复合物在pH＝7.4和0.1mM H2O2(pH＝6.4)环境中的水动力学粒径都大致在100-200nm之间，粒径和总体上呈现稳定状态，因此，在中性和含有H2O2的弱酸性环境下，AuCSTDs/PD-L1 pDNA复合物在N/P大于等于5时处于稳定状态，Au CSTDs没有解离释放pDNA；而复合物在0.1mM H2O2(pH＝5.4)环境中的水动力学粒径在200-600nm之间不等，因此，在含有H2O2的酸性环境下，Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在N/P为5-20时可解离，Au CSTDs可响应性释放PD-L1 pDNA。
实施例8
以L929细胞和B16-F10细胞作为模型细胞，通过CCK8法来检验Au CSTDs、AuCSTDs/PD-L1 pDNA和Au CSTDs/NC pDNA复合物在不同浓度下的细胞毒性。分别将L929细胞和B16-F10细胞以8×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中，在添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中培养，并将孔板置于5％CO2，37℃的培养箱中孵育过夜。然后将培养液换成含Au CSTDs、Au CSTDs/PD-L1 pDNA和Au CSTDs/NC pDNA的培养液(每孔100μL)，Au CSTDs浓度分别为0、50、100、500、1000、1500和2000nM，PD-L1 pDNA添加量均为1μg/孔，继续培养细胞24h。随后弃掉培养液，每孔加入100μL含有10％CCK-8的无血清培养液，孵育4h后，用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长为450nm。参见说明书附图10所示，Au CSTDs和Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在试验浓度范围内对L929细胞和B16-F10细胞都有毒性，但对L929细胞的毒性小于B16-F10细胞，且随着材料浓度的增加，细胞活力逐渐降低；对于Au CSTDs来说，即使在浓度高达2000nM的情况下，L929细胞和B16-F10细胞的活力仍有70％以上；对于Au CSTDs/NC pDNA来说，细胞存活率较Au CSTDs相比在一定程度上有所上升，因为NCpDNA带负电，降低了Au CSTDs的电势，因此即使在浓度高达2000nM的情况下，L929细胞和B16-F10细胞的活力仍有80％以上；对于Au CSTDs/PD-L1 pDNA来说，细胞存活率相比较Au CSTDs和Au CSTDs/NC pDNA在一定程度上有所下降，因此PD-L1 pDNA在发挥作用时对细胞有更大的毒性，但浓度在1000nM时L929细胞的活力仍有70％以上，B16-F10细胞的活力依然有60％以上。
实施例9
以B16-F10细胞作为模型细胞，选用带有EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因序列的PD-L1pDNA，通过倒置荧光显微镜定性检测不同N/P比条件下Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在细胞中的递送pDNA形式CRISPR/Cas系统的效率。将B16-F10细胞以1×105个/孔的细胞密度接种于12孔板中，在添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中培养，并将孔板置于5％CO2，37℃的培养箱中孵育24h。然后将培养液换成含Au CSTDs/PD-L1 pDNA的培养液(每孔500μL)，复合物的N/P比为0、5、10、15和20，PD-L1pDNA添加量均为1μg/孔，孵育4h。随后弃掉培养液，孔加入1mL鲜培养液，在培养箱中培养24h。最后弃掉培养液，用PBS缓冲溶液清洗细胞，每孔添加300μLPBS以维持细胞形态，用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达情况。参见说明书附图11所示，对照组和单独的PD-L1 pDNA组都未见明显绿色荧光，对于材料组，荧光强度随着N/P比的增加先增强后减弱，在N/P比为15时荧光强度最高，因此，在实验设计的N/P比条件下，Au CSTDs显示出了良好的递送pDNA形式CRISPR/Cas系统的效率，且在N/P比为15时递送效率最高。
实施例10
以B16-F10细胞作为模型细胞，选用带有EGFP基因序列的PD-L1 pDNA，通过流式细胞术定量检测不同N/P比条件下Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物在细胞中的递送pDNA形式CRISPR/Cas系统的效率。采用实施例9中相同的方法，加入不同N/P比的Au CSTDs/PD-L1pDNA的培养液培养细胞24h后，用PBS缓冲溶液清洗细胞，每孔添加200μL的胰酶消化细胞2min，将培养液转移到离心管中用离心机以1000rpm的速度离心5min，弃掉上层清液，用1mLPBS将细胞沉淀重新分散，获得细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞释放的绿色荧光强度。参见说明书附图12所示，对照组和单独的PD-L1 pDNA组绿色荧光强度很低，对于材料组，荧光强度随着N/P比的增加先增强后减弱，在N/P比为15时荧光强度最高，因此，在实验设计的N/P比条件下，Au CSTDs显示出了良好的递送pDNA形式CRISPR/Cas系统的效率，且在N/P比为15时递送效率最高，此结果与荧光显微镜检测结果保持一致。
实施例11
以B16-F10细胞作为模型细胞，选用带有Cy3(红色荧光)标记的PD-L1 pDNA，通过激光共聚焦显微镜定性检测不同时间下细胞对Au CSTDs/PD-L1 pDNA复合物的吞噬效率。将B16-F10细胞以2×105个/孔的细胞密度接种于confocal皿中，在添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的1mLDMEM培养液中培养，并将孔板置于5％CO2，37℃的培养箱中孵育过夜。然后将培养液换成含Au CSTDs/PD-L1 pDNA的培养液(每孔500μL)，复合物的N/P比为15，PD-L1 pDNA添加量均为1μg/孔，孵育4h。最后弃掉培养液，用PBS缓冲溶液清洗细胞，每孔添加300μLPBS以维持细胞形态，用激光共聚焦显微镜观察细胞的吞噬情况。参见说明书附图13所示，对照组和单独的PD-L1 pDNA组均未见明显红色荧光，对于材料组，荧光强度随着吞噬时间的增加而增强，因此，在实验设计的N/P比条件下，B16-F10细胞可吞噬AuCSTDs/PD-L1 pDNA复合物，且时间越长吞噬效率越高。
实施例12
以B16-F10细胞作为模型细胞，通过Western Blot来检测细胞内PD-L1蛋白的表达情况。将B16-F10细胞以2×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中，在添加100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的2mL DMEM培养液中培养，并将孔板置于5％CO2，37℃的培养箱中孵育24h。然后将培养液换成含PBS缓冲液、裸PD-L1 pDNA、Au CSTDs/PD-L1 pDNA和AuCSTDs/NC pDNA的培养液，其中复合物的N/P比均为15，pDNA添加量均为1μg/孔，每孔添加1mL培养液，孵育4h。随后弃掉培养液，孔加入1mL鲜培养液，在培养箱中培养24h。参见说明书附图14所示，以PBS为空白对照组，β-actin作为内参蛋白，裸PD-L1pDNA与Au CSTDs/NCpDNA为阴性对照组，在空白对照组和阴性对照组中PD-L1蛋白的表达都很正常，实验组PD-L1蛋白的表达下调，蛋白下调效率为30％。

Claims (10)

1.一种包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料的制备方法，包括：
（1）乳糖酸LA、EDC、NHS反应，得到活化的乳酸糖LA；将第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液PAMAM G5、活化的乳糖酸LA混合，室温搅拌反应，透析、冷冻干燥，得到第五代树状大分子-乳糖酸G5-LA；
（2）将G5-LA的水溶液中加入氯金酸水溶液，冰浴搅拌混合，加入硼氢化钠水溶液，冰浴搅拌反应，然后透析，冷冻干燥，得到干燥的包裹纳米金的第五代树状大分子-乳糖酸(Au0)25-G5-LA；
（3）将四溴甲基苯硼酸PBA溶液、第三代聚酰胺-胺树状大分子PAMAM G3溶液混合，水浴搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到第三代树状大分子-苯硼酸G3-PBA；
（4）将(Au0)25-G5-LA的水溶液、G3-PBA的水溶液混合，室温搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料Au CSTDs。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中PAMAM G5与乳糖酸LA的摩尔比为1:10~1:30；所述室温搅拌反应时间为46-48 h；
所述活化的乳糖酸LA具体为：将乳糖酸LA的水溶液中加入EDC溶液，室温搅拌反应30-40 min，再加入NHS溶液室温搅拌反应3-4 h，得到活化的乳糖酸LA；其中乳糖酸LA与EDC、NHS的摩尔比为1: 10-20：10-20。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中G5-LA的水溶液中加入氯金酸水溶液，冰浴搅拌混合15-30 min，加入硼氢化钠水溶液，冰浴搅拌反应3-4 h；所述G5-LA和氯金酸的摩尔比为1:25~1:50；氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1:3-4。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中水浴65-75 ℃搅拌反应时间为22-24 h；所述四溴甲基苯硼酸PBA溶液的溶剂为二氯亚砜DMSO；所述PAMAMG3和PBA的摩尔比为1:24~1:36。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中室温搅拌反应22-24 h；(Au0)25-G5-LA和G3-PBA的摩尔比为1:10~1:15。
6.一种权利要求1所述方法制备的包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料，其特征在于，所述材料为乳糖酸修饰且内部包裹纳米金颗粒的第五代聚酰胺-胺树状大分子为核，四溴甲基苯硼酸修饰的第三代聚酰胺-胺树状大分子为壳的材料。
7.一种递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料的制备方法，包括：将权利要求6所述包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料溶解在水中，然后与含有CRISPR/Cas系统的PD-L1 pDNA溶液共孵育15-20 min，得到递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料Au CSTDs/PD-L1 pDNA。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述包裹纳米金颗粒的核-壳树状大分子材料与PD-L1 pDNA的N/P为10:1～20:1；所述水为DEPC水；PD-L1 pDNA溶液的溶剂为DEPC水。
9.一种权利要求7所述方法制备的递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料。
10.一种权利要求9所述递送CRISPR/Cas系统的包裹纳米金颗粒的双响应核-壳树状大分子材料在制备肿瘤的基因治疗或免疫治疗材料中的应用。
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