CN103212091A - 一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法 - Google Patents

一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，包括：以荧光素修饰氨基末端的第五代聚酰胺-胺树状大分子；随后通过聚乙二醇将乳糖酸连接至树状大分子；以修饰后的树状大分子为模板，通过硼氢化钠还原制备金纳米颗粒；对树状大分子表面剩余的氨基进行全部乙酰化处理；将反应后的溶液进行透析，冷冻干燥处理得到终产品；对产品进行体外、体内CT造影性能进行评价。本发明方法简单易行，制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒具有良好的稳定性、水溶液分散性和生物相容性，显示良好的体外肝癌细胞靶向效果，具有特异性的靶向肿瘤CT造影效果，具有潜在的靶向CT造影应用前景。

Description

一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法
技术领域
本发明属于造影剂的制备领域，特别涉及一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法。 
背景技术
癌症（医学术语亦称恶性肿瘤）因其高致死率和难治愈性，现已成为影响人类健康的头号杀手。这主要是因为癌细胞具有局部浸润性和远处转移特性，早期难以诊断和发现，而晚期往往难以治疗和控制。目前，已有多国的研究者致力于癌症的早期诊断和治疗研究。 
CT技术因其优良的空间和密度分辨率而成为最为广泛的分子影像学手段之一，在临床上得到广泛的使用。现阶段，将CT技术用于癌症的诊断受到很大的限制。目前临床用CT造影剂主要为基于碘的小分子造影剂。这种造影剂存在体内循环时间短、不具备靶向性、及高浓度时的肾脏毒性等缺点，极大的限制了CT技术在癌症诊断领域的应用。因此，开发新型的造影剂体系非常必要。至今，新型造影剂的开发更多关注的是无机纳米颗粒。 
纳米材料的出现，特别是具有靶向功能的无机纳米材料的发展，使得肿瘤部位的早期检测和诊断成为可能。由于肿瘤细胞具有不同于正常细胞的特性，其吞噬能力大为提高，表现出增强的渗透和停留效应（EPR效应）。同时，其细胞表面具有不同于正常细胞的受体，使得特异性靶向结合具有可能性。 
金纳米颗粒因其较高的X-射线吸收系数、良好的生物相容性，以及表面易修饰性等独特的性质和明显的优势正得到越来越广泛的关注。同时，纳米颗粒本身显示出的延长的体内循环时间进一步使肿瘤靶向造影成为可能。目前，关于具有靶向性能的CT造影剂的研究鲜有报道。Wang等[Wang,H.,et al.,Folic acid-modified dendrimer-entrapped gold nanoparticles as nanoprobes for targeted CT imaging of human lung adencarcinoma.Biomaterials2013,34,470-480]以叶酸修饰的第五代聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米颗粒为纳米探针用于人肺腺癌小鼠肿瘤模型的靶向CT造影剂。此外，研究表明，肝癌细胞表面有大量的人去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）。选择与其相匹配的配体（如乳糖酸），修饰纳米颗粒，有望实现对肝癌细胞的靶向诊断。Guo等[Guo,R.,et al.,Synthesis of glycoconjugated poly(amindoamine)dendrimers for targeting human liver cancer cells.RSC Advances,2012.2(1):p.99-102.]以第五代聚酰胺-胺树状大分子为载体，表面修饰肝癌靶向配体乳糖酸，制备得到的材料表现出良好的体外肝癌细胞靶向性能。 
树状大分子是一类商业化的、结构可精确控制的有机大分子，是一类比较常见的金属 纳米颗粒的模板和稳定剂。本专利采用乳糖酸修饰的末端为氨基的第五代聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子为模板，制备金纳米颗粒，研究该复合纳米颗粒的肝癌靶向CT造影效果。 
检索国内外有关金纳米颗粒用于CT造影方面的文献和专利结果发现：在本发明完成之前，还没有发现基于乳糖酸修饰第五代聚酰胺-胺树状大分子包裹的纳米金颗粒的肝癌靶向CT造影剂的制备及其CT造影性能研究方面的报道。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，该方法制备过程温和，简单易行，制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒具有良好的稳定性、生物相容性、体外肝癌细胞靶向性能，以及特异的肝癌肿瘤模型CT造影效果，具有潜在的靶向CT诊断应用前景。 
本发明的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，包括： 
（1）将末端为氨基的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2加入溶剂中，得到溶液，然后加入异硫氰酸荧光素FITC，搅拌反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到荧光素修饰的树状大分子G5.NH2-FI；其中树状大分子和FITC的摩尔比为1:5； 
（2）将乳糖酸LA-COOH加入溶剂中，得溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌反应1-3h，然后加入聚乙二醇溶液中，搅拌反应2-3d，透析，冷冻干燥处理，得到聚乙二醇-乳糖酸LA-PEG-COOH；其中乳糖酸LA-COOH、EDC、NHS的摩尔比为1：1：1；乳糖酸和聚乙二醇的摩尔比为1.5:1； 
（3）将上述LA-PEG-COOH配制成水溶液后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌反应1-3h，然后加入G5.NH2-FI的水溶液中，搅拌反应1-3d，透析，冷冻干燥，得到乳糖酸修饰的树状大分子G5.NH2-FI-PEG-LA；其中G5.NH2-FI和LA-PEG-COOH摩尔投料比为1:15-20；LA-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:5-6:5-6； 
（4）将上述G5.NH2-FI-PEG-LA配制成水溶液，加入氯金酸水溶液，搅拌10-30min，加入硼氢化钠溶液，搅拌1-2h，加入三乙胺，搅拌10-30min，加入乙酸酐，搅拌反应24-36h，透析，冷冻干燥，即得乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒AuDENPs-LA，其中氯金酸和G5.NH2-FI-PEG-LA的摩尔比为150:1；硼氢化钠和氯金酸的摩尔比为3:1；三乙胺为树状大分子末端氨基摩尔数6-12倍；乙酸酐为树状大 分子末端氨基摩尔数5-10倍。 
所述步骤（1）中第五代聚酰胺-胺树状大分子的浓度为5-15mg/mL。 
所述步骤（1）中溶剂为二甲基亚砜DMSO。 
所述步骤（2）中聚乙二醇两末端分别为氨基和羧基，Mw=2000。 
所述步骤（2）中溶剂为pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，乳糖酸LA-COOH溶液的浓度为5-10mg/mL。 
所述步骤（2）中聚乙二醇溶液的溶剂为pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，聚乙二醇溶液的浓度为15-25mg/mL。 
所述步骤（3）中LA-PEG-COOH水溶液的浓度为10-20mg/mL，G5.NH2-FI水溶液的浓度为10-15mg/mL。 
所述步骤（4）中G5.NH2-FI-PEG-LA水溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，氯金酸水溶液的浓度为30mg/mL。 
所述步骤（4）中透析为分别对PBS缓冲液和水透析。 
所述步骤（4）所得的Au DENPs-LA为靶向造影剂，应用于裸鼠肝癌肿瘤模型靶向CT造影。 
配制活性元素（金、碘）摩尔浓度为0.1mol/L的样品，以碘海醇作为对照，以乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒为靶向CT造影剂进行体外X-射线衰减性能测试和裸鼠肝癌肿瘤模型CT造影性能评价。 
使用NMR（核磁共振）、UV-Vis（紫外可见光谱）、TEM（透射电子显微镜）、CT机表征本发明获得的树状大分子包裹的金纳米颗粒的结果分别如下： 
（1）NMR测试结果 
1H NMR图谱表明树状大分子表面基团的类型以及数量。参照说明书附图1。附图1a中出现在4ppm左右的峰为乳糖酸的质子峰，表明乳糖酸成功修饰于聚乙二醇末端。附图1b中出现在6-8ppm处的化学位移峰为异硫氰酸荧光素的特征峰。由此可证明其成功修饰于树状大分子表面。附图1c中3.5ppm处的峰为聚乙二醇的特征峰，表明其成功修饰于树状大分子表面。附图1d中1.87ppm处的特征峰为乙酰基中甲基的特征峰，显示剩余氨基已通过乙酰化反应被转化为了乙酰基。 
1H NMR图谱也同样用来表征未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs）。附图11a中3.5ppm处的峰为聚乙二醇的特征峰，表明其成功修饰于树状大分子表面。附图11b中1.87ppm处的特征峰为乙酰基中甲基的特征峰，显示剩 余氨基已通过乙酰化反应被转化为了乙酰基。 
（2）UV-Vis测试结果 
UV-Vis测试结果表明：本发明中制备得到的纳米颗粒在500nm左右出现了明显的吸收峰。参照说明书附图2。这是修饰在树状大分子表面的FITC的特征吸收峰，而金纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）峰则被FITC的特征吸收峰掩盖，但纳米颗粒在500-800nm范围内的肩峰则表明本发明成功制备得到了金纳米颗粒。所得纳米颗粒在不同pH（5-8）和温度（4-50℃）条件下具有良好的稳定性。参照说明书附图3。 
（3）TEM测试结果 
TEM测试结果显示了金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布。参照说明书附图4。金纳米颗粒的平均尺寸为2.7nm，表现出良好的单分散性。 
（4）细胞毒性试验结果 
细胞毒性试验结果表明在50-2000nM范围内，该纳米颗粒没有对L929细胞（小鼠成纤维细胞）活力造成影响，没有表现出明显的细胞毒性。参照说明书附图5a。而对HepG2细胞（人肝癌细胞），该纳米颗粒仅在50nM以下不表现出细胞毒性，在200nM及以上浓度，表现出显著的细胞毒性。参照说明书附图5b。 
（5）体外细胞靶向实验结果 
体外细胞靶向实验结果见附图6。以本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs-LA）为靶向组材料，以未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs）为非靶向组材料（Au DENPs的制备过程可参见对比例1）。当纳米颗粒与细胞共培养2h后，用流式细胞仪统计FI标记的细胞百分比，来反映纳米颗粒被细胞内化的情况。说明书附图6a为HepG2细胞的统计结果。从图中可以看出，靶向组和非靶向组材料与细胞孵育后，FI标记的细胞百分比均随着材料浓度的提高而升高，并表现出明显的差异。相对而言，靶向材料能更加有效结合HepG2细胞。对于L929细胞，靶向组和非靶向组材料与细胞孵育后，FI标记的细胞百分比同样均随着材料浓度的提高而升高，但二者并没有表现出明显的差异。参照说明书附图6b。当加入10mM LA屏蔽HepG2细胞表面受体后，靶向组和非靶向组材料孵育的细胞间不表现出明显的差异（附图6c）。这些结果表明，该纳米颗粒细胞内化的主要方式为受体-配体介导的细胞内吞。 
（6）体外X-射线衰减性能测试结果 
体外X-射线衰减性能测试结果表明，乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒与传统造影剂碘海醇相比，表现出优于碘海醇的X-射线衰减系数。参照说明书附图7。与细胞 共培养后，对细胞显示出优于未修饰乳糖酸纳米颗粒的CT增强造影作用。参照说明书附图8。 
（7）体内CT造影测试结果 
体内CT造影测试结果表明，经过尾静脉注射和腹腔注射后，乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒与未修饰乳糖酸的纳米颗粒相比，表现出增强的靶向肿瘤造影效果。参见说明书附图9和图10。 
本发明以靶向配体乳糖酸修饰的树状大分子为模板，通过原位化学合成法制备金纳米颗粒，所得产品具有良好的稳定性和靶向肿瘤CT诊断效果。本发明涉及了两个基本原理：（1）表面修饰合适数目的乳糖酸，在不影响纳米颗粒稳定性的前提下，提供良好的肝癌靶向性能。 
（2）聚乙二醇的修饰可以增加树状大分子模板的外围尺寸，提高包金量，提供良好的稳定性，以及减少纳米颗粒被网状内皮系统吞噬，利于纳米颗粒靶向肿瘤部位。 
有益效果
（1）本发明的制备过程温和，简单易行； 
（2）本发明方法制备的金纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性； 
（3）本发明制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒具有特异性靶向肿瘤CT诊断效果，为新型靶向造影剂的开发打下了良好的实验基础。 
附图说明
图1为本发明制备的聚乙二醇-乳糖酸（a）、荧光素修饰的树状大分子（b）、乳糖酸修饰的树状大分子（c），以及乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒（d）的1H NMR谱图；图2为本发明制备的荧光素修饰的树状大分子、乳糖酸修饰的树状大分子、乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒的UV-Vis谱图； 
图3为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒在不同pH（5-8）（a）和温度（4-50℃）（b）条件下的UV-Vis图谱； 
图4为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒的TEM图片（a），以及相应的尺寸分布直方图（b）； 
图5为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒的细胞毒性试验结果，其中（a）为L929细胞，（b）为HepG2细胞； 
图6为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒的体外细胞靶向试验结果，其中（a）为HepG2细胞，（b）为L929细胞，（c）为乳糖酸屏蔽的HepG2细胞；乳 糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒为靶向组，未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的树状大分子包裹的纳米金颗粒为非靶向组； 
图7为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒与碘海醇的体外X-射线衰减性能比较； 
图8为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒与未修饰乳糖酸的纳米颗粒的体外HepG2细胞CT值比较；乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒为靶向组，未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的树状大分子包裹的纳米金颗粒为非靶向组； 
图9为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒与未修饰乳糖酸的纳米颗粒对裸鼠肝癌肿瘤模型靶向CT造影图片比较；乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒为靶向组，未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的树状大分子包裹的纳米金颗粒为非靶向组；图10为本发明制备的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒与未修饰乳糖酸的纳米颗粒注射后的肿瘤部位CT值。乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒为靶向组，未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的树状大分子包裹的纳米金颗粒为非靶向组； 
图11为本发明制备的聚乙二醇修饰的树状大分子（a），以及聚乙二醇修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒（b）的1H NMR谱图。 
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 
实施例1 
取乳糖酸（LA-COOH）56.45mg，溶于6mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0，0.02M）中，磁力震荡使之充分溶解均匀。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）0.763mL（39.59mg/mL）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）0.829mL（21.87mg/mL），搅拌反应3h。取聚乙二醇（两末端分别为氨基和羧基，NH2-PEG-COOH，Mw2000）175.48mg，溶于8mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0，0.02M）中。随后，将活化的乳糖酸溶液加入聚乙二醇溶液中，搅拌反应3d。之后，经过对所得溶液进行蒸馏水（6次，2L/次）透析，然后进行冷冻干燥处理，得到聚乙二醇-乳糖酸（LA-PEG-COOH），-20℃保存。 
取异硫氰酸荧光素（FITC）6.52mg，溶于2mL二甲基亚砜（DMSO）中，磁力震荡 使之充分溶解均匀。取第五代聚酰胺-胺树状大分子（G5.NH2）64.02mg，溶于5mL DMSO中，磁力震荡使之充分溶解均匀。取FITC溶液1.764mL，加入树状大分子溶液中，磁力搅拌反应1d。反应结束后，对所得溶液进行蒸馏水（6次，2L/次）透析。然后进行冷冻干燥处理，得到荧光素修饰的树状大分子（G5.NH2-FI），-20℃保存。 
1H NMR图谱中出现在4ppm左右的峰为乳糖酸的质子峰，表明乳糖酸成功修饰于聚乙二醇末端（附图1a）。1H NMR图谱中出现在6-8ppm处的化学位移峰为异硫氰酸荧光素的特征峰（附图1b）。由此可证明荧光素成功修饰于树状大分子表面。紫外图谱中500nm的吸收峰为荧光素的吸收峰，也证明了荧光素的成功修饰（附图2）。 
实施例2 
称取实施例1制备的LA-PEG-COOH205.85mg，溶于8mL蒸馏水中。磁力搅拌中，加入EDC0.858mL（93.24mg/mL）和NHS0.838mL（57.33mg/mL），搅拌反应3h。 
取实施例1制备的G5.NH2-FI82.78mg，溶于6mL蒸馏水中。随后，加入活化好的LA-PEG-COOH溶液9.766mL，磁力搅拌反应3d。反应结束后，对所得溶液用蒸馏水（6次，2L/次）进行透析。然后进行冷冻干燥处理，得到乳糖酸修饰的树状大分子（G5.NH2-FI-PEG-LA），-20℃保存。 
1H NMR谱图结果显示出现在3.5ppm处的峰为聚乙二醇的特征峰，表明其成功修饰于树状大分子表面（附图1c）。 
实施例3 
取实施例2制备好的G5.NH2-FI-PEG-LA76.67mg，溶于76mL蒸馏水中。加入氯金酸溶液2.786mL（30mg/mL），搅拌20min。随后加入硼氢化钠溶液0.663mL（34.72mg/mL）。搅拌反应2h。 
反应2h后，加入三乙胺0.126mL，搅拌0.5h。之后，加入乙酸酐0.071mL，搅拌反应24h。反应结束后，用PBS缓冲液（3次，2L/次）和蒸馏水（3次，2L/次）对反应混和液进行透析。然后进行冷冻干燥处理，得到乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs-LA），-20℃保存。 
1H NMR谱图结果显示乙酰化反应后出现了乙酰甲基的峰（1.87ppm），表明乙酰化反应的成功进行（附图1d）。UV-Vis测试结果表明：谱图中出现的吸收峰位于500nm左右（附图2）。金纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）峰则被FITC的特征吸收峰掩盖，但纳米颗粒在500-800nm范围内的肩峰则表明本发明成功制备得到了金纳米颗粒。TEM测试结果表明：制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布为2.7±0.6nm（附图4）。Au DENPs-LA 具有良好的单分散性，未出现团聚现象。 
实施例4 
取实施例3制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒，配制为0.2mg/mL的水溶液。之后，以0.1M的盐酸或氢氧化钠调节其pH值（5.0、6.0、7.0、8.0）。室温放置20min后，进行紫外测试。 
取实施例3制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒，配制为0.2mg/mL的水溶液。之后，放置于不同温度条件（4、室温20、37、50℃）下。稳定半小时后，进行紫外测试。 
该产品在不同pH（5-8）和温度（4-50℃）条件下的紫外图谱没有发生明显的偏移和改变，表明其具有良好的稳定性（附图3）。 
实施例5 
取实施例3制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒2.14mg，用无菌PBS缓冲液配置成40000nM的母液。之后梯度稀释为500，2000，4000，6000，8000，10000，15000，20000nM的样品溶液。 
取培养好的L929细胞种于96孔板中，按照1万细胞/孔的密度接种，每孔体积200μL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的样品，与细胞共培养24h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为50，200，400，600，800，1000，1500，2000nM。每个梯度做5个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。随后用MTT法检测细胞活力。每孔加MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃孵化4h。之后除去孔中液体，加入二甲亚砜溶液200μL。摇床混匀20min。之后用酶标仪检测570nm处吸光度值。 
取培养好的HepG2细胞进行上述同样的实验。 
MTT测试结果显示，在实验浓度范围内，该纳米颗粒对L929细胞不表现出细胞毒性，显示良好的细胞相容性（附图5a）。而对HepG2细胞，浓度高于50nM后，显示出了显著的细胞毒性，是细胞活力有明显的下降。（附图5b）。这主要是因为HepG2表面有大量的人去唾液酸糖蛋白受体，可通过配体-受体结合特异性地吞噬乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒，而大量地吞噬纳米颗粒产生了一定的细胞毒性。 
实施例6 
取实施例3制备得到的Au DENPs-LA和对比例1制备的Au DENPs各2.56mg和3.05mg，用无菌PBS缓冲液配置成20000nM的母液。之后梯度稀释为500，2000，4000，6000，8000，10000nM的样品溶液。 
取培养好的HepG2细胞种于24孔板中，按照20万细胞/孔的密度接种，每孔体积1mL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的样品，与细胞共培养2h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为50，200，400，600，800，1000nM。以PBS缓冲液作为空白对照。随后，用PBS洗三次，胰酶消化后，悬浮于PBS中，用流式细胞仪进行测试。 
取培养好的L929细胞种于24孔板中，进行上述同样的实验。 
取培养好的HepG2细胞种于24孔板中，进行上述同样的实验。特别的，在加入材料之前，加入10mM的乳糖酸与细胞共培养13min。 
体外细胞靶向实验结果表明，靶向组和非靶向组均随着浓度的提高而升高，并表现出明显的差异。相对而言，靶向材料能更加有效被HepG2细胞内化（附图6a）。对于L929细胞，靶向组和非靶向组同样均随着浓度的提高而升高，但二者并没有表现出明显的差异。参照说明书附图6b。当加入10mM LA屏蔽HepG2细胞表面受体后，靶向组和非靶向组间不表现出明显的差异（附图6c）。这些结果表明，该纳米颗粒细胞内化的主要方式为受体-配体介导的细胞内吞。 
实施例7 
取实施例3制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒，以蒸馏水为溶剂，配制金浓度为0.1M的母液。之后梯度稀释出0.08，0.06，0.04，0.02，0.01和0.005M的样品。同时，以临床用碘海醇为对照材料，以蒸馏水稀释出相应碘浓度的样品。之后，对这两组材料进行CT成像测试。 
CT成像测试结果显示，在试验浓度范围内，乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒表现出明显优于碘海醇的X-射线衰减系数，具有较好的CT造影应用潜力（附图7）。 
实施例8 
取培养好的HepG2细胞种于6孔板中，按照150万细胞/孔的密度接种，每孔体积2.5mL。培养过夜后，加入上述实施例5中稀释好的200，400，600，800，1000，2000的样品，与细胞共培养2h。同时，以对比例1中未修饰乳糖酸的树状大分子包裹的纳米金颗粒为对照，配制相应的浓度梯度。每个梯度稀释10倍，即每孔终浓度分别为200，400，600，800，1000，2000nM。之后PBS洗三次，胰酶消化，分散于0.08mL PBS缓冲液中，进行CT成像测试。 
CT成像测试结果显示，与对比例1中制备的未修饰乳糖酸的树状大分子包裹的纳米金颗粒相比，乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒更易被HepG2细胞吞噬，使CT值有更为明显的提高（附图8）。这主要是由于HepG2细胞表面具有较高的ASGPR受体表 达，因而乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒可对HepG2细胞实施特异性靶向CT造影。 
实施例9 
取裸鼠四只，建立HepG2肿瘤模型。对裸鼠皮下接种培养好的HepG细胞，每只接种约500万个HepG2细胞。四周后，肿瘤可见，体积约1.3cm3。 
取实施例3制备得到的乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒41mg，分散于无菌PBS缓冲液中，制备得到金浓度为0.1M的溶液。取裸鼠两只（约20g），分别尾静脉注射和腹腔注射造影剂0.1mL，进行肿瘤模型靶向CT成像实验。间隔时间点CT扫描。对扫描图片测量各主要器官的CT值。以对比例1中未修饰乳糖酸的树状大分子包裹的纳米金颗粒为对照，另取裸鼠两只，注射金的剂量和方式保持一致。 
肿瘤模型靶向CT成像实验结果显示，静脉注射和腹腔注射后，靶向材料和非靶向材料均可富集于肿瘤部位，使其CT值得到显著提高，且最高值均出现在60min。相比之下，静脉注射能提供更为显著的肿瘤部位造影效果。与非靶向组相比，靶向组材料的造影效果有显著的提高。这主要是因为靶向组材料可以通过受体-配体的特异性结合富集于肿瘤组织。总之，本发明制备的产品在体内可持续被肿瘤组织吞噬，表现出优于非靶向材料的靶向CT造影效果。 
对比例1 
取聚乙二醇（两末端分别为甲氧基和羧基，CH3O-PEG-COOH，Mw2000）49.70mg，溶于4mL蒸馏水中。加入EDC0.888mL（26.82mg/mL）和NHS0.642mL（22.28mg/mL），搅拌反应3h。取实施例1中制备的G5.NH2-FI39.13mg，溶于6mL蒸馏水中。将活化的聚乙二醇溶液（4.653mL）加入G5.NH2-FI溶液中，搅拌反应3d。之后，经过对所得溶液进行蒸馏水（6次，2L/次）透析，然后进行冷冻干燥处理，得到聚乙二醇修饰的树状大分子（G5.NH2-FI-mPEG）. 
取制备好的G5.NH2-FI-mPEG74.51mg，溶于74mL蒸馏水中。加入氯金酸溶液2.606mL（30mg/mL），搅拌20min。随后加入硼氢化钠溶液0.620mL（34.72mg/mL）。搅拌反应2h。反应结束，加入三乙胺0.117mL，搅拌0.5h。之后，加入乙酸酐0.067mL，搅拌反应24h。反应结束后，用PBS缓冲液（3次，2L/次）和蒸馏水（3次，2L/次）对反应混和液进行透析。然后进行冷冻干燥处理，得到未修饰乳糖酸、仅修饰聚乙二醇的的树状大分子包裹的纳米金颗粒（Au DENPs），-20℃保存，将作为非靶向组材料用于细胞和动物实验。 
1H NMR谱图结果显示出现在3.5ppm处的峰为聚乙二醇的特征峰，表明其成功修饰于树状大分子表面（附图11a）。1H NMR谱图结果显示乙酰化反应后出现了乙酰甲基的峰（1.87ppm），表明乙酰化反应的成功进行（附图11b）。 

Claims (10)

1.一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，包括：
（1）将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2加入溶剂中，得到溶液，然后加入异硫氰酸荧光素FITC，搅拌反应12-24h，透析，冷冻干燥，得到荧光素修饰的树状大分子G5.NH2-FI；其中树状大分子和FITC的摩尔比为1:5；
（2）将乳糖酸LA-COOH加入溶剂中，得溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌反应1-3h，然后加入聚乙二醇溶液中，搅拌反应2-3d，透析，冷冻干燥处理，得到聚乙二醇-乳糖酸LA-PEG-COOH；其中乳糖酸LA-COOH、EDC、NHS的摩尔比为1：1：1；乳糖酸和聚乙二醇的摩尔比为1.5:1；
（3）将上述LA-PEG-COOH配制成水溶液后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，搅拌反应1-3h，然后加入G5.NH2-FI的水溶液中，搅拌反应1-3d，透析，冷冻干燥，得到乳糖酸修饰的树状大分子G5.NH2-FI-PEG-LA；其中G5.NH2-FI和LA-PEG-COOH摩尔投料比为1:15-20；LA-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:5-6:5-6；
（4）将上述G5.NH2-FI-PEG-LA配制成水溶液，加入氯金酸水溶液，搅拌10-30min，加入硼氢化钠溶液，搅拌1-2h，加入三乙胺，搅拌10-30min，加入乙酸酐，搅拌反应24-36h，透析，冷冻干燥，即得乳糖酸修饰的树状大分子包裹的纳米金颗粒Au DENPs-LA，其中氯金酸和G5.NH2-FI-PEG-LA的摩尔比为150:1；硼氢化钠和氯金酸的摩尔比为3:1；三乙胺为树状大分子末端氨基摩尔数6-12倍；乙酸酐为树状大分子末端氨基摩尔数5-10倍。
2.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中第五代聚酰胺-胺树状大分子的浓度为5-15mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中溶剂为二甲基亚砜DMSO。
4.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中聚乙二醇的Mw=2000。
5.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中溶剂为pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，乳糖酸LA-COOH溶液的浓度为5-10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中聚乙二醇溶液的溶剂为pH为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，聚乙二醇溶液的浓度为15-25mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中LA-PEG-COOH水溶液的浓度为10-20mg/mL，G5.NH2-FI水溶液的浓度为10-15mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中G5.NH2-FI-PEG-LA水溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，氯金酸水溶液的浓度为30mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中透析为分别对PBS缓冲液和水透析。
10.根据权利要求1所述的一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）所得的Au DENPs-LA为靶向造影剂，应用于裸鼠肝癌肿瘤模型靶向CT造影。
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