CN104258420A - 一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为ct纳米造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，包括：将LA-PEG-COOH溶解在溶剂中，然后加入EDC活化4-6h后滴加入G2-FITC溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G2-FITC-PEG-LA；将G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸馏水中，加入氯金酸水溶液，搅拌10-20min，然后加入NaBH4水溶液，搅拌反应2-3h，透析，冷冻干燥，即得。本发明使用原料价格相对低廉；制备的以低代数树状大分子为模板的金纳米颗粒具备优异的稳定性和生物相容性，表现出延长的体内血液循环时间，并且对肝癌细胞具有特异性的靶向作用，有望用于肿瘤的早期检测。
Description
技术领域
本发明属于纳米造影剂的制备领域，特别涉及一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法。
背景技术
计算机X射线断层扫描(Computed Tomography，CT)利用人体不同的组织对X射线的透过率的不同，可对人体内部骨骼和组织进行成像，兼有空间分辨率高、可整体成像、图像采集时间短、相对经济等优点。为增加靶组织与正常组织的区分度，需要造影剂凸显病灶。目前临床广泛使用的CT造影剂主要为含碘的小分子化合物(如泛影酸、碘海醇等)。由于肾脏对含碘小分子造影剂有快速消除效应，含碘化合物只有非常短的成像时间，并且对肾脏有一定的毒副作用(Haller,C.；Hizoh,I.Invest.Radiol.2004,39,149-154.)。因此，开发新型造影剂具有一定的必要性。
金元素由于X射线吸收系数大大高于碘而受到关注，单位质量的金比碘的造影效果好2.7倍，显示其做CT造影剂的潜力。通过表面修饰，金纳米颗粒能在生理环境(如细胞培养液、血液、病变组织等)下具有良好的稳定性和分散性。另外，报道的金纳米颗粒造影剂具备良好的生物相容性和低生物毒性，揭示了金纳米颗粒造影剂的良好前景。聚酰胺-胺树枝状大分子(PAMAM)因其精确的结构、大量表面官能团和纳米尺寸，作为载体广受关注。已有研究人员用第四代、第五代聚酰胺-胺树状大分子作为模板制备金纳米颗粒(＜5nm)用于CT成像，均取得优于传统造影剂更强的CT信号及更长的血液循环时间。
与高代数的树状大分子不同，低代数的树状大分子因其代数低而具有开放式的结构，以及较少的表面基团。Liu等(Liu,H.；Xu,Y.H.；Wen,S.H.；Chen,Q.；Zheng,L.F.；Shen,M.W.；Zhao,J.L.；Zhang,G.X.；Shi,X.Y.Chemistry-A European Journal2013,19,6409-6416.)用第二代聚酰胺-胺树状大分子作为稳定剂制备金纳米颗粒(＞5nm)并修饰叶酸靶向剂，实现对肿瘤组织的CT成像识别。另外，Liu等(Liu,H.；Wang,H.；Xu,Y.H.；Shen,M.W.；Zhao,J.L.；Zhang,G.X.；Shi,X.Y.Nanoscale2014,6,4521-4526.)制备聚乙二醇化第二代树状大分子/金纳米颗粒，成功控制颗粒纳米尺寸，提高载金量和生物相容性。本专利在第二代树状大分子外围修饰连接有一端为乳糖酸的聚乙二醇链，该载体包裹合成小尺寸金纳米颗粒用于靶向肝癌的CT成像。另外，用荧光素化学标记载体，可以有效地跟踪细胞对颗粒的吞噬情况。
检索国内外有关金纳米颗粒用于CT造影方面的文献和专利结果发现：在本发明完成之前，还未发现荧光素标记和乳糖酸修饰的聚乙二醇化第二代树状大分子包裹金纳米颗粒的制备及其CT成像应用的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，本发明制备过程简单，反应条件温和，具有产业化实施的前景；制备得到的金纳米颗粒具备优异的稳定性和生物相容性。
本发明的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，包括：
(1)用荧光素标记树状大分子，得到异硫氰酸荧光素修饰的树状大分子G2-FITC；
(2)将乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-COOH溶解在溶剂中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化4-6h后滴加入G2-FITC溶液中，室温条件下搅拌反应72-80h，透析，冷冻干燥，得到荧光素标记和乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子G2-FITC-PEG-LA；
(3)将上述荧光素标记和乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸馏水中，加入氯金酸水溶液，在室温条件下搅拌10-20min，然后加入NaBH4水溶液，室温下搅拌反应2-3h，透析，冷冻干燥，即得具有肝癌靶向功能的CT纳米造影剂。
所述步骤(1)中树状大分子为第2代聚酰胺-胺树状大分子。
所述步骤(1)中树状大分子与异硫氰酸荧光素的摩尔投料比为1:3.5。
所述步骤(2)中溶剂为二甲基亚砜。
所述步骤(2)中乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-COOH中乳糖酸与聚乙二醇的摩尔投料比为1.5:1。
所述步骤(2)中LA-PEG-COOH溶解在溶剂中后的浓度为10-15mg/mL。
所述步骤(2)中G2-FITC溶液的溶剂为二甲基亚砜，G2-FITC溶液的浓度为0.3-0.5mg/mL。
所述步骤(2)中LA-PEG-COOH、EDC与G2-FITC的摩尔投料比为15:15:1。
所述步骤(3)中G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸馏水中的浓度为5-10mg/mL；氯金酸水溶液的浓度为20-30mg/mL；NaBH4水溶液的浓度为10-15mg/mL。
所述步骤(3)中NaBH4水溶液为冰浴预处理后的NaBH4水溶液。
所述步骤(3)中NaBH4与氯金酸的摩尔投料比为5-8:1；氯金酸与树状大分子的摩尔投料比为8:1。
所述步骤(2)、(3)中的透析为用透析膜先在PBS缓冲液中透析20-30h，然后再在蒸馏水透析40-60h。其中步骤(2)按顺序所述所用透析膜为纤维素透析膜MWCO＝14000；步骤(3)所述的透析膜为纤维素透析膜MWCO＝14000。
用荧光素标记树状大分子，得到异硫氰酸荧光素修饰的树状大分子G2-FITC，具体为：
第二代聚酰胺-胺树状大分子(G2.NH2)溶于二甲基亚砜中，边搅拌边加入异硫氰酸荧光素(0.4mg/mL)的二甲基亚砜溶液。室温反应24h，对反应液进行透析，蒸馏水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷冻干燥得到异硫氰酸荧光素修饰的树状大分子，-20℃保存；其中树状大分子与异硫氰酸荧光素的摩尔投料比为1:3.5；透析所用的透析膜为纤维素透析膜MWCO＝1000。
LA-PEG-COOH的制备为：
乳糖酸溶于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.0，0.02M)中，边搅拌边加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。室温反应3h。活化后，滴加入溶有聚乙二醇(Mw2000，两末端分别为氨基和羧基，10mg/mL)的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.0，0.02M)中。室温反应72h，对反应液进行透析，蒸馏水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇，-20℃保存；其中乳糖酸与聚乙二醇的摩尔投料比为1.5:1。
本发明的一种荧光素标记和乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒用于CT成像。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外－可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、MTT法、细胞流式术、CT成像等方法表征本发明制备的异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒，具体测试结果如下：
(1)1H NMR谱
核磁共振氢谱结果证实了{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs的结构正确，参见附图1。其中a对应G2-FITC，b对应PEG-LA，c对应G2-FITC-PEG-LA。
(2)UV-Vis测试结果
合成的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs在500-520nm左右有一个特征吸收峰，它们分别是异硫氰酸荧光素的特征吸收峰和金纳米颗粒的表面等离子体共振峰的叠加，参见附图2；异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒能稳定分散在水中，且在不同的pH值(pH＝5.0-8.0)和不同温度(4℃-50℃)范围内均具有非常好的稳定性(pH值降低，异硫氰酸荧光素的特征吸收峰蓝移，与金纳米颗粒无关)。参见附图3和附图4。
(3)TEM测试结果
{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs的TEM图片和粒度分布直方图(参见附图5)表明本方法合成的金纳米颗粒的粒径分布均匀，平均粒径约为1.8nm。
(4)体外X-射线衰减性能
体外X-射线衰减性能测试结果表明，异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒表现出优于传统造影剂碘海醇的X-射线衰减系数。参见附图6。
(5)MTT细胞活力检测
将不同浓度的材料与细胞共培养，细胞毒性试验结果表明在200-3000nM范围内，异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒显示优良的细胞相容性，没有表现出显著的细胞毒性。对比材料{(Au0)8–G2.NH2-FITC-mPEG6}DENPs(用NH2-PEG-COOH代替LA-PEG-COOH修饰G2-FITC)也以同样的方案进行对比。参见附图7。(6)流式细胞术对材料靶向HepG2细胞能力的检测
流式细胞术结果表明相同浓度下的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs较于对比材料更容易进入HepG2细胞，证明异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒对HepG2细胞具有特异性靶向作用。参见附图8。
(7)体外材料靶向HepG2细胞的CT成像
CT扫描结果表明相同金浓度下{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与HepG2细胞共培养后处理的细胞悬浮液的CT信号比对比材料强，证明异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒对HepG2细胞具有特异性靶向作用。参见附图9。
(8)体内CT造影测试
体内CT造影测试结果表明，聚乙二醇化树状大分子/金纳米颗粒与传统造影剂碘海醇相比，表现出延长的血液循环时间。相比之下，碘海醇20min左右即被迅速代谢。另外，相同剂量注射靶向材料和非靶向材料后，前者肿瘤部位的CT值更高，说明材料更易被运输到肿瘤位点，有更好的造影效果。参见附图10和11。
(9)体内分布情况检测
ICP-OES结果显示尾静脉注射120min后，除了肾脏以外，纳米颗粒主要富集于脾脏和肝脏等内皮网状系统。这说明，该聚乙二醇化树状大分子/金纳米颗粒主要通过内皮网状系统代谢。而相对于非靶向对照组，靶向金纳米颗粒在肿瘤处富集量更多，证明了本材料的特异性靶向作用。参见附图12。24h和48h的组织分布显示纳米颗粒仍然集中于脾脏、肝脏和肾脏，并逐步代谢。参见附图13。
有益效果
(1)本发明的制备过程简单，反应条件温和，具有产业化实施的可能性；
(2)本发明方法制备的金纳米颗粒具备优异的稳定性和生物相容性，表现出延长的体内血液循环时间。
(3)本发明的异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒对肝癌细胞HepG2具有较好的靶向性，同时具有优于传统造影剂碘海醇的CT值，是一种有潜力的新型造影剂。
附图说明
图1为本发明制备的中间产物的1H NMR，其中a对应G2-FITC，b对应PEG-LA，c对应G2-FITC-PEG-LA；
图2为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs在25℃、pH＝7.0的紫外吸收光谱图；
图3为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs在不同温度下的UV-Vis谱图；
图4为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs(a)和G2.NH2-FITC(b)在不同pH条件下的UV-Vis谱图；
图5为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs的(a)TEM图片；(b)高分辨TEM图片；(c)粒径分布图；
图6为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与碘海醇的体外X-射线衰减系数比较；图6a为CT成像图片(1碘海醇，2{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs)，图6b为测得的X-射线衰减强度结果；
图7为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与对比材料的细胞毒性试验结果；
图8为流式细胞术测定的本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与对比材料被HepG2细胞吞噬情况的比较；
图9为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与对比材料的细胞CT成像效果和CT值的比较；图9a为CT成像图片，图9b为测得的X-射线衰减强度结果；
图10为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与碘海醇、对照材料尾静脉注射后对小鼠肿瘤模型造影效果；
图11为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与碘海醇、对照材料尾静脉注射后小鼠肿瘤区域CT值比较，灰色箭头指向肿瘤区域；
图12为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs与对照材料尾静脉注射120min后的体内组织分布情况；
图13为本发明制备的{(Au0)8–G2.NH2-FITC-PEG6-LA4.8}DENPs尾静脉注射24h和48h后的体内组织分布情况；
图14为本发明的反应原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)第二代聚酰胺-胺树状大分子(G2.NH2)16.28mg溶于3.2mL二甲基亚砜中，边搅拌边加入异硫氰酸荧光素(0.4mg/mL)的二甲基亚砜溶液17.04mL。室温反应24h，对反应液进行透析，蒸馏水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷冻干燥得到异硫氰酸荧光素修饰的树状大分子，-20℃保存。1H NMR测试结果表明：谱图中出现在2.0-3.7ppm和6.3-8.0ppm的化学位移峰分别对应为树状大分子和异硫氰酸荧光素的特征峰。由积分面积计算可得，每个树状大分子表面修饰了约2.5个异硫氰酸荧光素分子(附图1a)。
(2)乳糖酸32.25mg溶于3.75mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.0，0.02M)中，边搅拌边加入17.25mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10.36mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。室温反应3h。活化后，滴加入12mL溶有聚乙二醇(Mw2000，两末端分别为氨基和羧基，10mg/mL)的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.0，0.02M)中。室温反应72h，对反应液进行透析，蒸馏水(6次，2L/次)，透析3天。然后冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇，-20℃保存。1H NMR测试结果表明：谱图中出现在3.7ppm和3.8-4.3ppm的化学位移峰分别对应为聚乙二醇和乳糖酸的特征峰。由积分面积计算可得，每个聚乙二醇修饰了约0.8个乳糖酸分子(附图1b)。
(3)将(2)所得产品132.35mg溶于9.00mL二甲基亚砜中。随后，边搅拌边加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)11.10mg。室温反应6h。活化后，滴加入(1)所得产品的二甲基亚砜溶液32.64mL(0.5mg/mL)中，室温搅拌反应72h。反应结束后，对所得溶液进行透析，蒸馏水(6次，2L/次)，透析3天。然后进行冷冻干燥处理得到异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子，-20℃保存。1H NMR测试结果表明：谱图中出现在3.7ppm的化学位移峰为聚乙二醇中亚甲基的特征峰，2.0-3.7ppm的化学位移峰为树状大分子的特征峰。由积分面积计算可得，树状大分子表面修饰了约6个一端为乳糖酸的聚乙二醇分子(附图1c)。
实施例2
异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子34.63mg，溶于6.00mL蒸馏水中。随后，边搅拌边加入氯金酸水溶液211.89μL(30mg/mL)。磁力搅拌10min后，加入冰浴预处理的硼氢化钠溶液291.94μL(10mg/mL)，室温反应3h。反应结束后，对所得溶液进行透析，蒸馏水(6次，2L/次)，透析3天。然后进行冷冻干燥处理，得到终产品，-20℃保存。UV-Vis测试结果表明：谱图中在510nm左右有吸收峰(附图2)，为纳米金表面等离子体共振峰和荧光素的吸收峰的叠加，这表明体系中成功制备了金纳米颗粒。TEM测试结果表明：制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布较窄，具有良好的水分散性，平均粒径约1.8nm(附图5)。
实施例3
配置实施例2所得产品水溶液(0.5mg/mL)，置于不同温度下半小时后，测定其紫外图谱，确定产品在不同温度下的稳定性。发现，在不同温度(4-50℃)条件下，实施例2所得产品的紫外图谱没有发生明显的偏移和改变，表明其具有良好的稳定性(附图3)。
取实施例2所得产品配制为0.5mg/mL的水溶液，以0.1M的盐酸或氢氧化钠调节其pH值(5.0、6.0、7.0、8.0)。室温放置20min后，进行紫外测试。该产品在不同pH值(5.0-8.0)条件下的紫外图谱经对比分析没有发生因颗粒团聚而引起的偏移和改变，表明其具有良好的稳定性(附图4)。
实施例4
取实施例2所得产品用无菌PBS缓冲液配置成30000nM的母液。之后梯度稀释为2000、5000、10000、20000nM的样品溶液。另以同样方案准备不含乳糖酸靶向分子的对照材料的样品溶液。
取培养好的HepG2细胞种于96孔板中，按照1万细胞/孔的密度接种，每孔体积200μL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的样品，与细胞共培养24h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为200、500、1000、2000、3000nM。每个梯度做5个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。随后用MTT法检测细胞活力。每孔加MTT溶液(20μL，5mg/mL)，37℃孵化4h。之后除去孔中液体，加入二甲基亚砜200μL。摇床混匀20min。之后用酶标仪检测570nm处吸光度值。
MTT测试结果显示，异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒在此范围内不显示出细胞毒性，表现出良好的细胞相容性(附图7)。
实施例5
取实施例2所得产品用无菌PBS缓冲液配制成30000nM的母液。之后梯度稀释为2000、4000、6000、8000、10000nM的样品溶液。另以同样方案准备不含乳糖酸靶向分子的对照材料的样品溶液。
取培养好的HepG2细胞种于24孔板中，按照20万细胞/孔的密度接种，每孔体积1mL。培养过夜后，加入上述两种各稀释梯度的样品，与细胞共培养4h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为200、400、600、800、1000nM。每个梯度做3个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在1mL PBS缓冲液中。随后用流式细胞术检测细胞吞噬两种材料的情况。流式细胞术测试结果显示，细胞对含乳糖酸靶向材料的吞噬能力强于不含靶向的对照材料(附图8)。证明异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒对HepG2细胞具有特异性靶向作用。
实施例6
取实施例2所得产品以蒸馏水为溶剂，配制金浓度为0.08M的母液。之后梯度稀释出0.06、0.04、0.02、0.01和0.005M的样品。同时，以临床用碘海醇为对照材料，以蒸馏水稀释出相应碘浓度的样品。之后，对这两组材料进行CT成像测试。
CT成像测试结果显示，在试验浓度范围内，异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒表现出优于碘海醇的X-射线衰减系数(附图6)。
实施例7
取实施例2所得产品以PBS缓冲液为溶剂，用无菌PBS缓冲液配制成30000nM的母液。之后梯度稀释为2000、5000、10000、20000nM的样品溶液。另以同样方案准备不含乳糖酸靶向分子的对照材料的样品溶液。
取培养好的HepG2细胞种于6孔板中，按照200万细胞/孔的密度接种，每孔体积2mL。培养过夜后，加入上述两种各稀释梯度的样品，与细胞共培养4h。每个梯度用培养液稀释10倍，即每孔终浓度分别为200、500、1000、2000nM。以PBS缓冲液作为空白对照。胰酶消化离心后收集细胞，并将细胞均匀的分散在200μL PBS缓冲液中。之后，对这两组材料进行CT成像测试。
CT成像测试结果显示，在试验浓度范围内，异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒表现出优于不含乳糖酸靶向试剂的对照材料的CT值(附图9)。证明异硫氰酸荧光素标记、乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子包裹金纳米颗粒对HepG2细胞具有特异性靶向作用。
实验例8
取实施例2所得产品12.1mg，分散于无菌PBS缓冲液中，制备得到金浓度为0.05M的溶液。取荷瘤裸鼠(肝癌)一只，尾静脉注射造影剂0.1mL，进行活体CT成像实验。以碘海醇和相同剂量不含靶向的对照材料为对照，注射碘的剂量与金一致。三只裸鼠重量为24-28g，肿瘤大小为0.5-0.8cm3。
体内CT造影测试结果(附图10和11)表明，聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒与传统造影剂碘海醇相比，表现出延长的血液循环时间。相比之下，碘海醇20min左右即被迅速代谢。另外，相同剂量注射的靶向材料和非靶向材料后，前者肿瘤部位的CT值更高，说明材料更易被运输到肿瘤位点，有更好的造影效果。
实验例9
实施例8中荷瘤裸鼠的CT扫描结束后，立即将其处死，取血液、肿瘤和各主要器官(心、肝、脾、肺、肾)称重，以注射碘海醇的荷瘤裸鼠作为空白对照。将取好的器官浸泡于王水过夜。随后过滤、稀释，进行ICP-OES测试(附图12)。
另取两只近似大小的荷瘤裸鼠通过尾静脉注射同上相同剂量的终产品，分别在24h和48h后处死，取肿瘤和各主要器官(心、肝、脾、肺、肾)称重。将取好的器官浸泡于王水过夜。随后过滤、稀释，进行ICP-OES测试(附图13)。
ICP-OES结果显示尾静脉注射120min后，除了肾脏以外，纳米颗粒主要富集于脾脏和肝脏等内皮网状系统。这说明，该聚乙二醇化树状大分子/金纳米颗粒主要通过内皮网状系统代谢。而相对于非靶向对照组，靶向金纳米颗粒在肿瘤处富集量更多，证明了本材料的特异性靶向作用。24h和48h的组织分布显示纳米颗粒仍然集中于脾脏、肝脏和肾脏，并逐步代谢。
Claims (9)
1.一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，包括：
(1)用荧光素标记树状大分子，得到异硫氰酸荧光素修饰的树状大分子G2-FITC；
(2)将乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-COOH溶解在溶剂中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化4-6h后滴加入G2-FITC溶液中，室温条件下搅拌反应72-80h，透析，冷冻干燥，得到荧光素标记和乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子G2-FITC-PEG-LA；
(3)将上述荧光素标记和乳糖酸修饰的聚乙二醇化树状大分子G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸馏水中，加入氯金酸水溶液，在室温条件下搅拌10-20min，然后加入NaBH4水溶液，室温下搅拌反应2-3h，透析，冷冻干燥，即得具有肝癌靶向功能的CT纳米造影剂。
2.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中树状大分子为第2代聚酰胺-胺树状大分子；树状大分子与异硫氰酸荧光素的摩尔投料比为1:3.5。
3.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中溶剂为二甲基亚砜；LA-PEG-COOH溶解在溶剂中后的浓度为10-15mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中G2-FITC溶液的溶剂为二甲基亚砜，G2-FITC溶液的浓度为0.3-0.5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中乳糖酸-聚乙二醇LA-PEG-COOH中乳糖酸与聚乙二醇的摩尔投料比为1.5:1；LA-PEG-COOH、EDC与G2-FITC的摩尔投料比为15:15:1。
6.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中G2-FITC-PEG-LA溶解在蒸馏水中的浓度为5-10mg/mL；氯金酸水溶液的浓度为20-30mg/mL；NaBH4水溶液的浓度为10-15mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中NaBH4水溶液为冰浴预处理后的NaBH4水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中NaBH4与氯金酸的摩尔投料比为5-8:1；氯金酸与树状大分子的摩尔投料比为8:1。
9.根据权利要求1所述的一种具有肝癌靶向功能的低代数树状大分子包裹的金纳米颗粒作为CT纳米造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)中的透析为用透析膜先在PBS缓冲液中透析20-30h，然后再在蒸馏水透析40-60h。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN105251028A (zh) * | 2015-11-05 | 2016-01-20 | 东华大学 | 具有fa靶向功能的基于低代树状大分子的spect/ct双模态成像造影剂的制备方法 |
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| CN106475569A (zh) * | 2015-09-01 | 2017-03-08 | 中国科学院高能物理研究所 | 一种金属纳米团簇的制备方法、由该方法制得的纳米团簇及包含该纳米团簇的造影剂 |
| CN110003487A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-07-12 | 江苏大学 | 一种树枝状含糖聚酰胺胺修饰的金纳米簇的制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102989014A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-03-27 | 东华大学 | 基于第二代聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒的ct造影剂的制备方法 |
| CN103212091A (zh) * | 2013-04-28 | 2013-07-24 | 东华大学 | 一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法 |
| CN103435815A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-12-11 | 东华大学 | 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法 |
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Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN102989014A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-03-27 | 东华大学 | 基于第二代聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒的ct造影剂的制备方法 |
| CN103212091A (zh) * | 2013-04-28 | 2013-07-24 | 东华大学 | 一种基于Au DENPs-LA的肝癌靶向CT造影剂的制备方法 |
| CN103435815A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-12-11 | 东华大学 | 一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法 |
| CN103710388A (zh) * | 2013-12-25 | 2014-04-09 | 东华大学 | 包裹纳米金颗粒的peg功能化的pamam树状大分子载体的基因转染方法 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106475569A (zh) * | 2015-09-01 | 2017-03-08 | 中国科学院高能物理研究所 | 一种金属纳米团簇的制备方法、由该方法制得的纳米团簇及包含该纳米团簇的造影剂 |
| CN106475569B (zh) * | 2015-09-01 | 2019-01-25 | 中国科学院高能物理研究所 | 一种金属纳米团簇的制备方法、由该方法制得的纳米团簇及包含该纳米团簇的造影剂 |
| CN105251028A (zh) * | 2015-11-05 | 2016-01-20 | 东华大学 | 具有fa靶向功能的基于低代树状大分子的spect/ct双模态成像造影剂的制备方法 |
| CN105251028B (zh) * | 2015-11-05 | 2020-12-18 | 东华大学 | 具有fa靶向功能的基于低代树状大分子的spect/ct双模态成像造影剂的制备方法 |
| CN106389384A (zh) * | 2016-03-14 | 2017-02-15 | 四川大学 | 一种多级肝靶向智能化纳米递药系统的制备方法和应用 |
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| CN110003487A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-07-12 | 江苏大学 | 一种树枝状含糖聚酰胺胺修饰的金纳米簇的制备方法 |
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