CN105251028B - 具有fa靶向功能的基于低代树状大分子的spect/ct双模态成像造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,包括:以第二代聚酰胺‑胺树状大分子作为高分子载体材料,在其表面修饰二乙基三胺五乙酸和一端为FA的聚乙二醇链,通过原位合成法包裹金纳米颗粒,并标记99mTc,即得FA靶向SPECT/CT造影剂。本发明的制备方法简单,使用原料价格相对低廉。本发明制备得到的基于低代树状大分子的SPECT/CT造影剂具备优异的稳定性、生物相容性和较长的体内血液循环时间,具有良好的SPECT/CT成像效果,且对HeLa细胞具有特异性的靶向作用,为具有靶向功能的双模态成像造影剂的开发提供了一种新方法,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于造影剂的制备方法领域,特别涉及一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法。
背景技术
核医学影像中SPECT或PET显像设备能接收放射性核素发出的射线,能清晰地观察到造影剂参与生物体内各种生理生化及代谢方面的功能信号,获得定性、定量及定位的临床疾病诊治结果。这种显像方式与传统的形态学成像方法(CT、B超、MRI)相比,可以反映脏器或组织的血流变化、受体密度及活性改变、代谢及功能变化,成为临床诊治疾病的最先进技术之一。同时,核医学成像也存在空间分辨率低和不能明确定位影像解剖学位置的缺点。PET/CT及SPECT/CT双模态成像技术能同时获得体内SPECT的功能代谢信息和CT的解剖诊断信息的图像融合与诊断效能倍增(王荣福,李险峰,王强.SPECT/CT的最新应用进展[J].CT理论与应用研究,2012,21(3):577-582.)。因此,与单独的SPECT或CT相比,SPECT/CT在诊断疾病以及评价预后等方面都更加具有临床应用意义。
虽然SPECT/CT双模态影像设备已经在临床上有了极大的推广,但是相应的SPECT/CT双模态成像造影剂的研制开发还没有得到足够的重视。虽然CT和SPECT两种成像造影剂的使用可以完成相应的造影成像,但会给临床操作造成不便,也会增加造影剂对患者的毒副作用,同时还存在造影剂之间难以协调,体内分别存在差异的现象。因此,研制开发一种多功能的造影剂体系适用于SPECT/CT双模态成像造影诊断,将会极大地提高诊断的灵敏度与准确度,并对患者造成较小的痛苦和毒副作用,在临床中将具有极大应用价值。
低代树状大分子因其代数低而具有开放式的结构以及表面基团较少等特点。Liu等(Liu,H.;Xu,Y.H.;Wen,S.H.;Chen,Q.;Zheng,L.F.;Shen,M.W.;Zhao,J.L.;Zhang,G.X.;Shi,X.Y.Chemistry-AEuropean Journal 2013,19,6409-6416.)用第二代聚酰胺-胺树状大分子作为稳定剂制备金纳米颗粒(>5nm)并修饰叶酸靶向剂,实现对肿瘤组织的CT成像识别。Cao等(Cao,Y.Y.;He,Y.;Liu,H.;Luo,Y.;Shen,M.W.;Xia,J.D.;Shi,X.Y.JournalofMaterials Chemistry 2015,3,286-295.)制备了第二代聚酰胺-胺树状大分子包裹金纳米颗粒具有乳糖酸靶向肝癌功能的CT纳米造影剂,具有很好的特异性靶向功能和良好的CT成像效果。史向阳等(史向阳,温诗辉,赵晋华,赵凌舟.功能化的基于树状大分子的SPECT-CT双模态成像造影剂及其制备方法:中国,201410271238.8[P].2014.06.18)用第五代树状大分子包裹金纳米颗粒并标记99mTc,实现了小鼠体内不同组织部位的SPECT/CT成像,且成像效果良好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,该方法工艺简单,成本较低,并具有良好的SPECT/CT成像效果,具有产业化实施的前景。
本发明的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,包括:
(1)将第二代聚酰胺胺树状大分子G2.NH2溶解在水中,加入二乙三胺五乙酸环酸酐cDTPAA水溶液,室温搅拌8~12h,得到G2-DTPA;其中,G2.NH2和cDTPAA的摩尔比为1:3-5;
(20将叶酸-聚乙二醇FA-PEG-COOH溶解在水中,然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化,然后滴加入步骤(1)中的G2-DTPA溶液中,室温条件下搅拌反应72-80h,透析,冷冻干燥,得到修饰了二乙基三胺五乙酸和叶酸-聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-PEG-FA;其中,FA-PEG-COOH与G2-DTPA的摩尔比为10-15:1;
(3)将步骤(2)中的G2-DTPA-PEG-FA溶解在水中,加入氯金酸水溶液,在室温条件下搅拌,然后加入硼氢化钠水溶液,冰水中搅拌反应2-3h,透析,冷冻干燥,得到包裹金纳米颗粒的修饰了二乙基三胺五乙酸和叶酸-聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-PEG-FA@Au;其中,氯金酸与G2-DTPA-PEG-FA的摩尔比为6-9:1;
(4)将步骤(3)中G2-DTPA-PEG-FA@Au溶解在放射性高锝酸盐溶液中,加入氯化亚锡,经柱层析分析,即得包裹金纳米颗粒和螯合核素99mTc的具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc。
所述步骤(2)中FA-PEG-COOH溶解在水中的浓度为4-6mg/mL。
所述步骤(2)中FA-PEG-COOH中FA与聚乙二醇的摩尔比为2-3:1。
所述步骤(2)中FA-PEG-COOH与EDC的摩尔比为1:1。
所述步骤(2)中活化的时间为4-6h。
所述步骤(2)中G2-DTPA溶液浓度为2-3mg/mL。
所述步骤(2)中G2-DTPA溶液的溶剂为水。
所述步骤(2)中透析为用透析膜先在PBS缓冲液中透析20-30h,然后再在蒸馏水透析40-60h,所用透析膜为纤维素透析膜MWCO=3000。
所述步骤(3)中G2-DTPA-PEG-FA溶解在水中的浓度为1-2mg/mL;氯金酸水溶液的浓度为10-20mg/mL;硼氢化钠水溶液的浓度为10-15mg/mL。
所述步骤(3)中搅拌的时间为10-20min。
所述步骤(3)中硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为5-8:1。
所述步骤(3)中透析为用透析膜在蒸馏水透析60-80h,所用透析膜为纤维素透析膜MWCO=2000。
所述步骤(4)中G2-DTPA-PEG-FA@Au的质量,放射性高锝酸盐溶液的放射量和氯化亚锡质量的比例为28mg:37-74mBq:100-150μg。
所述步骤(4)中高锝酸盐为KTcO4。
所述步骤(4)中G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc用凝胶过滤柱分离纯化,99mTc的标记率为70%,放化纯大于99%。
所述步骤(4)中G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc应用于靶向宫颈癌的SPECT/CT双模态成像。
FA-PEG-COOH的制备为:
FA、EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS、聚乙二醇(Mw=2000,NH2-PEG-COOH)分别溶于二甲基亚砜中,其中聚乙二醇、FA、EDC和NHS的摩尔比为1:2.5:2:2。先将溶于二甲基亚砜的FA和EDC搅拌反应30min,再滴加入NHS搅拌反应3h,之后再滴加入溶有聚乙二醇的二甲基亚砜搅拌反应12-24h。对反应液进行透析,蒸馏水(6次,2L/次),透析3天。然后冷冻干燥得到FA修饰的聚乙二醇,其中FA与聚乙二醇的摩尔比测试为0.7:1。
本发明在第二代树状大分子上修饰了二乙基三胺五乙酸和一端为FA的聚乙二醇链,该载体包裹小尺寸金纳米颗粒和标记99mTc用于靶向宫颈癌的SPECT/CT双模态成像。
目前,还没有发现修饰了二乙基三胺五乙酸和一端为FA的聚乙二醇链的第二代树状大分子包裹金纳米颗粒和螯合99mTc的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备与应用方面的报道。
本发明的一种修饰了DTPA和FA-PEG-COOH的树状大分子包裹金纳米颗粒和螯合99mTc用于SPECT/CT双模态成像。
本发明使用核磁共振氢谱(1HNMR)、紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、MTT测试(细胞活力分析)、以及体内SPECT/CT成像表征本发明制备的具有双模态造影功能的低代数树状大分子。
本发明利用低代树状大分子的特定结构和性质,将99mTc螯合剂DTPA接枝在树状大分子表面以螯合99mTc实现SPECT成像,然后将FA-PEG-COOH接枝在树状大分子表面既增加其血液循环时间,提高生物相容性,又使其具备特异性靶向功能,最后在树状大分子内部包裹纳米金颗粒用于CT成像,从而制备出优良性能的SPECT/CT双模态造影剂,实现不同成像技术的造影剂需求。
有益效果
(1)本发明采用温和的反应条件制备G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc颗粒用于SPECT/CT双模态成像造影剂,制备方法简单,成本较低,具有产业化实施的前景;
(2)本发明的SPECT/CT双模态成像造影剂具有良好的SPECT/CT成像效果,为多功能造影剂的开发打下了良好的基础;
(3)本发明的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc颗粒对宫颈癌具有较好的特异性靶向作用,同时具有SPECT和CT的成像优势,是一种有潜力的双模态成像新型造影剂;
(4)本发明的制备方法可用于制备具有靶向性的SPECT和CT造影剂用于SPECT/CT靶向双模态成像,具有很好的使用价值。
附图说明
图1为本发明中制备方法的示意图;
图2为实施例1中中间产物的1H NMR,其中a为G2-DTPA,b为FA-PEG-COOH,c为G2-DTPA-PEG-FA,d为G2-DTPA-mPEG;
图3为实施例1中G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒在25℃、pH=7.0的UV-Vis谱图;
图4为实施例2中G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒在不同温度(a)和不同pH条件(b)下的UV-Vis谱图;
图5为实施例1中G2-DTPA-PEG-FA@Au和G2-DTPA-mPEG@Au颗粒的形貌和尺寸,TEM图(a,b)和粒径分布图(c,d);
图6为实施例3中G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒和G2-DTPA-mPEG@Au的细胞毒性试验结果;
图7为实施例4中G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒与碘海醇的体外X-射线衰减系数比较,图7a为CT成像图片,图7b为测得的X-射线衰减强度结果,(1G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒,2碘海醇);
图8为实施例5中G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒分别与FA受体高、低表达的HeLa细胞以及G2-DTPA-mPEG@Au颗粒与FA受体高表达的HeLa细胞共培养3h后,细胞中的金的吞噬量;
图9为实施例6中G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒分别与FA受体高、低表达的HeLa细胞以及G2-DTPA-mPEG@Au颗粒与FA受体高表达的HeLa细胞共培养3h后处理的细胞悬浮液,通过CT成像仪扫描测得的CT图像(图9a,1G2-DTPA-PEG-FA@Au与FA受体高表达细胞;2G2-DTPA-PEG-FA@Au与FA受体低表达细胞;3G2-DTPA-mPEG@Au与FA受体高表达细胞)和对应的CT值(图9b);
图10为实施例7中G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc颗粒分别与FA受体高、低表达的HeLa细胞以及G2-DTPA-mPEG@Au颗粒与FA受体高表达的HeLa细胞共培养3h后处理的细胞悬浮液,通过SPECT成像仪扫描测得的SPECT图像(图10a,1G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc与FA受体高表达细胞;2G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc与FA受体低表达细胞;3G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc与FA受体高表达细胞)和对应的SPECT值(图10b);
图11为实施例8中100μL相同锝放射性浓度和相同金浓度([99mTc]=370MBq/mL,[Au]=0.08M)的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc和G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc通过静脉注射进小鼠体内,通过SPECT/CT成像仪扫描检测得到小鼠肿瘤的SPECT/CT图片(图11a SPECT成像图片;b CT成像图片;c SPECT/CT成像图片;1G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc;2G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc,),从左至右依次为注射后30min,120min,180min,白色圆圈内所指的为小鼠肿瘤;
图12为实施例8中100μL相同锝放射性浓度和相同金浓度([99mTc]=370MBq/mL,[Au]=0.08M)的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc和G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc通过静脉注射进小鼠体内,通过SPECT/CT成像仪扫描检测得到小鼠肿瘤处的信号强度(图12a SPECT成像信号强度值,图12b CT成像信号强度值);
图13为实施例9中G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc与对比例1中材料G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc通过尾静脉注射180min后的体内组织分布情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
制备G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc的具体过程如图1所示。(1)将20.0mg第二代聚酰胺胺树状大分子(G2.NH2)溶解在3.0mL水中,并逐滴加入3.0mL二乙三胺五乙酸环酸酐(cDTPAA)的水溶液(2.2mg/mL),在室温下搅拌反应8h,对反应液进行透析,蒸馏水(9次,2L/次),透析3天。然后冷冻干燥得到G2-DTPA。1HNMR测试结果表明:谱图中出现在2.2-3.2ppm和3.4-3.5ppm的化学位移峰分别对应为树状大分子和DTPA的特征峰。由积分面积计算可得,每个树状大分子表面修饰了约2.7个DTPA(图2a)。
(2)将55.2mg叶酸(FA)溶于7mL二甲基亚砜中,并加入3mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的二甲基亚砜溶液(6.4mg/mL)混合搅拌反应0.5h,再加入2mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的二甲基亚砜溶液(5.8mg/mL)继续混合搅拌反应3h,再逐滴加入15mL聚乙二醇(Mw=2000,NH2-PEG-COOH,6.7mg/mL)的二甲基亚砜溶液搅拌反应72h。对反应液进行透析,蒸馏水(9次,2L/次),透析3天。然后冷冻干燥得到FA修饰的聚乙二醇(FA-PEG-COOH)。1HNMR测试结果表明:谱图中出现在3.6ppm和6.5-8.6ppm的化学位移峰分别对应为聚乙二醇和FA的特征峰。由积分面积计算可得,每个聚乙二醇表面修饰了约0.7个FA(图2b)。
(3)将(2)所得产品50mg溶于5mL水中,边搅拌边加入1mLEDC水溶液(3.9mg/mL)活化3h后,滴加入2mL(1)所得产品的水溶液(2.7mg/mL),室温条件下搅拌反应72h。反应结束后,对所得溶液进行透析,蒸馏水(9次,2L/次),透析3天。然后冷冻干燥,得到修饰了DTPA和FA-聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-PEG-FA。1HNMR测试结果表明:谱图中出现在1.8-2.7ppm和3.3-3.4ppm的化学位移峰分别对应为树状大分子(G2.NH2)和DTPA的特征峰,G2-DTPA-PEG-FA颗粒在3.6ppm处有PEG的特征吸收峰,FA的三个特征吸收峰出现在6.5-8.6ppm之间。由积分面积计算可得,每个树状大分子表面修饰了约6.5个FA-聚乙二醇(图2c)。
(4)将(3)所得产品26mg溶于26mL超纯水中,边搅拌边加入氯金酸水溶液312.14μL(10mg/mL),磁力搅拌0.5h后,加入冰浴预处理的硼氢化钠水溶液75.78mL(19mg/mL),室温反应3h。反应结束后,对所得溶液进行透析,蒸馏水(9次,2L/次),透析3天。然后进行冷冻干燥处理,得到包裹金纳米颗粒的修饰了DTPA和FA-聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-PEG-FA@Au。UV-Vis测试结果表明:谱图中在282nm处存在一个FA的特征吸收峰,另外由于包金量少且金纳米颗粒尺寸小(<2nm)使得其在510nm的表面等离子体共振(SPR)峰不明显,但由于包裹了金纳米颗粒后使得其在500-800nm之间的吸收值远大于G2-DTPA-PEG-FA颗粒(图3),这表明体系中成功修饰了靶向分子FA和包裹了金纳米颗粒。TEM测试结果表明:制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布较窄,具有良好的水分散性(图5a、5c),平均粒径约1.6nm(图5b、5d)。
(5)将(4)所得产品28mg溶解在0.10mL无菌放射性高鍀酸盐(放射性99mTc浓度为740MBq/mL)溶液,加入100μg SnCl2,振荡混合,并用凝胶过滤柱分离纯化,其标记率为70%,放化纯大于99%,得到包裹金纳米粒子和螯合核素99mTc的SPECT/CT双模态成像造影剂G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc。
实施例2
取实施例1中(4)所得产品的水溶液(0.4mg/mL),置于不同温度下半小时后,测定其紫外图谱,确定产品在不同温度下的稳定性。结果表明:在不同温度(4-50℃)条件下,实施例1中(4)所得产品的紫外图谱没有发生明显的偏移和改变,表明其具有良好的稳定性(图4a)。取实施例1中(4)所得产品的水溶液(0.4mg/mL),以0.1M的盐酸或氢氧化钠调节其pH值(5.0、6.0、7.0、8.0)。室温放置20min后,测定其紫外图谱,确定产品在不同pH值(5.0-8.0)下的稳定性。结果表明:在不同pH(5.0-8.0)条件下,实施例1中(4)所得产品的紫外图谱没有发生明显的偏移和改变,表明其具有良好的稳定性(图4b)。
实施例3
取实施例1中(4)所得产品用无菌PBS缓冲液配置成40000nM的母液。之后稀释为10000nM的样品溶液。另以同样方案准备不含靶向分子FA的对比例1中(2)所得G2-DTPA-mPEG@Au的样品溶液。取培养好的HeLa胞种于96孔板中,按照1万细胞/孔的密度接种,每孔体积200μL。培养过夜后,加入上述各稀释梯度的样品,与细胞共培养24h。每个梯度用培养液稀释10倍,即每孔终浓度分别为4000、2000、1000、500、200nM。每个梯度做5个平行孔,以PBS缓冲液作为空白对照。随后用MTT法检测细胞活力。每孔加MTT溶液(20μL,5mg/mL),37℃孵化4h。之后除去孔中液体,加入二甲基亚砜200μL。摇床混匀20min,之后用酶标仪检测570nm处吸光度值。MTT测试结果表明,G2-DTPA-PEG-FA@Au和G2-DTPA-mPEG@Au颗粒在此范围内都不显示出细胞毒性,表现出良好的细胞相容性(图6)。
实施例4
取实施例1中(4)所得产品以蒸馏水为溶剂,配制金浓度为0.04M的母液。之后梯度稀释出0.02、0.01和0.005M的样品。同时,以临床用碘海醇为对照材料加蒸馏水稀释出相应碘浓度的样品,并对两组材料分别进行CT成像测试。测试结果显示:在试验浓度范围内,G2-DTPA-PEG-FA@Au颗粒表现出优于碘海醇的X-射线衰减系数(图7)。
实施例5
取实施例1中(4)所得产品用无菌PBS缓冲液配制成浓度为40000nM的母液,之后稀释为10000nM的样品溶液。取培养好的HeLa细胞种于24孔板中,按照20万细胞/孔的密度接种,每孔体积为1mL。培养过夜后,一组HeLa细胞加入2mM FA共培养2h定义为FA受体低表达的HeLa细胞,另一组HeLa细胞没有加FA共培养定义为FA受体高表达的HeLa细胞。接着,加入上述稀释10倍后的样品(4000nM和1000nM)分别与FA受体高、低表达的HeLa细胞在37℃下共培养3小时。对比例1中(2)所得G2-DTPA-mPEG@Au也用无菌PBS缓冲液配制成浓度为4000和1000nM分别与FA受体高表达的HeLa细胞在37℃下共培养3小时。以PBS缓冲液作为空白对照。培养结束后用PBS清洗3次,再胰酶消化离心后收集细胞,加入2mL王水消化24h,然后通过ICP-OES检测细胞中Au元素的吞噬量(图8)。如图8所示,在研究浓度范围内,G2-DTPA-PEG-FA@Au培养的FA受体高表达(未FA阻断)的HeLa细胞对金的吞噬量明显高于低FA受体表达(被FA阻断)的HeLa细胞和G2-DTPA-mPEG@Au培养的FA受体高表达的HeLa细胞的吞噬量。结果表明,靶向分子FA的修饰使得G2-DTPA-PEG-FA@Au对FA受体高表达的HeLa细胞有特异靶向能力。
实施例6
取实施例1中(4)所得产品用无菌PBS缓冲液配制成浓度为40000nM的母液,之后稀释为10000nM的样品溶液。取培养好的HeLa细胞种于6孔板中,按照200万细胞/孔的密度接种,每孔体积为2mL。培养过夜后,加入上述稀释10倍后的样品(4000nM和1000nM)分别与FA受体高、低表达的HeLa细胞在37℃下共培养3小时。对比例1中(2)所得G2-DTPA-mPEG@Au也用无菌PBS缓冲液配制成浓度为4000和1000nM分别与FA受体高表达的HeLa细胞在37℃下共培养3小时。以PBS缓冲液作为空白对照。胰酶消化离心后收集细胞,并将细胞均匀的分散在200μLPBS缓冲液中。之后,对这三组样品进行CT成像测试(图9a和图9b)。
如图9所示,在研究浓度范围内,G2-DTPA-PEG-FA@Au培养的FA受体高表达的HeLa细胞的CT值明显高于低FA受体表达的HeLa细胞和G2-DTPA-mPEG@Au培养的FA受体高表达的HeLa细胞。证明了靶向分子FA的修饰使得G2-DTPA-PEG-FA@Au对FA受体高表达的HeLa细胞有特异靶向能力。
实施例7
用SPECT/CT成像仪研究所制备的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc和G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc的细胞成像效果。取实施例1中(5)所得的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc用无菌PBS缓冲液配制成500和100μCi的样品溶液。另以同样方案准备不含FA靶向分子的对比例1中(3)所得G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc的样品溶液。取培养好的HeLa细胞种于6孔板中,按照200万细胞/孔的密度接种,每孔体积为2mL。培养过夜后,加入上述两种材料(500和100μCi)分别与FA受体高、低表达的HeLa细胞在37℃下共培养3小时。对比例1中(3)所得G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc也用无菌PBS缓冲液配制成浓度为500和100μCi的样品溶液分别与FA受体高表达的HeLa细胞在37℃下共培养3小时。胰酶消化离心后收集细胞,并将细胞均匀的分散在200μLPBS缓冲液中。之后,对这三组样品进行SPECT成像测试(图10a,图10b)。
如图10所示,在研究浓度范围内,G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc培养的FA受体高表达的HeLa细胞的SPECT成像效果明显高于低FA受体表达的HeLa细胞和G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc培养的FA受体高表达的HeLa细胞。证明了靶向分子FA的修饰使得G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc对FA受体高表达的HeLa细胞具有更好的SPECT成像效果。
实施例8
用SPECT/CT成像仪研究所制备的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc和G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc在小鼠体内的成像效果。将实施例1中(5)得到的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc和对比例1中(3)得到的G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc,以相同的锝放射性浓度和金浓度([99mTc]=740mBq/mL,[Au]=0.08M)各取100μL,通过尾部静脉注射进体重为22g的小鼠体内,并于用药后30min,120min,180min再分别通过SPECT/CT扫描得到小鼠肿瘤部位的SPECT、CT和SPECT/CT图片。通过SPECT/CT小动物成像仪扫描检测得到的SPECT/CT图片和信号强度值(图11和图12)。从图中可以看出G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc材料可以实现小鼠肿瘤部位的特异性成像,其亮度明显高于肝脏等其他主要器官,并同时可以看到肝脏,肾脏,脾脏的信号增强,而且在120min是达到最佳的成像效果,成像时间也可持续至少180min,并逐渐代谢信号减弱。证明本方法合成的G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc具有较好的SPECT/CT双模态成像效果。
实施例9
实施例8中荷瘤裸鼠的SPECT/CT扫描结束后,立即将其处死,取肿瘤和各主要器官(心、肝、脾、肺、肾)称重,以注射碘海醇的荷瘤裸鼠作为空白对照。将取好的器官浸泡于王水中48h。随后过滤、稀释,进行ICP-OES测试(附图13)。ICP-OES结果显示尾静脉注射180min后,除了肾脏以外,纳米颗粒主要富集于脾脏和肝脏等内皮网状系统。这说明,G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc颗粒主要通过内皮网状系统代谢。而相对于对比例1中材料G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc,靶向材料在肿瘤处富集量更多,证明了本材料的特异性靶向作用。
对比例1
制备G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc得过程如图1所示。具体如下:
(1)将实施例1中(1)所得产品40mg溶于5mL超纯水中,边搅拌边加入28.76mg EDC活化3h后,再滴加入5mL聚乙二醇(Mw=2000,mPEG-COOH,5.7mg/mL)的二甲基亚砜溶液,室温条件下搅拌反应72h,透析,冷冻干燥,得到修饰了聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-mPEG。1HNMR测试结果表明:谱图中出现在2.5-3.3ppm和3.4-3.5ppm的化学位移峰分别对应为树状大分子(G2.NH2)和DTPA的特征峰,3.6ppm处有PEG的特征吸收峰。由积分面积计算可得,每个树状大分子表面修饰了约6.5个聚乙二醇分子(图2d)。
(2)将(1)所得产品22mg溶于22mL超纯水中,边搅拌边加入氯金酸水溶液296.62μL(10mg/mL),磁力搅拌30min后,加入冰浴预处理的硼氢化钠溶液72.02mL(19mg/mL),室温反应3h。反应结束后,对所得溶液进行透析,蒸馏水(9次,2L/次),透析3天。然后进行冷冻干燥处理,得到包裹金纳米颗粒的修饰了聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-mPEG@Au。TEM测试结果表明:制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布较窄,具有良好的水分散性,平均粒径约1.3nm(图5b)。
(3)将(2)所得产品25mg溶解在100μL无菌放射性高鍀酸盐(放射性99mTc浓度为740mBq/mL)溶液,加入100μg SnCl2,振荡混合,并用凝胶过滤柱分离纯化,其标记率为70%,放化纯大于99%,得到包裹金纳米粒子螯合核素99mTc的SPECT/CT双模态成像造影剂G2-DTPA-mPEG@Au-99mTc。
Claims (13)
1.一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,包括:
(1)将第二代聚酰胺胺树状大分子G2.NH2溶解在水中,加入二乙三胺五乙酸环酸酐cDTPAA水溶液,室温搅拌8~12h,得到G2-DTPA;其中,G2.NH2和cDTPAA的摩尔比为1:3-5;
(2)将叶酸-聚乙二醇FA-PEG-COOH溶解在水中,然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC活化,然后滴加入步骤(1)中的G2-DTPA溶液中,室温条件下搅拌反应72-80h,透析,冷冻干燥,得到修饰了二乙基三胺五乙酸和叶酸-聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-PEG-FA;其中,FA-PEG-COOH与G2-DTPA的摩尔比为10-15:1;
(3)将步骤(2)中的G2-DTPA-PEG-FA溶解在水中,加入氯金酸水溶液,在室温条件下搅拌,然后加入硼氢化钠水溶液,冰水中搅拌反应2-3h,透析,冷冻干燥,得到包裹金纳米颗粒的修饰了二乙基三胺五乙酸和叶酸-聚乙二醇的树状大分子G2-DTPA-PEG-FA@Au;其中,氯金酸与G2-DTPA-PEG-FA的摩尔比为6-9:1;
(4)将步骤(3)中G2-DTPA-PEG-FA@Au溶解在放射性高锝酸盐溶液中,加入氯化亚锡,经柱层析分析,即得包裹金纳米颗粒和螯合核素99mTc的具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc。
2.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中FA-PEG-COOH溶解在水中的浓度为4-6mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中FA-PEG-COOH中FA与聚乙二醇的摩尔比为2-3:1。
4.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中FA-PEG-COOH与EDC的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中活化的时间为4-6h。
6.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中G2-DTPA溶液浓度为2-3mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中透析为用透析膜先在PBS缓冲液中透析20-30h,然后再在蒸馏水透析40-60h,所用透析膜为纤维素透析膜MWCO=3000。
8.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中G2-DTPA-PEG-FA溶解在水中的浓度为1-2mg/mL;氯金酸水溶液的浓度为10-20mg/mL;硼氢化钠水溶液的浓度为10-15mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中搅拌的时间为10-20min。
10.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为5-8:1。
11.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中透析为用透析膜在蒸馏水透析60-80h,所用透析膜为纤维素透析膜MWCO=2000。
12.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中G2-DTPA-PEG-FA@Au的质量,放射性高锝酸盐溶液的放射量和氯化亚锡质量的比例为28mg:37-74mBq:100-150μg。
13.根据权利要求1所述的一种具有FA靶向功能的基于低代树状大分子的SPECT/CT双模态成像造影剂的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中G2-DTPA-PEG-FA@Au-99mTc用凝胶过滤柱分离纯化,99mTc的标记率为70%,放化纯大于99%。
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