CN110128666B - 功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料及其制备方法，制备方法包括将mPEG‑COOH中加入EDC、超支化聚乙烯亚胺溶液，反应得PEI.NH2‑(mPEG)，然后加入MAL‑PEG‑SVA溶液，反应得到PEI.NH2‑(PEG‑MAL)‑(mPEG)，之后依次加入螯合剂DTA、荧光标记物FI，随后加入氯金酸、NaBH4，得到{(Au0)200‑PEI.NH2‑FI‑DTA‑(PEG‑MAL)‑(mPEG)}PENPs，之后加入APAS，随后进行乙酰化得到{(Au0)200‑PEI.NHAc‑FI‑DTA‑(PEG‑APAS)‑(mPEG)}PENPs，最后将放射性核素99mTc标记到螯合剂DTA上，即得。本发明制备的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒可提高癌细胞对其摄取量，作为良好的SPECT/CT成像纳米造影剂，在肿瘤多模态成像方面具有潜在应用价值。

Description

功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料及其制备方法
技术领域
本发明属于功能化聚乙烯亚胺材料的制备领域，特别涉及一种pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料及其制备方法。
背景技术
目前癌症已经成为威胁人类健康的头号杀手，由于外界致癌因素的影响，机体在基因层面上发生突变，局部组织细胞失去对其正常生长的调控，从而导致局部增生产生瘤体。再加上恶性肿瘤具有局部浸润性及远端转移特性，导致其治愈难度加大。因此，在癌症初期及时诊断并加以治疗可极大降低癌症死亡率、提高患者生存质量。分子影像学技术的发展为癌症的早期诊断提供了可能，其可在组织、细胞、分子层面上显示活体变化情况，可对活体生物学、生理学等行为进行定性及定量研究。常见的分子影像学技术包括：电子计算机断层扫描(Computed Tomography，CT)、磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MR)、单光子发射计算机断层成像(Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT)、正电子发射计算机断层显像(Positron Emission Tomography，PET)和超声成像(Ultrasound，US)等。然而单一成像技术均存在无法避免的缺陷，如CT成像具有较高的空间分辨率，对密度高的组织显像清晰，但其灵敏度较低；SPECT成像可在分子层面上显示组织病变的发生、发展、恶化程度，通过生物化学显示的方法检查组织病理，具有较高的灵敏度，可通过监测病情从而指导治疗，但其成像分辨率较低。因此，可结合单模态CT成像和SPECT成像技术，通过优势互补以实现癌症的早期精准诊断。目前随着纳米技术的发展，许多基于纳米颗粒的SPECT/CT双模态成像造影剂已被开发出，可在微观层面上进行显像，但普遍存在的问题是纳米造影剂在肿瘤部位的富集度仍然较低，限制了成像效果的发挥，为达到更为精确的显像效果，需要注射大量的材料。因此，构建功能化的纳米体系以实现癌细胞的高量摄取，提高其在肿瘤部位的富集度，才能实现更为精准、高效的癌症早期诊断。
两性离子作为可提高癌细胞摄取的功能分子，近年来受到普遍关注。基于其pH依赖性的电荷转换机制，在体内循环传输及正常组织脏器(pH7.2-7.4)中，被两性离子功能化的纳米材料为电中性，能够有效避免正常组织脏器的粘附；在肿瘤酸性微环境(pH 5.5-6.8)中，被两性离子功能化的纳米材料结合质子从而表现为正电性，实现癌细胞对其高量摄取。这种电荷翻转机制具有选择性，仅在呈现微酸性的肿瘤组织处发生结合，因此可实现被两性离子功能化的纳米材料在肿瘤部位的特异性高量摄取。目前已研究的4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS)在肿瘤微酸性环境下具有较强的敏感性，能实现电荷的有效翻转，例如Rotello,V.M.等(Mizuhara,T.K.；Saha,K.；Rotello,V.M.et al.Angewandte Chemie,International Edition.2015,54,6567)将APAS修饰于1.6nm的金纳米颗粒表面，构建的纳米复合物能够实现人类宫颈癌细胞HeLa细胞的高量摄取。
超支化聚乙烯亚胺(PEI.NH2)作为一种性质优良的高分子聚合物，其表面具有众多氨基可进行功能化修饰，支链结构使其内部形成一定体积的疏水空腔可用于负载金属纳米颗粒、分子药物等；此外，其具有良好的水溶性及生物相容性使其能够稳定有机小分子及无机纳米颗粒。因此，根据聚乙烯亚胺的优良理化性质，可作为高分子载体平台构建功能化的多模态分子探针，将金纳米颗粒包裹在聚乙烯亚胺内部空腔中，放射性核素99mTc通过螯合剂标记在功能化聚乙烯亚胺表面，通过在聚乙烯亚胺表面修饰pH敏感两性离子APAS以实现癌细胞对功能化纳米材料的高量摄取，以构建精准、高效的肿瘤SPECT/CT双模态纳米造影剂。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明提供一种功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料及其制备方法，本发明的制备过程简单，易于操作，所使用的制备方法可用于多种类型功能化聚乙烯亚胺的制备，如：可适用于超支化聚乙烯亚胺的载药体系或基因递送体系，根据超支化聚乙烯亚胺的结构特征，表面具有众多氨基可进行本发明采用的技术进行甲氧基-聚乙二醇-羧基、马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯、螯合剂、异硫氰酸荧光素及4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐的功能修饰，又由于超支化聚乙烯亚胺内部形成的空腔包裹纳米金颗粒、负载药物或特定基因实现药物及基因的递送，以组装为成像监控的肿瘤治疗复合体系，具有良好的使用价值。所制备的复合材料可作为纳米造影剂，有望用于体内精准、高效的SPECT/CT成像，具有良好的诊断应用前景，为新型纳米造影剂的开发提供基础。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入到甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)溶液中活化，然后加入到超支化聚乙烯亚胺(PEI.NH2)溶液中，搅拌反应2～4天，得到PEI.NH2-(mPEG)；
(2)将所述PEI.NH2-(mPEG)溶液加入马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯(MAL-PEG-SVA)溶液，搅拌反应2～4天，得到PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)；
(3)将所述PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)溶液中加入螯合剂(DTA)，搅拌，得到PEI.NH2-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)；
(4)向所述PEI.NH2-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)溶液中加入异硫氰酸荧光素(FI)，搅拌，得到PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)；
(5)向所述PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)溶液中缓慢滴加入氯金酸溶液，搅拌反应20～40min，随后加入还原剂溶液搅拌反应2～3h，即得包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺({(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs)；
(6)将所述包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺的溶液中加入4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)溶液，搅拌反应2～4天，再加入三乙胺(N(C2H5)3)和乙酸酐(Ac2O)进行乙酰化，经透析、冷冻干燥，得到{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs；
(7)将所述的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs和SnCl2溶解于缓冲液中，加入99mTc标记的高锝酸盐，经孵化20～40min、分离纯化，得到所述功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料。
所述的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒为pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒。步骤(6)所述的4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)由如下方法制得：
(0-1)将三苯甲硫醇和11-溴代十一烷醇加入了NaOH水溶液的乙醇-苯混合溶剂中，搅拌反应8～12h，纯化得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇；
(0-2)将所述1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇溶于二氯甲烷中，控温4℃～10℃加入三乙胺、甲磺酰氯搅拌反应，纯化得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯；
(0-3)将NaOH的水溶液和四甘醇(TEG)在80～100℃混合搅拌1～2h，再加入所述1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯，在80～100℃搅拌反应18～30h，后经纯化得到1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇；
(0-4)将所述1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇溶于二氯甲烷中，控温4～10℃加入三乙胺、甲磺酰氯搅拌反应，纯化得到化合物I(1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-甲磺酸酯)；
(0-5)向化合物I的溶液中，加入4-羟基苯磺酰胺、乙醇钠、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺，搅拌反应18～24h后，纯化得到化合物II(4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰胺)；
(0-6)将丁基甜菜碱盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和化合物II中，搅拌反应18～24h，经过纯化得到所述4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)。
步骤(0-1)至(0-6)的反应过程如下：
Figure BDA0002073317220000041
所述步骤(0-1)中乙醇-苯混合溶剂的体积比为1:1。
所述步骤(0-1)中三苯甲硫醇与11-溴代十一烷醇的摩尔比为1:1。
步骤(0-1)中所述纯化包括如下步骤：先用NaHCO3溶液再用NaCl溶液作为萃取溶剂进行萃取，获得有机相，之后采用Na2SO4干燥，然后浓缩，最后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化过程以体积比4:1的己烷-乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂。
所述步骤(0-2)中甲磺酰氯与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇的摩尔比为1.5～2:1，三乙胺与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇的摩尔比为1.5～2:1。
步骤(0-2)中所述纯化包括如下步骤：首先蒸除溶剂二氯甲烷，再将获得的物质重新溶于二氯甲烷并加入0.1M的盐酸溶液，依次用NaHCO3溶液、NaCl溶液萃取获得有机相，之后采用Na2SO4干燥，然后浓缩，最后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化过程以体积比1:1的己烷-乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂。
所述步骤(0-3)中NaOH与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯的摩尔比为1:1，四甘醇与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯的摩尔比为15:1。
步骤(0-3)中所述纯化包括如下步骤：以体积比4:1的己烷-乙酸乙酯混合溶液作为溶剂进行萃取获得有机相，之后浓缩，最后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化过程以体积比1:1的己烷-乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂。
所述步骤(0-4)中三乙胺与1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇的摩尔比为3:1，甲磺酰氯与1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇的摩尔比为1.5:1。
步骤(0-4)中所述纯化包括如下步骤：首先蒸除溶剂二氯甲烷，再将获得的物质重新溶于二氯甲烷并加入0.1M的盐酸溶液，萃取获得有机相，之后采用Na2SO4干燥，然后浓缩，最后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化过程以体积比1:4的己烷-乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂。
所述步骤(0-5)中4-羟基苯磺酰胺与化合物I的摩尔比为3:1，4-羟基苯磺酰胺与乙醇钠的摩尔比为1:1。
步骤(0-5)中所述纯化包括如下步骤：首先加入乙酸乙酯萃取，获得有机相，之后先用NaHCO3洗，再用水洗，经硫酸镁干燥后过滤、浓缩，最后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化过程以体积比1:1的己烷-乙酸乙酯混合溶液作为洗脱剂。
所述步骤(0-6)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和丁基甜菜碱盐酸盐的摩尔比为1.5～2:1，丁基甜菜碱盐酸盐和化合物II的摩尔比为2:1。
步骤(0-6)中所述纯化包括如下步骤：首先加入乙酸乙酯进行萃取，之后采用0.1M的盐酸洗涤，采用硫酸镁干燥、浓缩后，将残余物溶于体积比为1:1的正己烷-乙醚混合溶液中，重结晶析出固体，再经体积比为1:1的正己烷-乙醚混合溶液洗涤固体若干次，将剩余物溶解于二氯甲烷中并加入三氟乙酸和三异丙基硅烷，经室温搅拌、浓缩，剩余物悬浮于正己烷中并超声处理，最终经离心，除去上清液，再用正己烷洗涤若干次。
步骤(1)中甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)和超支化聚乙烯亚胺(PEI.NH2)的摩尔比为15:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)的摩尔比为15:1。
步骤(1)所述的活化的时间为2～3h。
步骤(2)中马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯(MAL-PEG-SVA)和PEI.NH2-(mPEG)的摩尔比为15:1。
步骤(3)中所述的螯合剂为二乙基三胺五乙酸、二亚乙基三胺五乙酸二酐或2,2',2”-(10-(2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三)三乙酸。最优选的螯合剂为二乙基三胺五乙酸(DTPA)。
步骤(3)中螯合剂和PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为12:1。
步骤(4)中异硫氰酸荧光素(FI)和PEI.NH2-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为7:1。
步骤(5)中所述的还原剂为硼氢化钠。
步骤(5)中氯金酸和PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为200:1。
步骤(6)中4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐和包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺的摩尔比为10:1，三乙胺、乙酸酐和包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺的摩尔比为120～660:100～550:1。
步骤(7)中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
步骤(7)中所述缓冲液的pH值为7.4。
步骤(7)中所述的99mTc标记的高锝酸盐的放射性剂量为740MBq。
步骤(7)所述的分离纯化为：用PD-10脱盐层析柱分离纯化，以pH＝7.2～7.4的PBS为流动相。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料。
本发明中使用甲氧基-聚乙二醇-羧基可以增强该纳米体系的生物相容性及体内循环时间，使其在包裹200摩尔当量的金纳米颗粒在功能化聚乙烯亚胺内部仍然具有较强的稳定性。
本发明中的DTA作为螯合剂用于标记放射性核素99mTc，赋予该纳米造影剂SPECT成像功能；FI作为荧光标记物，修饰在功能化聚乙烯亚胺表面可在体外起到荧光示踪的作用。
本发明中包裹纳米金颗粒在功能化聚乙烯亚胺内部，通过加入氯金酸溶液，搅拌30min，使其与聚乙烯亚胺内部仲胺及叔胺络合，再利用还原剂NaBH4通过原位还原使金纳米颗粒被稳定的包裹在功能化聚乙烯亚胺内部。由于金纳米颗粒的存在赋予该纳米体系CT成像功能。
本发明中的pH敏感两性离子APAS-SH，可通过与马来酰亚胺基共价结合从而修饰在{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs表面，得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs在微酸性环境下通过电荷翻转从而实现癌细胞对其高量摄取。
本发明中将聚乙烯亚胺表面剩余氨基乙酰化以排除表面氨基对其表面电势的影响，提高材料的生物相容性。三乙胺用于维持碱性环境使乙酰化反应顺利进行。
本发明中将{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs、还原剂SnCl2和99mTc标记的高锝酸盐在缓冲液中充分混合，使99mTc标记于DTA上，未标记上的99mTc经PD-10脱盐层析柱分离，收集得到纯99mTc标记的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒APAS-99mTc-Au PENPs。
本发明制备的pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒，其具有良好的生物相容性、X-射线衰减性能和pH响应电荷翻转性能，体外细胞实验证明其在微酸性环境下可增强癌细胞对其的摄取量。在标记放射性核素99mTc后，其具有良好的放射性稳定性，可作为性质优良的SPECT/CT纳米造影剂实现癌细胞对其的高量摄取，具有精准、高效肿瘤SPECT/CT成像应用的潜力。
以表面具有大量氨基，内部具有支化空腔结构的超支化聚乙烯亚胺为模板和稳定剂，制备了pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒，本发明涉及了三个基本原理：
(1)本发明采用取代反应和缩合反应制备了pH敏感两性离子APAS-SH，之后利用PEI表面众多氨基进行功能化修饰，在其表面修饰生物相容性分子PEG、螯合剂DTA、荧光素FI和两性离子APAS-SH，可制备得到功能化的聚乙烯亚胺载体。
(2)以MAL-PEG-SVA作为中介，将APAS-SH与表面修饰有MAL-PEG-SVA的功能化聚乙烯亚胺化学键合，以间接修饰APAS-SH在功能化聚乙烯亚胺表面，同时也可提高纳米材料的生物相容性及体内循环时间。
(3)以DTA为螯合剂，首先将其修饰在功能化聚乙烯亚胺上，待包裹金纳米颗粒在功能化聚乙烯亚胺内部之后将99mTc标记在DTA上构建99mTc标记的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒，将进行CT成像的金纳米颗粒和进行SPECT成像的99mTc负载在同一纳米体系中。
制备这种pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的关键要素就是找到一个合适的载体平台以装载各功能试剂，构建多功能纳米复合材料。本发明首先通过取代反应和缩合反应制备得到pH敏感两性离子APAS-SH；然后利用超支化聚乙烯亚胺精准的结构及特征，将不同端基的PEG(mPEG-COOH，MAL-PEG-SVA)、螯合剂DTA、荧光素FI修饰在其表面，通过硼氢化钠原位还原的方法包裹纳米金颗粒在功能化聚乙烯亚胺内部，再将制备得到的pH敏感两性离子APAS-SH通过MAL-PEG-SVA修饰在功能化聚乙烯亚胺表面，可提高癌细胞对该纳米复合材料的摄取，之后再将功能化聚乙烯亚胺表面剩余氨基乙酰化以排除表面氨基对其表面电势的影响，得到多功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒平台，最后在该载体平台上通过DTA标记99mTc，构建SPECT/CT双模态造影剂。本发明的有益效果在于：
(1)本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备方法可用于多种功能化聚乙烯亚胺的制备，具有很好的使用价值；
(2)本发明所制备的材料有望用于体内肿瘤SPECT/CT诊断，具有良好的癌症早期诊断应用前景；
(3)本发明制备得到的pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒具有良好的pH响应电荷翻转性能，可实现癌细胞对其高量摄取，为新型纳米造影剂的开发打下了良好的基础。
附图说明
图1为本发明所述制备方法的反应流程示意图。
图2为实施例1制备得到的(a)1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇，(b)1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯，(c)1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇，(d)1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-甲磺酸酯的氢核磁共振谱图。
图3为实施例1制备得到的(a)4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰胺，(b)4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)的氢核磁共振谱图。
图4为实施例1制备得到的4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)的质谱图。
图5为实施例1制备得到的(a)PEI.NH2-(mPEG)，(b)PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)，(c)PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)，(d){(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs，(e){(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的氢核磁共振谱图。
图6为实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的紫外吸收光谱图，插入的图片为{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs水溶液(0.5mg/mL)的外观图。
图7为实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的(a)TEM图片，(b)粒径分布直方图，(c)高分辨TEM图片，(d)选择区域的电子衍射图。
图8为经实施例1制备得到的不同金浓度的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs孵化HT1080细胞24h的MTT测试结果图。
图9为相差显微镜下经PBS(a)，实施例1制备得到的金浓度分别为5μM(b)、10μM(c)、20μM(d)、50μM(e)和100μM(f)的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs分别处理HT1080细胞24h的细胞形貌图。
图10为不同pH条件下实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs及{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs电势曲线图，材料通过溶解在不同pH值下的磷酸盐缓冲液进行测量。
图11为不同pH条件下，HT1080细胞分别经实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs和{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs孵化3h的细胞摄取图。
图12为欧乃派克(1)及实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs(2)的CT成像图(a)及其X-射线衰减强度图(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)用体积比为1:1的乙醇-苯混合溶剂(50mL)溶解三苯甲硫醇(5.0g，18.1mmol)，并加入9.5mL的NaOH溶液(0.9g，22.6mmol)，再加入溶于体积比为1:1的乙醇-苯混合溶液(50mL)中的11-溴代十一烷醇(4.5g，18mmol)。搅拌混合溶液12小时，之后将反应混合物加入到饱和NaHCO3溶液中萃取，洗涤2次，分离出有机相后将其转入到饱和NaCl溶液中萃取，洗涤2次，分离出的有机相用Na2SO4干燥后获得的溶液利用旋转蒸发仪浓缩获得粗产物，经硅胶柱层析纯化，以体积比为4:1的己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集到的产物再次经旋转蒸发仪浓缩得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇。
(2)用20mL的二氯甲烷(DCM)溶解1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇(5.5g，12.31mmol)，置于冰浴中控制温度为4℃，随后加入3.43mL三乙胺(2.5g，24.6mmol)，缓慢加入甲磺酰氯(2.12g，18.5mmol)控温4℃搅拌反应半小时，后移出冰浴，继续搅拌半小时，反应结束后蒸发除去溶剂DCM。所得的浓缩液体用5mL的DCM溶解并加入20mL的HCl溶液(0.1M)萃取，分离得到有机相加入饱和NaHCO3溶液洗涤2次，再次分离有机相加入饱和NaCl溶液洗涤2次，之后萃取分离的有机相用Na2SO4干燥，经旋转蒸发浓缩，所得产物用硅胶柱层析纯化，以体积比为1:1的己烷-乙酸乙酯为洗脱剂，纯化产物最后经旋转蒸发除去溶剂得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯。
(3)随后将NaOH水溶液(0.49g，12.3mmol，2mL)加入到40mL的四甘醇(TEG，35.8g，184.5mmol)中，100℃搅拌反应1h，再控温加入6.4g的1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯搅拌反应30h。之后用体积比4:1的己烷-乙酸乙酯进行萃取，萃取3次后，将分离得到的有机相通过旋转蒸发仪进行浓缩。浓缩产物经硅胶柱层析纯化，以体积比1:1的己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集到的产物经旋转蒸发浓缩，获得1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇。
(4)将1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇(4.3g，6.9mmol)溶于20mL的DCM中，置于冰浴中控温4℃，随后加入2.89mL三乙胺(2.1g，20.7mmol)，再将甲磺酰氯(1.5g，10.35mmol)逐滴滴加入上述溶液中，控温4℃搅拌反应半小时，后移出冰浴，置于室温中搅拌半小时，反应结束后蒸发除去溶剂DCM。所得的浓缩液体用5mL的DCM溶解并加入20mL的HCl溶液(0.1M)萃取，分离得到有机相加入饱和NaHCO3溶液洗涤2次，再次分离有机相加入饱和NaCl溶液洗涤2次，之后萃取分离的有机相用Na2SO4干燥，经旋转蒸发浓缩，所得产物用硅胶柱层析纯化，以体积比为1:4的己烷-乙酸乙酯为洗脱剂，纯化产物最后经旋转蒸发除去溶剂得到1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-甲磺酸酯(化合物I)。
(5)将4-羟基苯磺酰胺(249mg，1.44mmol)溶于含463μL乙醇钠(1.43mmol)的乙醇(3mL)中，加入到溶于5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的化合物I(300mg，0.48mmol)中。水浴加热在60℃搅拌反应24h，加入20mL乙酸乙酯，液体分层进行萃取。向混合物中分别加入NaHCO3和水洗涤，获得有机相加入MgSO4干燥，过滤除去固体MgSO4，将有机相通过旋转蒸发仪浓缩，收集到的液体经硅胶柱层析纯化，以体积比为1:1的己烷-乙酸乙酯的混合溶液为洗脱剂，收集获得化合物II(4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰胺)。
(6)将化合物II(500mg，0.65mmol)、丁基甜菜碱盐酸盐(1.3mmol)，4-二甲氨基吡啶(16mg，0.13mmol)和三乙胺(376μL，2.6mmol)溶于4mLDMF中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC，498mg，2.6mmol)搅拌24h。之后加入20mL乙酸乙酯，液体分层进行萃取。向混合物中加入0.1M浓度的HCl溶液洗涤，获得有机相加入MgSO4干燥，之后将有机相经旋转蒸发仪浓缩，将剩余物悬浮在体积比为1:1的己烷-乙醚混合溶液中并超声，固体析出。经离心分离，去除上层清液。用己烷-乙醚混合溶液洗涤2次，剩余物再经乙醚洗涤2次。将剩余物溶解在5mL二氯甲烷中并加入2mL三氟乙酸和0.5mL三异丙基硅烷，在室温搅拌10min后，所得混合物经旋转蒸发浓缩。剩余物悬浮于己烷中并超声处理。经离心，除去上清液。最后用己烷洗涤3次获得两性离子4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)。
(7)用5mL蒸馏水溶解120mg的mPEG-COOH(Mw＝2000)，边搅拌边加入溶于3mL蒸馏水中的EDC(172.5mg)，搅拌反应3h后，向该混合溶液中加入溶解有100mg超支化聚乙烯亚胺的蒸馏水(5mL)中，mPEG-COOH与聚乙烯亚胺的摩尔比为15:1，搅拌反应4天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到PEI.NH2-(mPEG)。
(8)用10mL蒸馏水溶解80mg的PEI.NH2-(mPEG)，边搅拌边加入溶于5mL蒸馏水的MAL-PEG-SVA溶液，搅拌反应4天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)，MAL-PEG-SVA和PEI.NH2-(mPEG)的摩尔比为15:1。
(9)用5mL蒸馏水溶解5.36mg的螯合剂DTPA，边搅拌边加入溶于10mL蒸馏水的PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)，DTPA和PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为12:1，搅拌反应1天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到的产物标记为PEI.NH2-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)。
(10)用10mL二甲基亚砜(DMSO)溶解100mg的PEI.NH2-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)，边搅拌边加入溶于2mLDMSO的荧光素FI，FI和PEI.NH2-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为7:1，搅拌反应1天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到的产物标记为PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)。
(11)用10mL蒸馏水溶解80mg的PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)，边搅拌边逐滴滴加氯金酸溶液(30mg/mL)，氯金酸和PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为200:1，搅拌40min后，加入21.6mg的溶于蒸馏水的NaBH4(2mL)，溶液变为酒红色，在室温下搅拌反应2h，得到的产物标记为{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs。
(12)向步骤(11)的产物溶液中再加入溶于3mL蒸馏水的APAS-SH，APAS-SH与{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的摩尔比为10:1，搅拌反应4天，之后再加入三乙胺，搅拌反应30min后，加入乙酸酐，三乙胺、乙酸酐和{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的摩尔比为660:550:1，在室温下搅拌反应24h，将所得溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到的产物标记为{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs。
(13)用3mL的磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解3mg的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs，并加入还原剂SnCl2(50-100μg)，随后将99mTc标记的高锝酸盐(1mL，740MBq)加入上述混合溶液中，孵化40min后分离纯化，即得99mTc标记的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒APAS-99mTc-Au PENPs，反应流程如图1所示。
实施例2
(1)用体积比为1:1的乙醇-苯混合溶剂溶解三苯甲硫醇(18.1mmol)，并加入NaOH溶液(22.6mmol)，再加入溶于体积比为1:1的乙醇-苯混合溶液中的11-溴代十一烷醇(18mmol)。搅拌混合溶液8小时，之后将反应混合物加入到饱和NaHCO3溶液中萃取，洗涤2次，分离出有机相后将其转入到饱和NaCl溶液中萃取，洗涤2次，分离出的有机相用Na2SO4干燥后获得的溶液利用旋转蒸发仪浓缩获得粗产物，经硅胶柱层析纯化，以体积比为4:1的己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集到的产物再次经旋转蒸发仪浓缩得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇。
(2)用二氯甲烷(DCM)溶解1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇(12.31mmol)，置于冰浴中控制温度为10℃，随后加入三乙胺(18.5mmol)，缓慢加入甲磺酰氯(24.6mmol)控温10℃搅拌反应半小时，后移出冰浴，继续搅拌半小时，反应结束后蒸发除去溶剂DCM。所得的浓缩液体用5mL的DCM溶解并加入20mL的HCl溶液(0.1M)萃取，分离得到有机相加入饱和NaHCO3溶液洗涤2次，再次分离有机相加入饱和NaCl溶液洗涤2次，之后萃取分离的有机相用Na2SO4干燥，经旋转蒸发浓缩，所得产物用硅胶柱层析纯化，以体积比为1:1的己烷-乙酸乙酯为洗脱剂，纯化产物最后经旋转蒸发除去溶剂得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯。
(3)随后将NaOH水溶液(12.3mmol)加入到40mL的四甘醇(184.5mmol)中，80℃搅拌反应2h，再控温加入12.3mmol的1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯搅拌反应18h。之后用体积比4:1的己烷-乙酸乙酯进行萃取，萃取3次后，将分离得到的有机相通过旋转蒸发仪进行浓缩。浓缩产物经硅胶柱层析纯化，以体积比1:1的己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，收集到的产物经旋转蒸发浓缩，获得1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇。
(4)将1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇(6.9mmol)溶于DCM中，置于冰浴中控温10℃，随后加入三乙胺(20.7mmol)，再将甲磺酰氯(10.35mmol)逐滴滴加入上述溶液中，控温10℃搅拌反应半小时，后移出冰浴，置于室温中搅拌半小时，反应结束后蒸发除去溶剂DCM。所得的浓缩液体用5mL的DCM溶解并加入20mL的HCl溶液(0.1M)萃取，分离得到有机相加入饱和NaHCO3溶液洗涤2次，再次分离有机相加入饱和NaCl溶液洗涤2次，之后萃取分离的有机相用Na2SO4干燥，经旋转蒸发浓缩，所得产物用硅胶柱层析纯化，以体积比为1:4的己烷-乙酸乙酯为洗脱剂，纯化产物最后经旋转蒸发除去溶剂得到1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-甲磺酸酯(化合物I)。
(5)将4-羟基苯磺酰胺(1.44mmol)溶于含乙醇钠(1.43mmol)的乙醇中，加入到溶于5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的化合物I(0.48mmol)中。水浴加热在60℃搅拌反应18h，加入20mL乙酸乙酯，液体分层进行萃取。向混合物中分别加入NaHCO3和水洗涤，获得有机相加入MgSO4干燥，过滤除去固体MgSO4，将有机相通过旋转蒸发仪浓缩，收集到的液体经硅胶柱层析纯化，以体积比为1:1的己烷-乙酸乙酯的混合溶液为洗脱剂，收集获得化合物II(4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰胺)。
(6)将化合物II(0.86mmol)、丁基甜菜碱盐酸盐(1.73mmol)，4-二甲氨基吡啶(0.13mmol)和三乙胺(2.6mmol)溶于DMF中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC，2.6mmol)搅拌18h。之后加入20mL乙酸乙酯，液体分层进行萃取。向混合物中加入0.1M浓度的HCl溶液洗涤，获得有机相加入MgSO4干燥，之后将有机相经旋转蒸发仪浓缩，将剩余物悬浮在体积比为1:1的己烷-乙醚混合溶液中并超声，固体析出。经离心分离，去除上层清液。用己烷-乙醚混合溶液洗涤2次，剩余物再经乙醚洗涤2次。将剩余物溶解在5mL二氯甲烷中并加入2mL三氟乙酸和0.5mL三异丙基硅烷，在室温搅拌10min后，所得混合物经旋转蒸发浓缩。剩余物悬浮于己烷中并超声处理。经离心，除去上清液。最后用己烷洗涤3次获得两性离子4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)。
(7)用5mL蒸馏水溶解120mg的mPEG-COOH(Mw＝2000)，边搅拌边加入溶于3mL蒸馏水中的EDC(172.5mg)，搅拌反应2h后，向该混合溶液中加入溶解有100mg超支化聚乙烯亚胺的蒸馏水(5mL)中，mPEG-COOH与聚乙烯亚胺的摩尔比为15:1，搅拌反应2天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到PEI.NH2-(mPEG)。
(8)用10mL蒸馏水溶解80mg的PEI.NH2-(mPEG)，边搅拌边加入溶于5mL蒸馏水的MAL-PEG-SVA溶液，搅拌反应2天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)，MAL-PEG-SVA和PEI.NH2-(mPEG)的摩尔比为15:1。
(9)用5mL蒸馏水溶解5.36mg的螯合剂二亚乙基三胺五乙酸二酐，边搅拌边加入溶于10mL蒸馏水的PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)，二亚乙基三胺五乙酸二酐和PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为12:1，搅拌反应1天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到的产物标记为PEI.NH2-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)。
(10)用10mL二甲基亚砜(DMSO)溶解100mg的PEI.NH2-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)，边搅拌边加入溶于2mLDMSO的荧光素FI，FI和PEI.NH2-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为7:1，搅拌反应1天，用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到的产物标记为PEI.NH2-FI-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)。
(11)用10mL蒸馏水溶解80mg的PEI.NH2-FI-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)，边搅拌边逐滴滴加氯金酸溶液(30mg/mL)，氯金酸和PEI.NH2-FI-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为200:1，搅拌20min后，加入21.6mg的溶于蒸馏水的NaBH4(2mL)，溶液变为酒红色，在室温下搅拌反应3h，得到的产物标记为{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs。
(12)向步骤(11)的产物溶液中再加入溶于3mL蒸馏水的APAS-SH，APAS-SH与{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的摩尔比为10:1，搅拌反应2天，之后再加入三乙胺，搅拌反应30min后，加入乙酸酐，三乙胺、乙酸酐和{(Au0)200-PEI.NH2-FI-DTPAA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的摩尔比为120:100:1，在室温下搅拌反应24h，将所得溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到的产物标记为{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPAA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs。
(13)用3mL的磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解3mg的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPAA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs，并加入还原剂SnCl2(50-100μg)，随后将99mTc标记的高锝酸盐(1mL，740MBq)加入上述混合溶液中，孵化20min后分离纯化，即得99mTc标记的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒APAS-99mTc-AuPENPs，反应流程如图1所示。
实施例3
本实施例3与实施例2的区别仅在于：所使用的螯合剂为2,2',2”-(10-(2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三)三乙酸。
对比实施例1
(1)称取80mg实施例1中合成的中间产物PEI.NH2-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)，并溶于10mL蒸馏水中，边搅拌边逐滴滴加2.61mL氯金酸溶液(30mg/mL)，搅拌30min后，加入21.6mg的溶于蒸馏水的NaBH4(2mL)，溶液变为酒红色，在室温下搅拌反应2h。之后再加入88.1μL三乙胺，搅拌反应30min后，加入49.9μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，将所得溶液用纤维素透析膜MWCO＝14000在磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水中透析3天，冷冻干燥处理得到{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs。
(2)用3mL的磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解3mg的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs，并加入还原剂SnCl2(50-100μg)，随后将99mTc标记的高锝酸盐(1mL，740MBq)加入上述混合溶液中，孵化30min后分离纯化，即得99mTc标记的功能化聚乙烯亚胺包裹金纳米颗粒99mTc-Au PENPs。
检测实施例
合成过程中对实施例1得到的1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇、1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯、1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇、1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-甲磺酸酯(化合物I)、4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰胺(化合物II)、4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)进行氢核磁共振表征，结果表明获得了纯度较高的各产物(图2，3)。
合成过程中对实施例1得到的pH敏感两性离子APAS-SH进行了质谱表征，质谱测试结果表明：谱图中出现APAS-SH的分子离子峰([M+H]+＝663)，且丰度较高(图4)。结果表明制备得到了纯度较高的APAS-SH。
合成过程中对实施例1得到的功能化聚乙烯亚胺进行氢核磁共振表征，对各特征峰进行积分计算可知，聚乙烯亚胺载体表面修饰了13.3个mPEG、14.2个MAL-PEG-SVA、6.2个DTPA、4.8个FI、5.3个APAS-SH(图5)。这些测试结果表明已成功设计合成功能化的聚乙烯亚胺。
合成过程中对实施例1得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs进行紫外吸收表征，称取实施例1制备的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs 0.5mg溶解于1mL的蒸馏水中，经紫外吸收测试，结果表明出现了纳米金颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰，位于510nm处，表明本发明中制备得到了金纳米颗粒(图6)。
合成过程中对实施例1得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs进行尺寸和形貌表征。称取实施例1制备的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs 0.5mg溶解于1mL的超纯水中制备纳米材料溶液，后将该溶液滴于铜网表面，风干后进行TEM表征。结果表明，制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs纳米颗粒平均直径为3.3nm±0.7nm，为球形结构，尺寸较为均一、分布较窄，具有良好的单分散性及晶体结构(图7)。
用MTT测试来检测制备得到的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的体外生物相容性，称取实施例1中制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs 1.27mg，溶于2mL的PBS缓冲液中配置金浓度为1000μM的溶液，再分别稀释到金浓度为500μM，200μM，100μM，50μM的溶液。将上述不同金浓度的材料(其各自终浓度为100μM，50μM，20μM，10μM，5μM)孵化HT1080细胞24h后，将材料倒掉，加入180μL新鲜培养基和20μLMTT孵化4h(37℃)，将培养液倒掉，加入200μLDMSO，摇床振摇20min后，用酶标仪测得结果。结果表明，在一定金浓度范围内，功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒([Au]＝0-100μM)不具有明显的细胞毒性，细胞仍然具有较高活性(细胞活力>80％)，说明其在体外具有良好的生物相容性(图8)。
用细胞形态来进一步分析所制备的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的体外生物相容性。将HT1080细胞种于96孔板中，每个孔104个细胞，孵化24h后，分别在每孔加20μLPBS溶液，金浓度为1000μM，500μM，200μM，100μM，50μM的实施例1材料{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs和180μL培养基，使各材料金浓度的终浓度分别为100μM，50μM，20μM，10μM，5μM，孵化HT1080细胞24h后，将材料倒掉，用相差显微镜拍摄细胞形貌图片，结果表明PBS和各金浓度的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs孵化细胞的形貌良好，未出现明显凋亡迹象(图9)。说明实施例1制备得到的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒具有良好的生物相容性。
对实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs和对比例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs进行Zeta电势测量以验证{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的pH响应电荷翻转性能。
分别将{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs和{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs溶解于不同pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)的磷酸盐缓冲液中，且{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs和{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的金浓度均为1μM，进行Zeta电势测量。
结果表明：在中性pH范围内(pH7.0-7.5)，实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs和对比例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的Zeta电势均接近电中性；然而随着酸性的增强，在pH5.0-6.5范围内，实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的Zeta电势由中性转变为正电性，且随着酸性的增强正电性也增强，然而对比例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs的Zeta电势在该pH范围内电性仍然接近中性(图10)。说明基于APAS-SH的表面修饰，使{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs在酸性条件下，发生了表面电荷的翻转，由中性转变为正电性。
用癌细胞摄取测试来证明{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的pH调控癌细胞摄取性能。
将HT1080细胞种于12孔板中，每个孔1×105个细胞，孵化24h后，将实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs(金终浓度为1μM)和{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs(金终浓度为1μM)分别孵化不同pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)培养条件下的HT1080细胞，孵化3h后，将材料倒掉并用PBS洗涤3次，用胰蛋白酶将细胞悬浮，再悬浮在1mL培养基中，细胞计数后，将细胞离心并溶于200μL王水(浓盐酸与浓硝酸体积比3:1)中，随后加入1.8mLPBS缓冲液将其稀释至2mL，以电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP)测量各细胞样品中金元素含量。结果表明：{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs在弱酸性环境下，HT1080细胞对其摄取量提高，且随着酸性的增强，细胞摄取量逐渐增大，而未经APAS-SH功能化的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-MAL)-(mPEG)}PENPs在不同pH条件下细胞摄取量未发生明显增加(图11)。说明了{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs在微酸性环境中发生的电荷翻转(由中性转为正电性)，提高了癌细胞对其的摄取。
对实施例1制备得到的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs进行X-射线衰减性能测试来验证其体外CT成像性能。首先用ICP测定{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs中Au元素含量，再配置金浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08和0.1M的水溶液，并以医用基于碘的CT造影剂欧乃派克作对比，配置碘浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08和0.1M的欧乃派克溶液，进行体外CT成像。结果表明：随着金浓度的增加，{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs的CT信号强度也随之增加，且CT值与金浓度具有良好的线性关系。与临床常用的基于碘的造影剂欧乃派克相比，功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒具有较高的X-射线衰减系数(图12)。说明了{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTPA-(PEG-APAS)-(mPEG)}PENPs可作为良好的CT造影剂。
用薄层层析法测试实施例1制备得到的APAS-99mTc-Au PENPs，以进行放射性稳定性分析。将200μL的放射性标记物APAS-99mTc-Au PENPs(1mg/mL)与2mLPBS溶液混合，之后用薄层层析法测试37℃下APAS-99mTc-Au PENPs在不同时间点(1h，4h和8h)下的放射性化学纯度。结果表明：APAS-99mTc-Au PENPs在不同时间点(0h，1h，4h，8h)下，放射性化学纯度均在90％以上(见表1，APAS-99mTc-Au PENPs在不同时间点下的放射性化学纯度)。说明APAS-99mTc-Au PENPs具有良好的放射性稳定性，未有大量的99mTc从功能化聚乙烯亚胺载体上脱落，可作为良好的SPECT成像造影剂。
表1
时间(h) 0 1 4 8
放射性化学纯度(h) 100.0 96.2 94.4 92.5
使用1HNMR(氢核磁共振)、MS(质谱)、UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、MTT测试、细胞形貌测试、Zeta电势测试、癌细胞摄取测试、X-射线衰减性能测试和放射性稳定性测试表征pH敏感两性离子功能化的99mTc标记聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒平台的结果分别如下：
(1)1HNMR测试
1HNMR测试结果表明：成功制备了中间产物1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-甲磺酸酯(化合物I)及4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐(APAS-SH)；制备得到的APAS-99mTc-Au PENPs中，一个PEI接了13.3个mPEG、14.2个MAL-PEG-SVA、6.2个DTPA、4.8个FI、5.3个APAS，参见图2、图3、图5。
(2)MS测试结果
MS测试结果表明：制备得到的pH敏感两性离子APAS-SH，质谱数据分析APAS-SH的分子离子峰([M+H]+＝663)，且丰度较高，参见图4。这说明制备得到了纯度较高的APAS-SH。
(3)UV-Vis测试结果
UV-Vis测试结果表明：制备得到的功能化聚乙烯亚胺的表面等离子体共振(SPR)峰位于510nm，参见图6。这表明制备得到了金纳米颗粒。
(4)TEM测试结果
TEM测试结果显示了制备得到的金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布情况，参见图7。金纳米颗粒平均直径约3.3nm，为球形结构，尺寸较为均一、分布较窄，具有良好的单分散性及晶体结构。
(5)MTT测试结果
MTT测试结果表明：制备得到的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒具有良好的生物相容性，在分别经一定浓度范围内的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒([Au]＝0μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM)孵化人纤维肉瘤HT1080细胞24h后，细胞仍然具有较高活性(细胞活力>80％)，说明其在体外具有良好的生物相容性，以后可用于体内实验，参见图8。
(6)细胞形貌测试结果
细胞形态结果表明：分别用不同浓度的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒([Au]＝0μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM)孵化人纤维肉瘤HT1080细胞，细胞形态仍然良好，未出现明显凋亡迹象，参见图9。说明制备得到的功能化聚乙烯亚胺具有良好的生物相容性。
(7)Zeta电势测试结果
Zeta电势测试结果表明：在中性pH范围内(pH7.0-7.5)，制备得到的APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒和未经APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的Zeta电势均接近电中性；然而随着酸性的增强，在pH5.0-6.5范围内，制备得到的APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的Zeta电势由中性转变为正电性，且随着酸性的增强正电性也增强，然而未经APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒的Zeta电势在该pH范围内电性仍然接近中性。说明基于APAS-SH的表面修饰，使功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒在酸性条件下，发生了表面电荷的翻转，由中性转变为正电性，参见图10。
(8)癌细胞摄取测试结果
癌细胞摄取测试结果表明：制备得到的APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒在弱酸性环境下，人纤维肉瘤HT1080细胞对其摄取量提高，且随着酸性的增强，人纤维肉瘤HT1080细胞摄取量逐渐增大，而未经APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒在不同pH条件下细胞摄取量未发生明显增加，参见图11。说明了APAS-SH功能化的聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒在微酸性环境中发生的电荷翻转(由中性转为正电性)，提高了癌细胞对其的摄取。
(9)X-射线衰减性能测试结果
X-射线衰减性能测试结果表明：制备得到的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒，随着金浓度的增加，CT信号强度也随之增加，且CT值与金浓度具有良好的线性关系。与临床常用的基于碘的造影剂欧乃派克相比，功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒具有较高的X-射线衰减系数，参见图12。说明了制备的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒可作为良好的CT造影剂，具有体内CT成像的潜能。
(10)放射性稳定性测试结果
放射性稳定性测试结果表明：制备得到的99mTc标记的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒APAS-99mTc-Au PENPs具有良好的放射性稳定性，在不同时间点(0h，1h，4h，8h)下，APAS-99mTc-Au PENPs的放射性化学纯度均在90％以上。说明APAS-99mTc-Au PENPs具有良好的放射性稳定性，未有大量的99mTc从功能化聚乙烯亚胺载体上脱落，可作为良好的SPECT成像造影剂。

Claims (11)

1.一种功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到甲氧基-聚乙二醇-羧基溶液中活化，然后加入到超支化聚乙烯亚胺溶液中，搅拌反应2~4天，得到PEI.NH2-(mPEG)；
（2）将所述PEI.NH2-(mPEG)溶液加入马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯溶液，搅拌反应2~4天，得到PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)；
（3）将所述PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)溶液中加入螯合剂，搅拌，得到PEI.NH2-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)；所述螯合剂为二乙基三胺五乙酸、二亚乙基三胺五乙酸二酐或2,2',2''-(10-(2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三)三乙酸；
（4）向所述PEI.NH2-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)溶液中加入异硫氰酸荧光素，搅拌，得到PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)；
（5）向所述PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)溶液中缓慢滴加入氯金酸溶液，搅拌反应20~40 min，随后加入还原剂溶液搅拌反应2~3h，即得包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺；
（6）将所述包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺的溶液中加入4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐溶液，搅拌反应2~4天，再加入三乙胺和乙酸酐进行乙酰化，经透析、冷冻干燥，得到{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTA-(PEG-APAS)-(mPEG)} PENPs；
（7）将所述的{(Au0)200-PEI.NHAc-FI-DTA-(PEG-APAS)-(mPEG)} PENPs和SnCl2溶解于缓冲液中，加入99mTc标记的高锝酸盐，经孵化20~40 min、分离纯化，得到所述功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的螯合剂为二乙基三胺五乙酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述的4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐由如下方法制得：
（0-1）将三苯甲硫醇和11-溴代十一烷醇加入了NaOH水溶液的乙醇-苯混合溶剂中，搅拌反应8~12h，纯化得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇；
（0-2）将所述1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇溶于二氯甲烷中，控温4℃~10℃加入三乙胺、甲磺酰氯搅拌反应，纯化得到1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯；
（0-3）将NaOH的水溶液和四甘醇在80~100℃混合搅拌1~2h，再加入所述1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯，在80~100℃搅拌反应18~30h，后经纯化得到1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇；
（0-4）将所述1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇溶于二氯甲烷中，控温4℃~10℃加入三乙胺、甲磺酰氯搅拌反应，纯化得到化合物I；
（0-5）向化合物I的溶液中，加入4-羟基苯磺酰胺、乙醇钠、乙醇和N,N-二甲基甲酰胺，搅拌反应18~24h后，纯化得到化合物II；
（0-6）将丁基甜菜碱盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和化合物II中，搅拌反应18~24h，经过纯化得到所述4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐；
所述化合物I的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述化合物II的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（0-1）中三苯甲硫醇与11-溴代十一烷醇的摩尔比为1:1；所述步骤（0-2）中甲磺酰氯与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇的摩尔比为1.5~2:1，三乙胺与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-碳十三醇的摩尔比为1.5~2:1；所述步骤（0-3）中NaOH与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯的摩尔比为1:1，四甘醇与1,1,1-三苯基-2-硫杂-13-甲磺酸酯的摩尔比为15:1；所述步骤（0-4）中三乙胺与1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇的摩尔比为3:1，甲磺酰氯与1,1,1-三苯基-14,17,20,23-四氧杂-2-硫杂-25-碳二十五醇的摩尔比为1.5:1；所述步骤（0-5）中4-羟基苯磺酰胺与化合物I的摩尔比为3:1，4-羟基苯磺酰胺与乙醇钠的摩尔比为1:1；所述步骤（0-6）中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和丁基甜菜碱盐酸盐的摩尔比为1.5~2:1，丁基甜菜碱盐酸盐和化合物II的摩尔比为2:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中甲氧基-聚乙二醇-羧基和超支化聚乙烯亚胺的摩尔比为15:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与甲氧基-聚乙二醇-羧基的摩尔比为15:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯和PEI.NH2-(mPEG)的摩尔比为15:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中螯合剂和PEI.NH2-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为12:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中异硫氰酸荧光素和PEI.NH2-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为7:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中氯金酸和PEI.NH2-FI-DTA-(PEG-MAL)-(mPEG)的摩尔比为200:1。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中4-(1,1,1-三苯基-14,17,20,23,26-五氧杂-2-硫杂)苯磺酰基三甲胺丁酰盐和包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺的摩尔比为10:1，三乙胺、乙酸酐和包裹金纳米颗粒的功能化聚乙烯亚胺的摩尔比为120~660:100~550:1。
11.权利要求1-10任一所述方法制备得到的功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料。
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