CN106620728B - 一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂及其制备和应用 - Google Patents
一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂及其制备和应用，所述造影剂为：柠檬酸钠Na3Cit包覆四氧化三锰Mn3O4纳米颗粒后在纳米颗粒表面先后连接Mal‑PEG‑NH2和L‑半胱氨酸L‑Cysteine分子；制备：将Mal‑PEG‑NH2溶解于水中，逐滴加入到活化后的Mn3O4‑Cit溶液，搅拌，透析，得到Mn3O4‑Cit‑PEG溶液；然后将L‑半胱氨酸L‑Cysteine溶解于水中，逐滴加入到Mn3O4‑Cit‑PEG溶液中，搅拌，透析，即得。本发明方法工艺简单，反应条件温和，易于操作。制备的Mn3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。
Description
技术领域
本发明属于造影剂材料及其制备和应用领域，特别涉及一种两性离子修饰的多功能 Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂及其制备和应用。
背景技术
癌症(cancer)，医学术语亦称恶性肿瘤，现在已直接或间接的影响许多人的生活，成为威胁人类健康的头号杀手。因此，早期的诊断和治疗成为治愈癌症的关键。在肿瘤的早期诊断方面，传统的影像技术只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，而分子影像学技术可以获得更多的检测参数，如肿瘤生长动力学评估，恶变前的分子异常检测，肿瘤细胞标记物等，且活体分子成像可以实现在无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研究，并帮助破译复杂的分子运动轨迹。目前应用于临床的分子影像学技术主要包括超声成像、核医学Positron Emission Tomography(PET)成像、Computed Tomography(CT)成像和磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)等。作为分子影像学的重要组成部分，造影剂的适当选择可以大大提高成像诊断的对比度和分辨率。而作为理想的且能应用于临床癌症早期诊断的纳米材料体系，在生物安全性得以保障的同时，更要兼顾纳米材料在体内的血液循环时间、成像试剂分子、制备方法简便几个主要因素。目前已有研发并应用于临床的造影剂，如应用于CT成像的 Omnipaque，用于MRI的六种钆基小分子造影剂。但是这些小分子造影剂都存在不可克服的缺陷，如血液循环时间过短、无组织特异性，在一定浓度下还存在肾毒性。显而易见，金属或者金属氧化物纳米颗粒相对于金属离子螯合物要更加具有安全性，并且一定尺寸的纳米颗粒经表面修饰后不仅能延长血液循环时间，还能增加纳米颗粒在肿瘤组织的富集。至今已有大量文献报道利用金、银、磁性氧化铁纳米颗粒应用于癌症的早期诊断(Zhou et al.,ACS Appl. Mater.Interfaces 2014,6,17190-17199；Liu et al.,Polym.Chem.2010,1,1677-1683；Li et al., Biomaterials 2013,33,8382-8392)。然而，金银作为贵重金属，成本高在一定程度上限制了其临床应用，而氧化铁纳米颗粒通常是作为MRI阴性造影剂。因为在人体血液中、钙离子富集区、金属离子沉积以及人体组织损伤部位在T2成像过程中也会出现信号减弱现象而得到负造影图像，这往往会干扰临床诊断。因此，临床医学界更期望开发具有信号增强作用的T1阳性MRI造影剂。
柠檬酸钠(Na3Cit)是一种具有一定还原性且拥有三个羧酸基团的小分子，不仅能有效稳定纳米颗粒，还能够使得纳米颗粒表面带上负电荷的羧基官能团，为纳米颗粒的表面多功能化修饰提供了可行性。本发明选取的氨基酸分子L-Cysteine，具有两性离子表面、无毒、生物抗污性、生物相容性好、稳定性高、廉价易得、易于修饰等多种优势。本课题组前期的文献显示柠檬酸钠(Na3Cit)修饰的磁性氧化铁纳米颗粒可以通过简易的溶剂热法合成(Luo et al.,Colloids Surf.,B 2015,136,506–513)。正是基于该方法合成简便环保，选材价廉以及本课题组前期积累了大量的研究基础的大环境下，本发明采用了相似的方法(一步溶剂热法) 合成出具有良好胶体稳定性的Na3Cit稳定的Mn3O4纳米颗粒。随后，在Mn3O4纳米颗粒表面修饰PEG和L-Cysteine，这不仅增加了纳米颗粒的水溶性和生物相容性，为进一步的体内成像应用提供了良好的保障；同时也提高了Mn3O4纳米颗粒在体内的血液循环时间，进而增加 Mn3O4纳米颗粒在肿瘤部位的富集，从而可以提高成像对比度。
检索国内外文献，尚没有发现关于用一步溶剂热法合成制备Na3Cit稳定并经L-Cysteine 修饰的Mn3O4纳米颗粒及其用于体内肿瘤模型MRI诊断的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂及其制备和应用，本发明利用溶剂热法制备得到Na3Cit稳定的Mn3O4纳米颗粒，然后对纳米颗粒进行分离纯化；其次，将能够提高生物相容性的聚乙二醇(PEG)分子修饰到纳米颗粒上；最后，将两性离子L-半胱氨酸(L-Cysteine)修饰在纳米颗粒的表面，得到具有生物抗污性能的Mn3O4纳米颗粒造影剂；本发明方法工艺简单，反应条件温和，易于操作。制备的Mn3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。所用的修饰剂 Na3Cit为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
本发明的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂，所述造影剂为：柠檬酸钠Na3Cit包覆四氧化三锰Mn3O4纳米颗粒后在纳米颗粒表面先后连接Mal-PEG-NH2和L-半胱氨酸L-Cysteine分子。
本发明的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，包括：
(1)将柠檬酸钠Na3Cit加入到锰盐溶液中，搅拌0.5-1.5h，然后转移至高压反应釜中， 180℃溶剂热反应12-24h，冷却至室温，透析，得到Na3Cit稳定的四氧化三锰纳米颗粒溶液，标记为Mn3O4-Cit溶液；
(2)将EDC和NHS溶解于水中，滴加到Mn3O4-Cit溶液中，持续搅拌3-4h以活化Mn3O4-Cit表面的羧基，得到活化后的Mn3O4-Cit溶液，然后将Mal-PEG-NH2溶解于水中，逐滴加入到活化后的Mn3O4-Cit溶液，持续搅拌反应72-96h，透析，得到表面修饰PEG的Mn3O4-Cit溶液，标记为Mn3O4-Cit-PEG溶液；
(3)将L-半胱氨酸L-Cysteine溶解于水中，逐滴加入到Mn3O4-Cit-PEG溶液中，持续搅拌反应12-24h，透析，表面修饰L-Cysteine的Mn3O4-Cit-PEG(标记为 Mn3O4-Cit-PEG-Cys)溶液，即为两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂。
所述步骤(1)中搅拌时间为1h。
所述步骤(1)中锰盐溶液具体为：锰盐溶于溶剂中，然后在70℃的空气气氛中搅拌1.5-3h；优选70℃下的空气气氛中搅拌3h，其中锰盐为乙酰丙酮锰Mn(acac)3，锰盐溶液的溶剂为一缩二乙二醇DEG(又名二甘醇)。
所述步骤(1)中锰盐、锰盐溶液的溶剂、柠檬酸钠Na3Cit的比例为0.45-0.5g：25-30mL： 0.07-0.08g。
优选地，锰盐、锰盐溶液的溶剂、柠檬酸钠Na3Cit的比例为0.4812g：25mL：0.075g。所述步骤(1)中透析具体为：用截留分子量为5000的透析袋透析12小时，需每次透析所用蒸馏水2L，共换水1次，然后去除上清液；然后继续用截留分子量为5000的透析袋透析3天，其中每次透析所用蒸馏水2L，共换水8次。
所述步骤(2)中EDC、NHS、Mal-PEG-NH2的投料摩尔比为5-10：5-10：0.5-1，Mal-PEG-NH2和Mn3O4-Cit的投料质量比为1-1.2：5-6。
优选地，EDC、NHS、Mal-PEG-NH2的投料摩尔比为10：10：1，Mal-PEG-NH2和Mn3O4-Cit的投料质量比为1：5。
所述步骤(2)中Mal-PEG-NH2的平均分子量为2000。
所述步骤(3)中L-Cysteine与Mn3O4-Cit-PEG的摩尔比为1.5-2：0.8-1。
优选地，L-Cysteine与Mn3O4-Cit-PEG的摩尔比为2：1。
所述步骤(2)、(3)中透析均为用截留分子量为5000的透析袋透析3天，其中每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
本发明的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的应用，在制备肿瘤模型早期诊断的磁共振成像造影剂中的应用。
本发明制备的造影剂能够显著延长纳米颗粒在动物体内的血液循环时间，增加纳米颗粒在肿瘤部位的富集，从而提高肿瘤部位的成像效果，为发展一种新型的纳米造影剂提供了良好的思路。
本发明先利用一步溶剂热法合成Na3Cit稳定的Mn3O4磁性纳米颗粒，然后将 Mal-PEG-NH2和L-Cysteine修饰在纳米颗粒的表面。
本发明经一步溶剂热法合成得到表面修饰柠檬酸钠(Na3Cit)的Mn3O4纳米颗粒，Na3Cit 不仅有稳定纳米颗粒的作用，同时还提供了可进行功能化修饰的羧基官能团。
本发明操作简便易行，制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和生物相容性。与没有L-Cysteine修饰的对照材料相比，L-Cysteine修饰的Mn3O4纳米颗粒拥有更长的血液循环时间，并且在肿瘤部位具有更高的富集量。该方法制备的L-Cysteine修饰的Mn3O4纳米颗粒在MRI分子影像诊断领域有着潜在的应用。
本发明使用X射线衍射(XRD)、傅氏转换红外线光谱分析仪(FT-IR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势、水合粒径和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过核磁共振成像仪测定纳米颗粒的T1弛豫性能和r1弛豫率，然后通过溶血实验、Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和荧光显微镜评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，再利用ICP-OES技术以及体外和体内MRI实验检测L-Cysteine修饰的纳米材料对肿瘤细胞和肿瘤组织的诊断效果。具体测试结果如下：
(1)XRD测试结果
通过与标准晶体结构卡片对比和分析X-射线衍射图谱(如图1)，溶剂热法合成的材料和标准品Mn3O4的图谱完全一致，表明本发明制备的溶剂热一步法得到的锰氧化物晶体结构为标准的Mn3O4晶体。
(2)FT-IR测试结果
通过对得到的图谱(如图2)进行解析，图谱中3437cm-1，862cm-1和624cm-1处对应的是水分子和Na3Cit分子上O-H的伸缩振动，2923cm-1，2853cm-1和1433cm-1处对应的是 Na3Cit分子上C-H的伸缩振动，而1260cm-1和1075cm-1是Na3Cit分子上C-O的伸缩振动， 1634cm-1是Na3Cit分子上C＝O的伸缩振动。相比之下，521cm-1上多出的峰为Mn3O4上Mn-O 的伸缩振动。红外光谱图结果表明合成的四氧化三锰纳米颗粒表面确实存在Na3Cit。
(3)TEM测试结果
通过TEM观察本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的形态和粒径(图3a)以及高分辨率的晶格(图3b)。TEM测试结果显示制备得到的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒呈球形或者近似球形状，且直径分布均匀，大小约为2.7nm。
(4)TGA测试结果
为了检测Mal-PEG-NH2和L-Cysteine在Mn3O4纳米颗粒表面的上载量，我们对修饰前后的纳米颗粒进行了TGA测试。由图4可以看出，修饰前纳米颗粒的失重量为40.91％(图4a)， Mn3O4-Cit纳米颗粒表面修饰Mal-PEG-NH2和L-Cysteine后，Mn3O4-Cit-PEG和 Mn3O4-Cit-PEG-Cys的失重分别是45.94％(图4b)和47.12％(图4c)；经过计算，Mal-PEG-NH2和L-Cysteine的上载率分别为15.74％和4.15％，由此表明Mal-PEG-NH2和L-Cysteine已成功连接到Mn3O4纳米颗粒的表面。
(5)纳米颗粒Zeta电势及水合粒径测试结果
鉴于本发明制备得到的四氧化三锰纳米颗粒表面有大量的Na3Cit存在，因而具有较高的负电荷，而较高的负电荷严重制约了该材料在生物医学领域的应用。本课题组通过大量的研究发现对表面羧基采用聚乙二醇和氨基酸修饰后能有效地屏蔽负电荷，从而提高其生物相容性。因此，本发明也借鉴该方法对其进行聚乙二醇和氨基酸修饰，以期提高其生物相容性。电势测定结果如表1所示：溶剂热法合成得到的Na3Cit包裹的Mn3O4由于大量羧基存在，测定其表面电势和水合粒径分别为-25.8mV和136.6nm。而经过修饰Mal-PEG-NH2和L-Cysteine 之后，对照材料Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为-21.5mV，179.7nm，而实验材料Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为-17.2mV，213.3nm。分析实验结果不难看出，聚乙二醇和L-半胱氨酸的修饰成功地提高了纳米颗粒的表面电势。而水合粒径随着表面修饰物的增加而递增，也表明成功地将目的物修饰到Mn3O4-Cit纳米颗粒表面。
(6)r1弛豫率测量结果
Mn3O4纳米材料可以用作核磁共振成像的阳性T1造影剂，随着Mn浓度的增加，MRI信号强度逐渐增强。r1弛豫率反映Mn3O4纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度锰的纵向弛豫时间，可通过不同浓度下的T1弛豫时间的倒数拟合计算得到。图5为本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒的T1弛豫时间倒数与 Mn浓度的线性拟合图，可以看出这两种Mn3O4纳米材料的弛豫时间倒数随着锰浓度的增加 (在0.1-1.6mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的 Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的弛豫率分别为3.66mM-1s-1和3.47mM-1s-1，与临床上使用的钆剂弛豫率相近。因此，本发明所制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料 Mn3O4-Cit-PEG均可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂。
(7)T1加权MR成像测量结果
在测试了本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的T1弛豫时间之后，我们还研究了实验材料和对照材料的T1加权MR成像性能(如图6)。从图中可以看出随着锰浓度(0.05-0.8mM)的提高MRI信号逐渐增强，并且呈良好的梯度关系，测试结果说明该材料具有良好的MRI成像能力。
(8)血液相容性
由于造影剂的给药途径多数情况下是经由静脉注射方式进入人体内的。因此，造影剂势必会与血液直接接触。而造影剂的介入会不会产生溶血或者其他不良症状便成为科研工作者不得不考虑的重要因素。鉴于此，本实验评估了本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的血液相容性。图7a中显示了Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG在不同锰浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mM)下经过1个小时孵育之后离心观察溶血结果，结果显示阳性对照组(水)完全溶血，阴性对照组(生理盐水)、实验组以及对照组均未出现明显溶血现象。此外，我们还通过测量上层清液的吸光值来定量分析纳米材料的溶血性能。如图7b显示了水加人血红细胞，生理盐水加血红细胞Mn3O4-Cit-PEG加人血红细胞，Mn3O4-Cit-PEG，Mn3O4-Cit-PEG-Cys加人血红细胞，Mn3O4-Cit-PEG-Cys在450到650nm 的紫外吸收(UV-Vis)图谱。从图中我们可以看出，血红细胞在545nm处有一个明显的紫外吸收峰，通过减去材料本身的背景值，可以计算出在锰浓度达到1.6mM时， Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的溶血率都小于5％，说明制备的纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MRI成像。
(9)CCK-8细胞活力和荧光显微镜测试结果
通过CCK-8比色法测定C6细胞(一种大鼠神经胶质瘤细胞株)的活力来检测本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的细胞毒性(如图8)。C6细胞分别与Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒(锰浓度为25、50、100、200和 400μM)在37℃下共培养12小时。然后，经CCK-8处理后在450nm处测量吸光值，以生理盐水处理后的吸收值为基准，不同浓度的材料处理后的吸收值与之相比计算出细胞的存活率。经计算我们发现Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒在浓度25到200μM 范围内对C6细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上，当浓度增加到400μM 时细胞的存活率略微下降，但依然保持在76％(如图8)。这充分说明Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG具有良好的细胞相容性。同时，我们还通过Calcein-AM荧光试剂染色并使用荧光显微镜观察法进一步验证材料对细胞的形貌是否有影响。如图9所示，生理盐水做为对照，不同浓度的Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米材料(锰浓度分别为25、50、100、 200和400μM)处理12小时后的细胞形态和生理盐水处理的细胞相比，并没有发生明显的变化，说明了合成的材料不会对细胞形貌产生影响，进一步证明材料安全无毒。
(10)体外细胞吞噬检测结果
通过ICP-OES检测Raw 264.7细胞(一种巨噬细胞株)对本发明制备的 Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在不同浓度下的吞噬量(如图10) 来检测L-Cysteine的生物抗污效果。Raw 264.7细胞分别与Mn3O4-Cit-PEG-Cys和 Mn3O4-Cit-PEG(Mn浓度为5、10、15、20和25μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以生理盐水处理的细胞作为对照组。然后通过ICP-OES检测细胞的吞噬量。如图10所示，随着Mn浓度的提高，细胞对Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG的吞噬量均逐渐增加。但是在相同Mn浓度下，细胞对Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的吞噬量明显少于对 Mn3O4-Cit-PEG的吞噬量。这些结果说明修饰L-Cysteine赋予了纳米颗粒生物抗污性能，减少了巨噬细胞对纳米颗粒的吞噬量。
(11)体外细胞MRI成像结果
在进行体内实验之前，我们评价了本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的体外细胞MRI成像效果(如图11所示)。C6细胞分别与 Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒(Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM) 在37℃下共培养6小时，并且以生理盐水处理的细胞作为对照组。如图11所示，随着Mn 浓度的提高，Mn3O4-Cit-PEG-Cys或者Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI 信号增强的趋势，说明随着Mn浓度的增加，C6细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Mn浓度下，Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒处理后的细胞比对照材料 Mn3O4-Cit-PEG处理后的MRI信号增强更明显，说明L-Cysteine的存在使得C6细胞对 Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的吞噬量要大大高于Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒。图12是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI成像信号值，从图中明显看出，随着Mn浓度的提高，细胞的MRI信号值均逐渐增加，而且在相同的Mn浓度下，Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒处理后细胞的MRI信号值要明显高于对照材料Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MRI成像效果，而且证明了L-Cysteine修饰的 Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒表面的水化层使其表面性质更倾向于中性，增加了C6细胞的非特异性吞噬。
(12)体内药物代谢结果
通过尾静脉注射本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG 来评价血液中药物代谢半衰期(如图13)。分别对小鼠注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys或者Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500μg)，然后在不同时间点(0、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72 h)，经过小鼠眼眶静脉窦采血并通过ICP-OES检测血液中Mn元素含量来拟合药物代谢半衰期。图13显示，在不同时间点，注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys的小鼠血液中Mn的含量均大于注射Mn3O4-Cit-PEG的小鼠。经过拟合得到，Mn3O4-Cit-PEG-Cys在小鼠体内的半衰期(28.4h) 远大于Mn3O4-Cit-PEG在小鼠体内的半衰期(18.5h)。这些结果说明本发明制备的 Mn3O4-Cit-PEG-Cys有着较长的血液循环半衰期。
(13)体内肿瘤MR成像结果
通过尾静脉注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒的生理盐水溶液，与注射前相比较，在注射后20分钟到90分钟内，注射对照材料Mn3O4-Cit-PEG和 Mn3O4-Cit-PEG-Cys(Mn：500μg，125μL)的小鼠肿瘤部位均逐渐变亮，在注射90分钟以后，小鼠肿瘤部位开始逐渐变暗，而且在相同时间点，注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys的小鼠肿瘤部位的亮度高于注射Mn3O4-Cit-PEG的小鼠肿瘤部位的亮度，表明L-Cysteine修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果(如图14)。图15是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后20分钟到4小时，在注射对照材料Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG-Cys后，信号值均比注射前信号值高，且均在90分钟时达到峰值，而注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys的小鼠肿瘤MRI信号值更强，这与图14的结果一致。这些结果说明本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys 纳米颗粒具有很好的肿瘤成像效果，能成功应用于体内MRI肿瘤成像诊断。
(14)组织分布检测结果
通过尾静脉注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500μg，125μL)纳米颗粒的生理盐水溶液，在刚开始的2小时内，材料主要被网状内皮系统如肝、脾和肺吞噬(如图16)，然而与对照材料Mn3O4-Cit-PEG相比(如图16b)，在相同时间点，Mn3O4-Cit-PEG-Cys 被吞噬的更少(如图16a)。随着时间的推移，肿瘤部位的材料含量呈现先增后减的趋势，在1.5小时时达到峰值，这与体内肿瘤MR成像结果(如图15)是一致的。而且在相同时间点，Mn3O4-Cit-PEG-Cys在肿瘤部位的富集量多于Mn3O4-Cit-PEG在肿瘤部位的富集量。所有材料在注射48小时后，均能被代谢到极小值。这些结果说明本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒具有良好的生物抗污效果，能够更多的富集在肿瘤部位，并且能够在体内完全代谢。
有益效果
(1)本发明采用简单的一步溶剂热法制备水溶性良好的Na3Cit包覆的Mn3O4纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面先后连接Mal-PEG-NH2和L-Cysteine分子，得到用于MRI造影剂的Mn3O4纳米颗粒；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；
(2)本发明制备的Mn3O4纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水，不会出现团聚或者沉淀现象；Na3Cit的包覆增加了Mn3O4纳米颗粒的稳定性，Mal-PEG-NH2的表面修饰增加了Mn3O4纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而L-Cysteine的修饰赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的非特异性富集；这些优点使制备的L-Cysteine修饰的Mn3O4纳米颗粒可以有效地用作体内MR成像的阳性造影剂。
附图说明
图1是本发明制备的Mn3O4-Cit的XRD图(实施例1)；
图2是Na3Cit·2H2O(a)，Mn3O4-Cit(b)的红外光谱图(实施例1)；
图3是本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的形态和粒径(a)以及高分辨率的晶格(b) 的TEM图(实施例2)；
图4是本发明制备的Mn3O4-Cit(a)、对照材料Mn3O4-Cit-PEG(b)和Mn3O4-Cit-PEG-Cys (c)纳米颗粒的热重分析图(实施例2)；
图5是本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的T1弛豫时间倒数与 Mn浓度的线性关系图(实施例2)；
图6本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度为0.1到1.6mM 的MR T1加权成像(实施例2)；
图7是本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度为0.1到1.6mM 下溶血实验结果，其中(a)为离心后的溶血图片，(b)为上层清液的紫外光谱图(实施例3)；
图8是CCK-8法测得C6细胞经过生理盐水(对照)、Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度为25到400μM下处理12小时后的细胞活力(实施例4)；
图9是C6细胞经过生理盐水、Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度分别为25到400μM下处理12小时后的荧光显微镜细胞形貌图，标尺均为200μm(实施例4)；
图10是Raw 264.7细胞经过生理盐水、Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度为5到25μg/mL下处理4小时后的细胞吞噬图(实施例5)；
图11是C6细胞经过生理盐水、Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度为0 到1.6mM下处理6小时后的T1加权MR成像图(实施例6)；
图12是C6细胞经过生理盐水、Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG在锰浓度为 0到1.6mM下处理6小时后的T1加权MR成像信号值柱状图(实施例6)；
图13是尾静脉注射本发明制备得到的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500μg)后不同时间点小鼠血液中Mn浓度拟合的药物代谢图(实施例 7)；
图14是尾静脉注射本发明制备得到的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500μg)后不同时间点小鼠肿瘤的T1加权MR成像图片(实施例8)；
图15是尾静脉注射本发明制备得到的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500μg)后不同时间点小鼠肿瘤的MRI信号值变化(实施例8)；
图16是尾静脉注射本发明制备得到的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒(b)和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(a)(Mn：500μg)后不同时间点小鼠组织器官和肿瘤中的Mn含量变化(实施例9)；
图17是本发明制备方法示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将0.4812g Mn(acac)3均匀分散在25mL DEG中，于70℃下的空气气氛中搅拌3小时，接着将0.075g Na3Cit加入到上述溶液，让混合溶液继续搅拌1小时，然后转移至高压反应釜中，于180℃反应24小时；反应结束后，自然冷却至室温，用截留分子量为5000的透析袋透析12小时(每次透析所用蒸馏水2L，共换水1次)，然后去除上清液，继续用截留分子量为5000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水8次)，待透析结束，取出部分透析液真空冷冻干燥，取适量Mn3O4-Cit粉末用于X-射线衍射检测和FTIR测试。通过与标准晶体结构卡片对比和分析X-射线衍射图谱(如图1)，一步溶剂热法合成的材料和标准品 Mn3O4的图谱完全一致，表明得到的锰氧化物晶体结构为标准的Mn3O4晶体。通过对得到的红外光谱图(如图2)进行解析，图谱中3437cm-1，862cm-1和624cm-1处对应的是水分子和Na3Cit分子上O-H的伸缩振动，2923cm-1，2853cm-1和1433cm-1处对应的是Na3Cit分子上C-H的伸缩振动，而1260cm-1和1075cm-1是Na3Cit分子上C-O的伸缩振动，1634cm-1是Na3Cit分子上C＝O的伸缩振动，相比之下，521cm-1上多出的峰为Mn3O4上Mn-O的伸缩振动，表明合成的Mn3O4纳米颗粒表面确实存在Na3Cit。
取11.5mg EDC和6.9mg NHS分别溶解于1mL水中使其分散均匀，在匀速搅拌的情况下，将EDC溶液和NHS溶液依次逐滴加入到15mL Mn3O4-Cit溶液(Mn3O4-Cit：60mg)中，持续搅拌活化3小时，然后将12mg Mal-PEG-NH2溶解于2mL水中使其分散均匀，持续搅拌3天，反应结束后用截留分子量为5000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，得到Mn3O4-Cit-PEG溶液(19mL)，取2mL Mn3O4-Cit-PEG溶液冷冻干燥备用；
取0.8mg L-Cysteine溶解于1mL水中使其分散均匀，在匀速搅拌的情况下，将L-Cysteine 溶液逐滴加入到9.5mL Mn3O4-Cit-PEG溶液中，持续搅拌24小时，反应结束后用截留分子量为5000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，得到Mn3O4-Cit-PEG-Cys 溶液(10.5mL)，取2mL Mn3O4-Cit-PEG-Cys溶液冷冻干燥备用。
实施例2
为了对制备得到的纳米颗粒的尺寸和形貌进行表征，取5μL本发明实施例1中制备的 Mn3O4-Cit-PEG-Cys溶液滴在铜网表面，并在空气中晾干后用于TEM测试(如图3所示)。TEM结果显示Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒(图3a和图3b)的形貌均为球形或近似球形，直径分布较为均一，直径大约为2.7nm。
称取实施例1三种材料：Mn3O4-Cit，Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys 2-4mg进行热重分析(如图4所示)。TGA测试结果表明，修饰前Mn3O4-Cit纳米颗粒的失重量为40.91％(图4a)，按Mn3O4-Cit和Mal-PEG-NH2质量比例5：1修饰，以及Mal-PEG-NH2和L-Cysteine 摩尔比例1：2修饰后，对照材料Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys的失重量分别是45.94％(图4b)和47.12％(图4c)；经过计算，Mal-PEG-NH2和L-Cysteine的上载率分别为15.74％和4.15％，由此表明Mal-PEG-NH2和L-Cysteine已成功连接到Mn3O4-Cit纳米颗粒的表面。
同样取本发明制备的Mn3O4-Cit、Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys(实施例1)溶液用于测表面电势和水动力学直径(如表1)。Mn3O4-Cit溶液的表面电势测定结果为-25.8mV，这主要是因为Mn3O4表面有大量羧基存在的缘故，经过修饰Mal-PEG-NH2和L-Cysteine之后， Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys的表面电势分别升到了-21.5mV和-17.2mV，表明聚乙二醇和氨基酸修饰能有效地屏蔽纳米颗粒表面的负电荷，从而提高了纳米颗粒的表面电势。经测定Mn3O4-Cit、Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys的水合粒径分别为136.6nm，179.7 nm和213.3nm。从水合粒径逐渐增加可以看出Mn3O4-Cit表面成功地修饰上了Mal-PEG-NH2和L-Cysteine分子。
将本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys溶液和对照材料Mn3O4-Cit-PEG溶液(实施例1) 通过ICP-OES测试法测得溶液中Mn元素的浓度，再用超纯水配制Mn浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液0.5mL，测定不同Mn浓度下的T1弛豫时间(如图5所示)和 T1加权MRI成像(如图6所示)。弛豫率测试结果表明Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG 纳米颗粒的T1弛豫时间倒数在Mn浓度为0.1到1.6mM范围内随着锰浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可知Mn3O4-Cit-PEG-Cys的r1弛豫率3.66mM-1s-1，Mn3O4-Cit-PEG 的r1弛豫率为3.47mM-1s-1，都具有良好的T1弛豫效应和r1弛豫率。同时T1加权成像也显示两种材料随锰浓度的提高，信号强度增强。因此，本发明所制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂。
表1.Mn3O4-Cit，Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的表面电势和水动力直径。
实施例3
为了确保本发明制备的纳米颗粒能安全地用于体内生物成像诊断，评价了制备得到的 Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的血液相容性。根据实施例2中测定的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG溶液的锰浓度，分别加入一定量的氯化钠(NaCl)，配制成不同材料的生理盐水溶液(NaCl的质量浓度为0.9％)。接着加入生理盐水配成Mn浓度为1.6mM的母液。然后用生理盐水依次配制Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的生理盐水溶液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm，5min)去上清液，然后将血红细胞用生理盐水洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS稀释10倍。再将Mn3O4-Cit-PEG-Cys和 Mn3O4-Cit-PEG溶液(0.1到1.6mM)与红细胞混合静置2小时后，10000rpm离心1分钟，拍照并测定上清液的紫外吸收值。同时将Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG溶液(0.1到 1.6mM)以10000rpm离心1分钟作为对照。该过程以超纯水作为阳性对照，PBS作为阴性对照。图7a中显示了Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG在浓度0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 mM下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光度值定量评价纳米材料的溶血性。如图 7b下方紫外光谱图显示，通过减去对照材料的背景值，在浓度达到1.6mM时， Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG的溶血率都小于5％，说明制备的这些纳米材料具有良好的血液相容性。
实施例4
以C6细胞为模型细胞评价本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒和对照材料Mn3O4-Cit-PEG对细胞存活的影响。取Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的生理盐水溶液(实施例3)，用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌生理盐水配制浓度为25、50、100、200和400μM的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒悬浮液。 C6细胞种植于96孔板后分别与Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG溶液(浓度为25、50、 100、200和400μM)在37℃下共培养12小时。然后，向每个培养板孔中加入20μL CCK8 和180μL无血清的培养基，继续在37℃下培养4小时后，在酶标仪下于450nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(如图8)。Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG在实验浓度25到400μM范围内对C6细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在76％以上。这充分说明合成的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG均具有良好的细胞相容性，可以应用到生物体内MRI成像检测。为了观察细胞形貌，C6细胞种植于96孔板后分别与不同浓度的 Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米材料(锰浓度分别为25、50、100、200和400μM) 在37℃下共培养12小时，其中生理盐水做为对照。然后，将20μL C-AM荧光染色试剂均匀分散于于8mL无血清的培养基，向每个培养板孔中加入200μL C-AM溶液，继续在37℃下染色15分钟，使用生理盐水洗去C-AM溶液，并在每个孔中加入200μL无血清的培养基，于荧光显微镜下观察，以验证制备得到的材料对细胞形态是否会产生影响。如图9所示，不同浓度的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG溶液(25、50、100、200和400μM)处理 12小时后的细胞形态和生理盐水处理后的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的良好细胞相容性。
实施例5
通过ICP-OES检测不同浓度的Mn3O4-Cit-PEG和Mn3O4-Cit-PEG-Cys溶液(5、10、15、20和25μg/mL)分别与Raw 264.7细胞共培养4小时后，Raw 264.7细胞对纳米材料的吞噬量(如图10)来评价L-Cysteine的生物抗污效果。采用实施例3中Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG的生理盐水溶液配置成相应浓度为5、10、15、20和25μg/mL的生理盐水溶液。Raw 264.7细胞以2×105/孔种植于12孔板，培养24h后再分别与Mn3O4-Cit-PEG-Cys 和Mn3O4-Cit-PEG溶液(Mn浓度为5、10、15、20和25μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以生理盐水处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用生理盐水洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞在1ml王水下消化10分钟并加水稀释。通过ICP-OES检测细胞对纳米颗粒的吞噬情况。图10中，和对照组(生理盐水处理的细胞)相比，随着Mn浓度的增加，细胞对Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG的吞噬量逐渐增加，然而在相同的浓度下，细胞对Mn3O4-Cit-PEG-Cys的吞噬量低于对Mn3O4-Cit-PEG的吞噬量。这说明L-Cysteine修饰后赋予了纳米颗粒良好的生物抗污性能。
实施例6
在体内成像实验之前，评价了纳米颗粒的体外细胞MRI成像效果。C6细胞以2×106/孔种植于25cm2细胞培养瓶中，培养过夜后，分别与生理盐水、Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG溶液(实施例3中，Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的两种纳米颗粒悬浮液)在37℃下共培养6小时。培养结束后细胞用生理盐水洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS(含0.5％琼脂糖)中。用核磁共振成像仪测定各细胞样品的T1加权成像(如图11)。如图所示，随着Mn浓度的增加，Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG 纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号增强的趋势，说明随着Mn浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在同样的Mn浓度下，Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒处理后的细胞比Mn3O4-Cit-PEG处理后细胞的MRI信号增强更明显，说明细胞对 Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒的吞噬量要大大高于Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒。图12是细胞被不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI成像信号值，从图中明显看出，随着Mn浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐增加，而且在相同的Mn浓度下，Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒处理后细胞的MRI信号值要明显高于Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MRI成像效果，而且证明了肿瘤细胞对Mn3O4-Cit-PEG-Cys 纳米颗粒有更多的非特异性吞噬量。
实施例7
将本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(实施例3)生理盐水溶液按照ICP-OES测定的锰浓度配置成4mg/mL的生理盐水分散液。分别向小鼠尾静脉注射 Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒的生理盐水溶液，在注射后不同时间点(0.5、 1、2、4、8、12、24、48和72h)通过小鼠眼眶静脉窦采血并通过ICP-OES检测血液中Mn元素含量来评价药物代谢的半衰期。如图13显示，在不同时间点，注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys的小鼠血液中Mn的含量均大于注射Mn3O4-Cit-PEG的小鼠。经过拟合得到， Mn3O4-Cit-PEG-Cys在小鼠体内的半衰期(28.4h)远大于Mn3O4-Cit-PEG在小鼠体内的半衰期(18.5h)。这些结果说明本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys有着较长的血液循环半衰期。
实施例8
将本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(实施例3)生理盐水溶液按照ICP-OES测定的锰浓度配置成4mg/mL的生理盐水分散液。5×106个C6细胞接种到裸鼠体内，一个月后待肿瘤直径达到0.6-1.2cm时，分别通过尾静脉注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys 和Mn3O4-Cit-PEG纳米颗粒的生理盐水溶液来评价肿瘤部位的MR成像效果(如图14)。与注射前相比较，在注射后20分钟到90分钟内，注射对照材料Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500μg， 125μL)和Mn3O4-Cit-PEG-Cys(Mn：500μg，125μL)的小鼠肿瘤部位均逐渐变亮，在注射90分钟以后，小鼠肿瘤部位开始逐渐变暗，而且在相同时间点，注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys 的小鼠肿瘤部位的亮度高于注射Mn3O4-Cit-PEG的小鼠肿瘤部位的亮度，表明L-Cysteine修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图15是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后30分钟到4小时，在注射对照材料Mn3O4-Cit-PEG-Cys和Mn3O4-Cit-PEG-Cys后，信号值均比注射前信号值高，且均在90分钟时达到峰值，而注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys的小鼠肿瘤MRI信号值更强。这些结果说明本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒具有很好的肿瘤成像效果，能成功应用于体内MRI肿瘤成像诊断的造影剂。
实施例9
将本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys和对照材料Mn3O4-Cit-PEG(实施例3)生理盐水溶液按照ICP-OES测定的锰浓度配置成4mg/mL的生理盐水分散液。分别对荷瘤裸鼠(实施例 8)通过尾静脉注射Mn3O4-Cit-PEG-Cys(Mn：500μg，125μL)和Mn3O4-Cit-PEG(Mn：500 μg，125μL)纳米颗粒的生理盐水溶液，在不同时间后(0.5、1、1.5、2、24和48h)将小鼠分别猝死，取心、肝、脾、肺、肾和肿瘤用王水消化，用超纯水稀释后，8500rpm离心5 分钟取上清液，通过ICP-OES测定组织中Mn的含量来评价组织中材料的分布情况(如图16)。在刚开始的2小时内，材料主要被网状内皮系统如肝、脾和肺吞噬，然而与对照材料 Mn3O4-Cit-PEG相比(如图16b)，在相同时间点，Mn3O4-Cit-PEG-Cys被吞噬的更少(如图 16a)。随着时间的推移，肿瘤部位的材料含量呈现先增后减的趋势，在1.5小时时达到峰值，这与实施例8的结果是一致的。而且在相同时间点，Mn3O4-Cit-PEG-Cys在肿瘤部位的富集量多于Mn3O4-Cit-PEG在肿瘤部位的富集量。所有材料在注射48小时后，均能被代谢到极小值。这些结果说明本发明制备的Mn3O4-Cit-PEG-Cys纳米颗粒具有很好的生物抗污效果，能够在体内完全代谢，并且能够更多的富集在肿瘤部位。
Claims (10)
1.一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂，其特征在于：所述造影剂为：柠檬酸钠Na3Cit包覆四氧化三锰Mn3O4纳米颗粒后在纳米颗粒表面先后连接Mal-PEG-NH2和L-半胱氨酸L-Cysteine分子；其中柠檬酸钠Na3Cit包覆四氧化三锰Mn3O4纳米颗粒具体为将柠檬酸钠Na3Cit加入到锰盐溶液中，搅拌，然后180℃溶剂热反应12-24h，冷却至室温，透析；其中锰盐为乙酰丙酮锰Mn(acac)3。
2.一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，包括：
(1)将柠檬酸钠Na3Cit加入到锰盐溶液中，搅拌，然后180℃溶剂热反应12-24h，冷却至室温，透析，得到Na3Cit稳定的四氧化三锰纳米颗粒溶液，标记为Mn3O4-Cit溶液；其中锰盐为乙酰丙酮锰Mn(acac)3；
(2)将EDC和NHS溶解于水中，滴加到Mn3O4-Cit溶液中，搅拌3-4h，得到活化后的Mn3O4-Cit溶液，然后将Mal-PEG-NH2溶解于水中，逐滴加入到活化后的Mn3O4-Cit溶液，持续搅拌反应72-96h，透析，得到表面修饰PEG的Mn3O4-Cit溶液，标记为Mn3O4-Cit-PEG溶液；
(3)将L-半胱氨酸L-Cysteine溶解于水中，逐滴加入到Mn3O4-Cit-PEG溶液中，持续搅拌反应12-24h，透析，即得。
3.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中锰盐溶液具体为：锰盐溶于溶剂中，然后在70℃的空气气氛中搅拌3-4h；锰盐溶液的溶剂为一缩二乙二醇DEG。
4.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中锰盐、锰盐溶液的溶剂、柠檬酸钠Na3Cit的比例为0.45-0.5g：25-30mL：0.07-0.08g。
5.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中透析具体为：用截留分子量为5000的透析袋透析12小时，需每次透析所用蒸馏水2L，共换水1次，然后去除上清液；然后继续用截留分子量为5000的透析袋透析3天，其中每次透析所用蒸馏水2L，共换水8次。
6.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中EDC、NHS、Mal-PEG-NH2的投料摩尔比为5-10：5-10：0.5-1，Mal-PEG-NH2和Mn3O4-Cit的投料质量比为1-1.2：5-6。
7.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中Mal-PEG-NH2的平均分子量为2000。
8.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中L-Cysteine与Mn3O4-Cit-PEG的摩尔比为1.5-2：0.8-1。
9.根据权利要求2所述的一种两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)中透析均为用截留分子量为5000的透析袋透析3天，其中每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
10.根据权利要求1所述的两性离子修饰的多功能Mn3O4纳米颗粒磁共振成像造影剂在制备用于肿瘤模型早期诊断的磁共振成像造影剂中的应用。
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