CN107343961A - 一种基于rgd多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：(1)制备RGD‑PEG‑COOH；(2)制备PEI‑DTPA；(3)制备PEI‑DTPA‑mPEG；(4)制备PEI‑DTPA‑mPEG‑(PEG‑RGD)；(5)制备RGD‑Au PENPs；(6)制备RGD‑99mTc@Au PENPs。本发明制备过程简单，实验条件为常温常压；采用价廉易得的聚乙烯亚胺分子为载体，降低了材料的成本，所制备得到的SPECT/CT双模态纳米探针具有良好的生物相容性，对原位肝癌具有良好的靶向SPECT和CT成像效果，为发展新型的、廉价的多功能纳米造影剂开辟了新的思路。

Description

一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备 方法
技术领域
本发明属于纳米造影剂领域，特别涉及一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法。
背景技术
Computer Tomography(CT)成像技术具有较高的空间分辨率，较短的图像采集时间，并能提供高分辨的3D断层信息，但是自身存在软组织分辨率差、较高的放射性辐射等缺陷。Position Emission Tomography(PET)和Single-Photon Emission ComputedTomography(SPECT)成像可获得肿瘤部位的生理生化信息，但是对于肿瘤部位的解剖信息很难获得较高的分辨率。鉴于每种成像模式都有其自身不足之处，单一的成像模式已经不能满足对疾病精准诊断的需要。因此，结合两种或者两种以上的成像模式，实现功能成像(PET或者SPECT)与结构成像(CT或者Magnetic Resonance Imaging(MRI))的有机结合是目前疾病诊断的发展趋势之一。
发展一种新型的、多功能的SPECT/CT双模态成像造影剂，可以结合CT和SPECT两种成像技术各自的优点从而提高疾病诊断的准确度，同时可以克服传统医用CT或SPECT成像造影剂的缺陷，如成像时间短、存在肾脏毒性等。这对于疾病的诊断尤其是癌症的早期诊断具有重大意义，它一方面减少造影剂对病患的毒副作用，另一方面可以提供更加全面而清晰的诊断信息。
超支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI，内部有疏水的空腔，可以用来稳定金属或金属氧化物、药物分子等(Sun et al.,Chem.Commun.2011,47(13),3817-3819)。PEI表面富有氨基为材料的功能化修饰提供了可能。Zhou等用聚乙二醇化的PEI包裹AuNPs用于血池和肿瘤CT成像(B.Zhou et al.,ACS Appl.Mater.Interfaces2014,6,17190-17199)。Li等用外围包裹AuNPs的聚乙二醇化的PEI稳定Fe3O4纳米颗粒用于CT/MR双模态成像(J.Li et al.,ACS Appl.Mater.Interfaces 2013,5,10357-10366)。Li等还发现了用透明质酸修饰的表面含有金星的PEI稳定的Fe3O4纳米颗粒用于CT成像、MR成像和光热治疗(J.Li et al.，Biomaterials 2015,38,10-21)。
检索国内外有关SPECT/CT双模态成像造影剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于超支化聚乙烯亚胺分子的SPECT/CT双模态成像纳米探针的制备与肿瘤诊断应用方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件为常温常压；采用价廉易得的聚乙烯亚胺分子为载体，降低了材料的成本，所制备得到的SPECT/CT双模态纳米探针具有良好的生物相容性，对原位肝癌具有良好的靶向SPECT和CT成像效果，为发展新型的、廉价的多功能纳米造影剂开辟了新的思路。
本发明的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：
(1)在一端氨基、另一端羧基的聚乙二醇NH2-PEG-COOH溶液中加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶液中反应8-12h，再把RGD多肽溶液逐滴加入已活化的NH2-PEG-COOH中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得RGD-PEG-COOH；
(2)在PEI溶液中逐滴加入二乙烯五乙酸盐DTPA溶液，搅拌反应20-30h，冷冻干燥，即得PEI-DTPA；
(3)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；随后将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得PEI-DTPA-mPEG；
(4)在RGD-PEG-COOH溶液中加入EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA-mPEG溶液中，搅拌反应2-4d，溶液，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化聚乙烯亚胺分子，标记为PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)；
(5)在PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2-4h；然后加入三乙胺N(C2H5)3搅拌20-40min，再加入乙酸酐Ac2O搅拌反应20-30h，透析，冷冻干燥，即得RGD多肽修饰的金纳米颗粒，标记为RGD-Au PENPs；(6)将RGD-Au PENPs溶液中加入SnCl2溶液搅拌5-10min，然后再加入无菌放射性高鍀酸盐溶液并混合反应5-10min，纯化分离，得到螯合核素99mTc的金纳米颗粒，标记为RGD-99mTc@AuPENPs，即为RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针。
所述步骤(1)中的RGD与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；RGD的分子量为706.67g/mol，浓度为4-6mg/mL，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的浓度为6-10mg/mL，NH2-PEG-COOH的分子量为2000g/mol，浓度为3-5mg/mL。
所述步骤(1)中的透析膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为1000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d。
所述步骤(2)中的DTPA与PEI的摩尔比为10:1；DTPA的分子量为357.32g/mol，DTPA溶液的浓度为20-30mg/mL，PEI的浓度为3-5mg/mL。
所述步骤(3)中的EDC·HCl与mPEG-COOH的摩尔比为10:1，NHS与mPEG–COOH的摩尔比为10:1，mPEG-COOH与PEI-DTPA的摩尔比为20:1；mPEG-COOH的分子量为2000g/mol，mPEG-COOH溶液的浓度为3-5mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，PEI-DTPA溶液的浓度为2-4mg/mL。
所述步骤(4)中的EDC·HCl与RGD-PEG-COOH的摩尔比为10:1，NHS与RGD-PEG-COOH的摩尔比为10:1，RGD-PEG-COOH与PEI-DTPA-mPEG的摩尔比为10:1；RGD-PEG-COOH溶液的浓度为3-5mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，PEI-DTPA-mPEG溶液的浓度为2-4mg/mL。
所述步骤(2)-(4)中的透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000-14000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d。
所述步骤(5)中的HAuCl4的浓度为5-10mg/mL，NaBH4的浓度为3-6mg/mL，NaBH4溶液的溶剂为冰水。
所述步骤(5)中的HAuCl4与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为200:1，NaBH4与HAuCl4的摩尔比为5:1，N(C2H5)3与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为3288:1，Ac2O与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为2740:1。
所述步骤(5)中的透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000-14000，在去离子水中透析2-3d。
所述步骤(6)中的RGD-Au PENPs溶液的浓度为0.1-0.3mg/mL，SnCl2溶液的浓度为0.03-0.06mg/mL，无菌放射性高鍀酸盐溶液的体积为0.3-0.6mL，无菌放射性高鍀酸盐的浓度为600-800MBq/mL。
所述步骤(6)中制备的RGD-99mTc@Au PENPs用于对原位肝肿瘤的靶向SPECT/CT双模态诊断。
有益效果
(1)本发明制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，采用价廉易得的PEI高分子为基础平台，通过在其内部包裹金纳米颗粒用于CT成像，对其表面修饰的DTPA分子标记99mTc用于SPECT成像，可以实现CT/SPECT双模态造影，具有很好的使用价值；
(2)本发明制备得到的SPECT/CT双模态纳米探针具有良好的CT/SPECT成像效果，为新型多功能CT/SPECT造影剂的开发奠定了良好的基础。
附图说明
图1为本发明制备RGD-99mTc@Au PENPs的反应流程图；
图2为RGD-PEG-COOH(a)、PEI-DTPA(b)、PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)(c)、RGD-AuPENPs(d)核磁共振氢谱图；
图3为本发明制备的Au PENPs和RGD-Au PENPs的紫外吸收光谱图；
图4为本发明制备的Au PENPs(a,b,c)和RGD-Au PENPs(d,e,f)的TEM图片(a,d)、高分辨(b,e)和粒径分布直方图(c,f)；
图5为本发明制备的RGD-Au PENPs和欧乃派克的CT成像图(a)以及X-射线衰减与金或碘的浓度的线性关系图(b)；
图6为CCK-8法测定的HCC-LM3细胞与不同浓度的RGD-Au PENPs共培养24h后的细胞存活率；
图7为HCC-LM3细胞与不同浓度的RGD-Au PENPs(金的浓度：0μM(a)，25μM(b)，50μM(c)，100μM(d)，150μM(e)，200μM(f))共培养24h后的细胞形态；
图8为HCC-LM3细胞与不同浓度的Au PENPs和RGD-Au PENPs共培养4h后，细胞吞噬的材料量(**p<0.001，***p<0.001)；
图9为尾静脉注射Au PENPs或RGD-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)的接种原位肝肿瘤裸鼠(20-25g)的CT成像图(a，黑色箭头指向肝肿瘤部位，白色尖头指向正常肝组织部位)，(b)为接有肝肿瘤裸鼠的解剖图，(c)为肿瘤部位的CT信号值；
图10为制备的RGD-99mTc@Au PENPs PBS溶液放置0(a),1h(b),4h(c)和8h(d)的体外放射稳定性数据；
图11为制备的99mTc@Au PENPs PBS溶液放置0(a),1h(b),4h(c)和8h(d)的体外放射稳定性数据；
图12为尾静脉注射99mTc@Au PENPs或RGD-99mTc@Au PENPs(600 Ci，150μL，PBS溶剂)的接种原位肝肿瘤裸鼠体(20-25g)的SPECT成像图(a，圆圈代表肝肿瘤部位)和肿瘤部位与肌肉部位的SPECT信号比值(b)；
图13为尾静脉注射Au PENPs或RGD-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)24h后小鼠主要器官中金元素的组织分布图；
图14为尾静脉注射PBS(100L，作为对照组)或RGD-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)30天后小鼠主要器官的切片H&E染色图(标尺为200μm)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)在NH2-PEG-COOH溶液(20mg,10mL DMSO)中加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶液(3.08mg,5mL DMSO)反应8h，使其活化，再把RGD多肽溶液(7.07mg,5mL DMSO)逐滴加入已活化的NH2-PEG-COOH中，搅拌反应3d，透析(透析膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为1000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d)，冷冻干燥，即得到RGD-PEG-COOH；
(2)在PEI溶液(100mg,10mL DMSO)中逐滴加入DTPA溶液(14.29mg,5mL DMSO)，搅拌反应24h，透析(透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d)，冷冻干燥，即得到PEI-DTPA；
(3)在mPEG-COOH溶液(20mg,10mL DMSO)中加入EDC·HCl的溶液(19.2mg,10mLDMSO)，室温搅拌30min，然后加入NHS溶液(11.5mg,7mL DMSO)继续搅拌3h，得到混合溶液；将此混合溶液逐滴加入PEI-DTPA溶液(28.4mg,10mL DMSO)中，搅拌反应3d，透析(透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d)，冷冻干燥，即得到PEI-DTPA-mPEG；
(4)在RGD-PEG-COOH溶液(50mg,20mL DMSO)中加入EDC·HCl溶液(38.3mg,10mLDMSO)，室温搅拌30min，然后加入NHS溶液(23mg,10mL DMSO)继续搅拌3h，得到混合溶液；将此混合溶液逐滴加入PEI-DTPA-mPEG溶液(117.2mg,20mL DMSO)中，搅拌反应3d，透析(透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000，先在PBS中透析1d，再在去离子水中透析2d)，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化聚乙烯亚胺分子，标记为PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)；
(5)在上述PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)水溶液(76.9mg,200mL)中加入HAuCl4溶液(8.24mL,10mg/mL)搅拌30min，再加入NaBH4溶液(37.83mg,10mL水)，继续搅拌3h，再加入三乙胺N(C2H5)3(308μL)搅拌20min，然后加入乙酸酐Ac2O(257.2μL)，搅拌反应24h，透析(透析膜为纤维素透析膜，MWCO为8000，在去离子水中透析2d)，冷冻干燥，即得到RGD多肽修饰的金纳米颗粒，标记为RGD-Au PENPs；
(6)将上述RGD-Au PENPs溶液(1mg/mL，3mL PBS)中加入SnCl2溶液(50μg/mL，2mL)，搅拌8min，然后再加入无菌放射性高鍀酸盐溶液(700MBq/mL，1mL)并迅速混合反应5min，采用PD-10脱盐色谱柱纯化分离，即得螯合核素99mTc的金纳米颗粒，标记为RGD-99mTc@Au PENPs。
见图2a，3.4-3.6ppm是PEG的结构单元的亚甲基质子信号，5.5-7.5ppm是RGD苯环上的质子信号，根据它们积分面积之比，计算出每个PEG链接了0.78个RGD分子。同样的，每个PEI分子链接22.4个PEG，5.2个RGD分子，和9.5个DTPA分子(见图2b)。RGD-Au PENPs经过乙酰化反应之后，在1.9-2.1ppm之间出现两个峰，1.9ppm是二级酰胺的乙酰基的甲基质子峰，2.05ppm是三级酰胺的乙酰基的甲基质子峰(见图2d)。通常认为伯胺比仲胺更易乙酰化，基于部分仲胺已发生乙酰化，所以PEI表面氨基已基本全部被乙酰。另外，乙酰化的RGD-Au PENPs的表面电势为9.13mV(见表1)，基本显中性，也证实了PEI表面氨基基本全部被乙酰。制备的Au PENPs和RGD-Au PENPs的金纳米颗粒的SPR峰都位于520nm左右，见图3，说明成功制备了金纳米颗粒。TEM测试结果显示了Au PENPs和RGD-AuPENPs分布均匀，平均粒径分别为2.2nm和2.6nm，均是fcc晶体结构，见图4。制备的AuPENPs和RGD-Au PENPs的水合粒径分别为95.7nm和138nm。水合粒径大于TEM测试粒径是因为：水合粒径测试的是多个AuPENPs团簇的粒径，而TEM测试的是单独的金核的粒径。CT成像测试结果表明制备的RGD-AuPENPs的X-射线衰减强度随金浓度的提高呈线性上升趋势，同时在相同金或碘的浓度下比临床上用的碘剂(Omnipaque)具有更高X-射线衰减强度，表现出良好的X-射线衰减特性(见图5)。
表1 不同金纳米颗粒水溶液的表面电势和水合粒径
样品 表面电势(mV) 水合粒径(nm)
RGD-Au PENPs 9.13±0.16 138.0±11.4
Au PENPs 12.05±0.52 95.7±21.0
实施例2
将每孔8000个HCC-LM3细胞(人高转移肝癌细胞)种植于96孔板中培养过夜。倒掉原培养基，加入含不同浓度的RGD-Au PENPs的培养液再共培养24小时。倒掉培养液，用PBS洗2遍，加入含CCK-8试剂的培养液(每孔20μL CCK-8试剂，180μL完全培养液)再孵育3h。之后用酶标仪上检测各孔在λ＝450nm处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以PBS处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。图6和7结果显示，与空白对照组相比，经不同浓度的RGD-Au PENPs处理的实验组细胞活性均在80％以上，说明RGD-AuPENPs没有明显的细胞毒性。
实施例3
将每孔1.5×106HCC-LM3细胞种植于6孔板中，加入含有不同浓度的RGD-Au PENPs和Au PENPs的培养液共培养4小时。之后倒掉培养液，经PBS洗3次。然后用胰酶消化、离心、收集好的细胞团用王水溶解消化，用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-OES)分别测量RGD-Au PENPs和Au PENPs处理的细胞吞噬的Au的含量，见图8。随着材料浓度的增加，细胞吞噬的材料也越多，并且在相同浓度下RGD-Au PENPs处理的细胞比Au PENPs处理的细胞吞噬更多的材料，说明本发明制备的RGD-Au PENPs能够被细胞吞噬，并且靶向识别αvβ3整合素高表达的细胞。
实施例4
将RGD-Au PENPs或Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的接有原位肝肿瘤的裸鼠体内，通过CT扫描检测得到不同时间点的CT成像图(图9)。从图中能清楚地看见正常肝组织的亮度比肝肿瘤部位要亮，是因为PEG修饰的纳米材料主要通过肝和脾代谢，然后被其他组织吸收和代谢。同时，肝肿瘤部位的CT值随给药时间而递减，并在相同的给药时间里，静脉注射RGD-Au PENPs的裸鼠的肝肿瘤部位的CT值比静脉注射Au PENPs的裸鼠的要高，说明RGD修饰的金纳米颗粒在体内具有良好的靶向性。
实施例5
采用PD-10脱盐色谱柱纯化分离纯化标记产物。另外，测试了标记前后放射剂量的变化，计算出99mTc在RGD-Au PENPs(30％)和Au PENPs(31％)上的标记量。标记产物的稳定性通过测试其在PBS中置放0-8小时的变化情况。见图10和11，体外放射稳定性数据显示，RGD-99mTc@Au PENPs和99mTc@Au PENPs在PBS中暴露0-6小时都具有良好的稳定性。说明制备的RGD-99mTc@Au PENPs和99mTc@Au PENPs里没有游离的99mTc存在。稳定性试验结果进一步确保了制备得到的纳米探针能应用于体内SPECT成像。
实施例6
将RGD-99mTc@Au PENPs或99mTc@Au PENPs(600μCi99mTc，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的接有原位肝肿瘤的裸鼠体内，通过小动物SPECT扫描仪检测到不同时间点的SPECT成像图(图12)。从图中能清楚地看见正常肝组织的亮度比肝肿瘤部位要亮。同时，肝肿瘤部位的SPECT信号强度随给药时间而递减，并在相同的给药时间里，静脉注射RGD-99mTc@Au PENPs的裸鼠的肝肿瘤部位的SPECT信号强度比静脉注射99mTc@Au PENPs的裸鼠的要高，说明RGD修饰的金纳米颗粒在体内具有良好的靶向性。
实施例7
将RGD-Au PENPs或Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的接有原位肝肿瘤的裸鼠体内，给药24h后将其麻醉处死，取其心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，然后用王水消化溶解，用ICP-OES测其Au的含量，见图13，说明本发明制备的材料主要通过脾、肝、肾代谢。
将RGD-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，30天后将其麻醉处死，取其心、肝、脾、肺和肾。通过石蜡切片和H&E(苏木精-伊红)染色，见图14，本发明制备的材料不会对组织器官造成破坏，和对照组相比，组织形貌无明显变化。说明本发明制备的材料可以在小鼠体内代谢，体内无残留，不会影响小鼠的组织器官，具有良好的器官相容性。

Claims (9)

1.一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，包括：
(1)在一端氨基、另一端羧基的聚乙二醇NH2-PEG-COOH溶液中加入6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶液中反应8-12h，再把RGD多肽溶液逐滴加入已活化的NH2-PEG-COOH中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得RGD-PEG-COOH；
(2)在PEI溶液中逐滴加入二乙烯五乙酸盐DTPA溶液，搅拌反应20-30h透析，冷冻干燥，即得PEI-DTPA；
(3)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；随后将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA溶液中，搅拌反应2-4d，透析，冷冻干燥，即得PEI-DTPA-mPEG；
(4)在RGD-PEG-COOH溶液中加入EDC·HCl溶液，室温搅拌15-30min，然后加入NHS溶液继续搅拌2-3h，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入PEI-DTPA-mPEG溶液中，搅拌反应2-4d，溶液，透析，冷冻干燥，得到RGD靶向的功能化聚乙烯亚胺分子，标记为PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)；
(5)在PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2-4h；然后加入三乙胺N(C2H5)3搅拌20-40min，再加入乙酸酐Ac2O搅拌反应20-30h，透析，冷冻干燥，即得RGD多肽修饰的金纳米颗粒，标记为RGD-Au PENPs；(6)将RGD-Au PENPs溶液中加入SnCl2溶液搅拌5-10min，然后再加入无菌放射性高鍀酸盐溶液并混合反应5-10min，纯化分离，得到螯合核素99mTc的金纳米颗粒，标记为RGD-99mTc@Au PENPs，即为RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针。
2.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的RGD与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:1；RGD的分子量为706.67g/mol，浓度为4-6mg/mL，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的浓度为6-10mg/mL，NH2-PEG-COOH的分子量为2000g/mol，浓度为3-5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的DTPA与PEI的摩尔比为10:1；DTPA的分子量为357.32g/mol，DTPA溶液的浓度为20-30mg/mL，PEI的浓度为3-5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的EDC·HCl与mPEG-COOH的摩尔比为10:1，NHS与mPEG–COOH的摩尔比为10:1，mPEG-COOH与PEI-DTPA的摩尔比为20:1；mPEG-COOH的分子量为2000g/mol，mPEG-COOH溶液的浓度为3-5mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，PEI-DTPA溶液的浓度为2-4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的EDC·HCl与RGD-PEG-COOH的摩尔比为10:1，NHS与RGD-PEG-COOH的摩尔比为10:1，RGD-PEG-COOH与PEI-DTPA-mPEG的摩尔比为10:1；RGD-PEG-COOH溶液的浓度为3-5mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，PEI-DTPA-mPEG溶液的浓度为2-4mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的HAuCl4的浓度为5-10mg/mL，NaBH4的浓度为3-6mg/mL，NaBH4溶液的溶剂为冰水。
7.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的HAuCl4与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为200:1，NaBH4与HAuCl4的摩尔比为5:1，N(C2H5)3与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为3288:1，Ac2O与PEI-DTPA-mPEG-(PEG-RGD)的摩尔比为2740:1。
8.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中的RGD-Au PENPs溶液的浓度为0.1-0.3mg/mL，SnCl2溶液的浓度为0.03-0.06mg/mL，无菌放射性高鍀酸盐溶液的体积为0.3-0.6mL，无菌放射性高鍀酸盐的浓度为600-800MBq/mL。
9.根据权利要求1所述的一种基于RGD多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中制备的RGD-99mTc@Au PENPs用于对原位肝肿瘤的靶向SPECT/CT双模态诊断。
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