CN108553653A - 一种具有rgd靶向功能基于g2.nh2的锰基mr/ct双模态成像造影剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，包括：将G2.NH2和NOTA混合反应，得到G2‑NOTA；将COOH‑PEG‑MAL和RGD混合反应，得到COOH‑PEG‑RGD；活化处理后，与G2‑NOTA反应，得到G2‑NOTA‑PEG‑RGD；与氯金酸溶液、预冷的硼氢化钠溶液反应，得到G2‑NOTA‑PEG‑RGD@Au；与MnSO4混合反应，即得。本发明制备的MR/CT造影剂具备良好的胶体稳定性，优异的生物相容性，较长的血液循环时间以及较高的弛豫率，对小鼠原位脑胶质瘤具有特异性靶向作用，为发展一种新型的双模态纳米造影剂提供了良好的思路。

Description

一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造 影剂的制备方法
技术领域
本发明属于造影剂技术领域，特别涉及一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法。
背景技术
近年来癌症已成为人类生命健康的一大威胁，数据显示，占世界人口五分之一的中国，每年大约有22％的新增癌症病例和27％的癌症死亡发生，几乎平均每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤，所以寻找精确诊断和有效治疗癌症的方法是科学家们一直努力的课题。而作为近年来蓬勃发展的一门新兴学科，分子影像学通过对机体的生理、病理变化过程进行检测，再对图像进行处理，能够有效获取分子和细胞水平上活体组织的信息，这一技术的发展对未来癌症的检测及其治疗至关重要。在分子影像技术中，CT是最为常用的成像技术之一。基于正常组织和病变组织之间的X射线吸收差异，CT成像能够提供解剖结构的高空间密度分辨率和有效三维断层图像信息。MR成像技术由于其优异的分辨率和断层分辨能力而被广泛用于临床诊断中。由于每种成像模式都有其自身的优点和缺点，因此在单一纳米颗粒系统中纳入两种不同类型的成像元件是非常重要的，这使得双模CT/MR成像应用成为可能。
CT成像是一种解剖性影像诊断技术，由于其具有众多优势——采集图像时间短、空间分辨率高、价格低廉、具有灵活重建3D图像的技术等，是目前为止应用最广泛的分子影像技术。磁共振成像(MRI)也是解剖性影像诊断技术，其对软组织有极好的分辨力，并且对人体没有电离辐射损伤。各种纳米粒子造影剂已被开发作为一种新型的CT造影剂。Chen等(Chen et al.,Anal Chem,2015,87(7):3949-3956)开发了一种基于第五代树状大分子纳米平台，在树状大分子内部包裹Au NPs，并通过树状大分子外围修饰的Gd螯合剂负载Gd(III)离子。形成的载有Gd(III)的树状大分子包裹的Au纳米颗粒能够用于动物的双模态CT/MR成像的造影剂(Au纳米颗粒用于CT成像，Gd离子用于T1加权磁共振成像)。然而，如果Gd离子从纳米颗粒或复合物中脱离，则可能会具有高毒性从而导致严重的肾损伤，如肾系统性纤维化。由于同样高度顺磁化的锰离子在细胞内能够安全的代谢，并且只要锰离子在血液中保持螯合的状态，则与金属转移和生物滞留相关的细胞毒性问题可大大降低，因此Mn离子可应用于MR成像。目前，已有不同的分子探针与Mn进行结合以促进探针对癌细胞的靶向递送和靶向MR成像(Yang et al.,Nanotechnology,2013,24(47):475103)。
低代数的树状大分子因其代数低而具有开放式的结构以及表面基团较少等特点，且其与高代数树状大分子相比，合成过程较为简单，价格更为低廉，更易于产业化。Cao等(Cao et al.,J.Mater.Chem.B,2015,3,286-295)制备了第二代聚酰胺-胺树状大分子包裹金纳米颗粒具有乳糖酸靶向肝癌功能的CT纳米造影剂，具有很好的特异性靶向功能和良好的CT成像效果。Li等(Li et al.,ACS Appl Mater Interfaces,2016,8(31):19883-19891)制备了具有叶酸靶向功能的标记放射性核素99mTc的第二代聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米颗粒作为SPECT/CT双模态纳米造影剂，其对于体内异种移植瘤具有很好的特异性靶向功能和良好的SPECT/CT成像效果。
检索国内外有关MR/CT双模态造影剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现修饰了螯合剂NOTA和多肽RGD的第二代聚酰胺-胺树状大分子包裹了金纳米颗粒并螯合了二价锰离子的MR/CT双模态成像造影剂的制备及其在原位脑胶质瘤成像应用方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，该造影剂制备工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为环境友好材料，具有实施商业化的前景；对于小鼠体内原位脑胶质瘤具有良好的特异性靶向功能和良好的双模态MR/CT成像效果，可以达到更好的检测癌症的效果。
本发明的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，包括：
(1)将第二代聚酰胺-胺树状大分子G2.NH2和锰离子螯合剂NOTA分别溶于二甲基亚砜DMSO中，然后混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到螯合剂NOTA修饰的第二代聚酰胺-胺树状大分子G2-NOTA；其中G2.NH2和NOTA的摩尔比为1:5.0-5.3；
(2)将一端为羧基另一端为马来酰亚胺基团的聚乙二醇分子COOH-PEG-MAL和多肽RGD分别溶于DMSO中，然后混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到多肽RGD修饰的聚乙二醇分子COOH-PEG-RGD；其中COOH-PEG-MAL和RGD的摩尔比为1:1.2-1.4；
(3)将步骤(2)得到的COOH-PEG-RGD溶于DMSO中，活化处理，得到活化后的COOH-PEG-RGD的DMSO溶液，逐滴加入到步骤(1)得到的G2-NOTA的DMSO溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD修饰的第二代聚酰胺-胺树状大分子G2-NOTA-PEG-RGD；其中COOH-PEG-RGD、G2-NOTA的摩尔比为9.5-10.0:1；
(4)将步骤(3)得到的G2-NOTA-PEG-RGD溶解于水中，加入氯金酸水溶液，搅拌反应，然后加入预冷的硼氢化钠水溶液，冰浴搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD修饰且包裹了金纳米颗粒的第二代聚酰胺-胺树状大分子G2-NOTA-PEG-RGD@Au；其中G2-NOTA-PEG-RGD、氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1:6-8:30-40；
(5)将步骤(4)得到的G2-NOTA-PEG-RGD@Au和MnSO4分别溶于水中，混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au；其中G2-NOTA-PEG-RGD@Au和MnSO4的摩尔比为1:1.3-1.5。
所述步骤(1)中混合搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为12～28h。
所述步骤(2)中混合搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为72～76h。
所述步骤(3)中COOH-PEG-RGD的DMSO溶液的浓度为5.0-7.0mg/mL；G2-NOTA的DMSO溶液的浓度为4.0-5.0mg/mL。
所述步骤(3)中活化处理的工艺条件为：向COOH-PEG-RGD的DMSO溶液中首先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的DMSO溶液活化0.5h，然后逐滴加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS的DMSO溶液继续活化3h即得；其中COOH-PEG-RGD、EDC、NHS的摩尔比为10:50-60:50-60。
所述步骤(3)中搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为72～84h。
所述步骤(4)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌为磁力搅拌，反应温度为室温，反应时间为20～30min。
所述步骤(4)中冰浴搅拌反应的时间为3～5h。
所述步骤(5)中混合搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为24～28h。
所述步骤(1)～(5)中透析的工艺条件为：采用截留分子量为1000～3000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
本发明利用第二代聚酰胺-胺树状大分子的特定结构和性质，将二价锰离子螯合剂NOTA接枝在树状大分子表面以螯合Mn2+实现MR成像，然后将COOH-PEG-RGD接枝在树状大分子表面既可以提高其生物相容性，延长血液循环时间，又使其具备对αvβ3整合素受体特异性靶向的功能，最后在树状大分子内部包裹纳米金颗粒用于CT成像，从而制备出优良性能的MR/CT双模态造影剂，实现不同成像技术的造影剂需求。
有益效果
(1)本发明采用温和的反应条件制备G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au纳米颗粒用于MR/CT双模态成像造影剂，制备工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为环境友好材料，具有实施商业化的前景；
(2)本发明的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水，不会出现团聚或者沉淀现象，在体内实验中呈现出良好的MR/CT成像效果，为多功能造影剂的开发打下了良好的基础；
(3)本发明的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au颗粒对大鼠神经胶质瘤细胞与小鼠原位脑胶质瘤具有较好的特异性靶向作用，同时具有MR和CT的成像优势，是一种有潜力的双模态成像新型造影剂。
附图说明
图1为实施例1和对比例1制备的中间产物的1H NMR，其中(a)为G2-NOTA，(b)为COOH-PEG-RGD，(c)为G2-NOTA-mPEG，(d)为G2-NOTA-PEG-RGD；
图2为对比例1中G2-NOTA(Mn)-mPEG和实施例1中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD的UV-Vis谱图；
图3为对比例1中G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au和实施例1中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au纳米颗粒的TEM图(a，c)和粒径分布图(b，d)；
图4为实施例3中G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au和G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au纳米颗粒在锰浓度为0.1到1.6mM范围内通过MR成像仪扫描得到的T1加权成像图片和1/T1与Mn浓度的线性关系图；
图5为实施例4中CCK-8法测得C6细胞经过PBS缓冲液、G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au在锰浓度为25到400μM下处理24小时后的细胞活力；
图6为实施例4中C6细胞经过PBS缓冲液、G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au在锰浓度分别为25到400μM下处理24小时后的荧光显微镜细胞形貌图；
图7为实施例5中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au颗粒与αvβ3整合素高表达的C6细胞共培养4小时后，细胞吞噬的锰含量；
图8为实施例6中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au分别尾静脉注射到种有原位脑胶质瘤的裸鼠体内后不同时间点，通过CT成像仪扫描测得的CT图像；
图9为实施例6中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au分别尾静脉注射到种有原位脑胶质瘤的裸鼠体内后不同时间点，通过CT成像仪扫描测得的CT图像信号值；
图10为实施例7中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au分别尾静脉注射到种有原位脑胶质瘤的裸鼠体内后不同时间点，通过MR成像仪扫描测得的MR图像；
图11为实施例7中G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au分别尾静脉注射到种有原位脑胶质瘤的裸鼠体内后不同时间点，通过MR成像仪扫描测得的MR图像信号值；
图12为本发明制备G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au的反应示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取30.0mg G2.NH2和30.4mg NOTA分别分散在5mL和4mL DMSO中，完全溶解后，于室温下混合搅拌反应24h，得到产物G2-NOTA的混合溶液，之后用截留分子量为1000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，真空冷冻干燥，得到G2-NOTA；其中G2.NH2和NOTA的摩尔比为1:5。
(2)将75.0mg COOH-PEG-MAL和25.0mg RGD分别溶解于6mL和3mL DMSO中，完全溶解后，于室温下混合搅拌反应74h，反应结束后，用截留分子量为1000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，真空冷冻干燥，得到RGD-PEG-COOH；其中COOH-PEG-MAL和RGD的摩尔比为1:1.2。
(3)将90mg步骤(2)得到的COOH-PEG-RGD溶于15mL DMSO中，边搅拌边加入5mL EDC的DMSO溶液(15.5mg/mL)活化0.5h，紧接着逐滴加入5mL NHS的DMSO溶液(9.5mg/mL)活化3h，然后逐滴加入到4mL步骤(1)得到G2-NOTA的DMSO溶液(5.0mg/mL)中，于室温下搅拌反应72h，反应结束后，用截留分子量为3000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，冷冻干燥，得到G2-NOTA-PEG-RGD；其中COOH-PEG-RGD、EDC、NHS与G2-NOTA的摩尔比为10:50:50:1。
(4)将80mg步骤(3)得到的G2-NOTA-PEG-RGD溶于80mL超纯水中，边搅拌边加入960.43μL氯金酸水溶液(10mg/mL)，室温磁力搅拌30分钟后，加入233.16μL预冷的硼氢化钠水溶液(19mg/mL)，冰浴搅拌反应3小时，反应结束后，用截留分子量为1000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，冷冻干燥，得到G2-NOTA-PEG-RGD@Au；其中硼氢化钠、氯金酸和G2-NOTA-PEG-RGD的摩尔比为30:6:1。
(5)将30mg步骤(4)得到的G2-NOTA-PEG-RGD@Au和MnSO4(G2-NOTA-PEG-RGD@Au和MnSO4的摩尔比为1:1.3)分别溶于水中，室温混合搅拌反应1天，反应结束后，用截留分子量为1000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，冷冻干燥，得到具有RGD靶向功能的基于第二代聚酰胺-胺树状大分子的锰基MR/CT双模态成像造影剂G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au。
本实施例制备G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au的反应示意图如图12所示。
对比例1
(1)将90mg聚乙二醇(Mw＝2000，mPEG-COOH)溶解于10mL DMSO中，边搅拌边逐滴加入5mL EDC的DMSO溶液(15.5mg/mL)活化30分钟，紧接着逐滴加入5mL NHS的DMSO溶液(9.5mg/mL)活化3小时，然后将20mg实施例1中(1)所得G2-NOTA溶于5mL超纯水中，并将活化后的聚乙二醇溶液逐滴加入到其中，于室温条件下搅拌反应72小时，然后用截留分子量为2000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，冷冻干燥，得到修饰了聚乙二醇的树状大分子G2-NOTA-mPEG。
(2)将72mg步骤(1)制得的G2-NOTA-mPEG溶于72mL超纯水中，边搅拌边加入氯金酸水溶液970.75μL(10mg/mL)，室温磁力搅拌30分钟后，加入235.70μL预冷的硼氢化钠溶液(19mg/mL)，冰浴搅拌反应3小时，反应结束后，用截留分子量为2000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，冷冻干燥，得到包裹金纳米颗粒的修饰了聚乙二醇的树状大分子G2-NOTA-mPEG@Au。
(3)将30mg步骤(2)制得的G2-NOTA-mPEG@Au和MnSO4(其中G2-NOTA-mPEG@Au和MnSO4的摩尔比为1:1.3)分别溶于水中，室温混合搅拌反应1天，反应结束后，用截留分子量为1000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，冷冻干燥，得到非靶向的基于第二代聚酰胺-胺树状大分子的锰基MR/CT双模态成像造影剂G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au。
实施例2
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、高分辨透射电子显微镜(TEM)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)等方法表征材料的物理化学性质。
1H NMR测试：
对实施例1中制得的G2-NOTA进行1H NMR测试，谱图如图1(a)所示，在2.3-3.2ppm和3.3-3.4ppm的化学位移峰分别对应为G2.NH2和NOTA的特征峰。由积分面积计算可得，每个G2.NH2表面修饰了约3.6个NOTA。
对实施例1中制得的RGD-PEG-COOH进行1H NMR测试，谱图如图1(b)所示，出现在3.4-3.6ppm和7.1-7.3ppm的化学位移峰分别对应为聚乙二醇和RGD的特征峰。由积分面积计算可得，每个聚乙二醇表面修饰了约0.8个RGD分子。
对实施例1中制得的靶向G2-NOTA-PEG-RGD进行1H NMR测试，谱图如图1(d)所示，出现在3.4-3.6ppm和2.3-3.2ppm的化学位移峰分别对应为聚乙二醇和树状大分子的特征峰，7.1-7.3ppm的化学位移峰对应为RGD的特征峰。由积分面积计算可得，每个树状大分子表面修饰了约7.5个RGD-PEG。
对对比例1中制得的非靶向G2-NOTA-mPEG进行1H NMR测试，谱图如图1(c)所示，出现在3.4-3.6ppm和2.3-3.2ppm的化学位移峰分别对应为聚乙二醇和树状大分子的特征峰。由积分面积计算可得，每个树状大分子表面修饰了约8.2个聚乙二醇分子。
UV-Vis测试：
对实施例1制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD和对比例1制得的非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG进行UV-Vis测试，结果如图2所示，可知G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD颗粒在500-550nm处存在紫外特征吸收峰，这表明本发明制备的G2-NOTA-PEG-RGD成功包裹了金纳米颗粒。
TEM测试：
对实施例1制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au进行TEM测试，TEM图和粒径分布图如3(c)和(d)所示，结果表明：制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布较窄，具有良好的水分散性，平均粒径为1.1nm。
对对比例1制得的非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au进行TEM测试，TEM图和粒径分布图如3(a)和(b)所示，结果表明：制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布较窄，具有良好的水分散性，平均粒径约1.2nm。
ICP-OES测试：
将实施例1制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au纳米颗粒和对比例1制得的非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au纳米颗粒在锰浓度为0.1到1.6mM范围内通过MR成像仪扫描得到的T1加权成像图片和1/T1与Mn浓度的线性关系如图4所示，结果表明：制备得到的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au中靶向纳米颗粒每个G2.NH2上载了3.2个Mn2+，对照材料非靶向纳米颗粒，每个G2.NH2上载了3.5个Mn2+。
实施例3
本发明通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和荧光倒置显微镜来评价材料的细胞相容性，最后利用体内MR/CT成像来表征制备的具有双模态造影功能的低代数树状大分子对原位脑胶质瘤模型的诊断效果。
取实施例1中制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和对比例1中制得的非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au材料，以蒸馏水为溶剂，配制Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的纳米颗粒水溶液，用T1磁共振成像仪测定两种材料的T1弛豫时间并且扫描MR成像图片。扫描参数为：重复时间(TR)＝4000ms，回波时间(TE)＝60ms，厚度＝0.6mm，分辨率＝156mm×156mm。测试结果如图4所示：本发明实施例1中制备得到的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au颗粒的弛豫时间倒数随着Mn浓度的增加(Mn浓度范围为0.1-1.6mM)而增加，并且呈现良好的线性关系。通过计算得，实施例1中所得G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au纳米颗粒的弛豫率为9.883mM-1s-1，对比例1中所得G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au金纳米颗粒的弛豫时间倒数随着Mn浓度的增加(Mn浓度范围为0.1-1.6mM)而增加，并且呈现良好的线性关系。通过计算得，G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au纳米颗粒的弛豫率为7.944mM-1s-1，表明所制备的两种金纳米颗粒均具备良好的潜在MR成像造影能力。
实施例4
取实施例1中制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au用无菌PBS缓冲液配置成锰浓度为4000μM的母液。另以同样方案准备对比例1中制得的非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au的样品溶液。取培养好的C6细胞种于96孔板中，按照1万细胞/孔的密度接种，每孔体积200μL。培养过夜后，加入各稀释梯度的样品，每孔锰终浓度分别为25、50、100、200、400μM，与细胞共培养24小时。每个梯度做5个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。随后用CCK-8法检测细胞活力，每孔加CCK-8溶液，37℃孵化4小时。之后用酶标仪检测450nm处吸光度。CCK-8测试结果如图5所示，表明，G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au纳米颗粒在此范围内都不显示出细胞毒性，细胞存活率均保持在92％以上，表现出良好的细胞相容性。
同样，取不同浓度的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au纳米材料(Mn浓度25、50、100、200、400μM)与C6细胞共培养24小时，以PBS缓冲液为对照。然后，将20μLCalcein-AM荧光染色试剂均匀分散于8mL无血清的培养基，向每个培养板孔中加入200μLCalcein-AM溶液，继续在37℃下染色15分钟，使用PBS缓冲液洗去Calcein-AM溶液，并在每个孔中加入200μL无血清的培养基，于荧光显微镜下观察，以验证制备得到的材料对细胞形态是否会产生影响。结果如图6所示，表明，不同浓度的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au处理24小时后的细胞形态和PBS缓冲液处理后的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的良好细胞相容性。
实施例5
取实施例1制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au用无菌PBS缓冲液配制成锰浓度为4000μM的母液，之后吸取培养好的C6细胞种于12孔板中，按照20万细胞/孔的密度接种，每孔体积为1mL。用DMEM培养基分别将母液稀释为Mn浓度25、50、100、200、400μM的溶液。加入上述稀释后的样品与αvβ3整合素受体高表达的C6细胞在37℃下共培养3小时。对比例1中制得非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au也用无菌PBS缓冲液配制成稀释为Mn浓度25、50、100、200、400μM的溶液与αvβ3整合素受体高表达的C6细胞在37℃下共培养3小时。以PBS缓冲液作为空白对照。培养结束后用PBS清洗3次，再胰酶消化离心后收集细胞，加入2mL王水消化24小时，然后通过ICP-OES检测细胞中Mn元素的吞噬量。如图7所示，结果显示，随着Mn浓度的提高，细胞对两种金纳米颗粒的吞噬量均逐渐增加。在研究浓度范围内，与G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au共培养的αvβ3整合素受体高表达的C6细胞对材料的吞噬量明显高于G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au对αvβ3整合素受体高表达的C6细胞的吞噬量，说明靶向分子RGD的修饰使得G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au对αvβ3整合素受体高表达的C6细胞有特异性靶向能力。
实施例6
取实施例1中制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au用无菌PBS缓冲液配制成金浓度为0.1M的溶液。选取4-6周的BALB/c裸鼠(15-20g)在无菌动物房中饲养一周后，将小鼠颅骨钻孔，把5×105个C6细胞的无血清DMEM培养液(体积为5μL)注射入内，建立小鼠原位脑胶质瘤模型，继续饲养3-4周，当肿瘤直径达到1.0-1.5mm时，肿瘤建模完成，即可用于CT扫描成像。对比例1中制得的非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au也用无菌PBS缓冲液配制成金浓度为0.1M的溶液。荷瘤裸鼠首先通过6％水合氯醛麻醉(0.10毫升/20克)，然后将制备的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au和G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au纳米颗粒溶于PBS溶液中([Au]＝0.1M,in 150μLPBS)，通过尾静脉注射进接有小鼠脑胶质瘤的裸鼠体内，随后，将裸鼠放在一个密闭的麻醉室内，通过CT成像仪扫描检测材料注射前、注射材料5、15、30、45和60分钟后的CT图像，并检测相应的CT信号值，体内肿瘤CT成像图和信号值结果分别如图8和9所示，表明，在注射G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au金纳米颗粒的PBS溶液后，小鼠肿瘤部位CT信号增强，在注射45分钟时，小鼠肿瘤部位CT信号达到最高，之后信号值便开始慢慢减弱，而注射非靶向材料的小鼠肿瘤部位CT图像信号变化较不明显，这些结果进一步验证了G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au金纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向成像效果，能成功应用于小鼠原位脑胶质瘤CT成像研究。
实施例7
取实施例1中制得的靶向G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au用无菌PBS缓冲液溶解(Mn质量为450μg，in 150μL PBS)。选取4-6周的BALB/c裸鼠(15-20g)在无菌动物房中饲养一周后，将小鼠颅骨钻孔，把5×105个C6细胞的无血清DMEM培养液(体积为5μL)注射入内，建立小鼠原位脑胶质瘤模型，继续饲养3-4周，当肿瘤直径达到1.0-1.5mm时，肿瘤建模完成，即可用于MR扫描成像。对比例1中制得得非靶向G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au也用无菌PBS缓冲液配制成相同锰浓度的溶液。荷瘤裸鼠首先通过6％水合氯醛麻醉(0.10毫升/20克)，然后将制备的G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au、G2-NOTA(Mn)-mPEG@Au纳米颗粒溶于PBS溶液中(Mn质量为450μg，in 150μL PBS)，通过尾静脉注射进接有小鼠脑胶质瘤的裸鼠体内，随后，将裸鼠放在一个密闭的麻醉室内，通过小动物MR成像仪扫描检测材料注射前、注射材料5、15、30、45、120和150分钟后的MR图像，并检测相应的MR信号值。扫描参数设置为：扫描序列参数为：重复时间(TR)＝300ms，回波时间(TE)＝8.6ms，厚度＝0.5mm，采集矩阵(matrix)＝256mm×256，视野(FOV)＝2.5×2.5cm2，翻转角度(FA)＝180°。体内肿瘤MR成像图和信号值结果分别如图10和11所示，表明，在注射G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au金纳米颗粒的PBS溶液后，小鼠肿瘤部位逐渐变亮，在注射45分钟时，小鼠肿瘤部位达到最亮的状态，此时小鼠肿瘤部位的MR成像信号强度达到峰值，之后信号强度便开始慢慢减弱，而注射非靶向材料的小鼠肿瘤部位在注射后45min时肿瘤部位即达到最亮，之后信号强度便慢慢减弱，表明G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au金纳米颗粒具有明显的肿瘤靶向MR诊断效果。这些结果进一步验证了G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au金纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向成像效果，能成功应用于小鼠原位脑胶质瘤MR肿瘤成像研究。

Claims (10)

1.一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，包括：
(1)将第二代聚酰胺-胺树状大分子G2.NH2和锰离子螯合剂NOTA分别溶于二甲基亚砜DMSO中，然后混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到螯合剂NOTA修饰的第二代聚酰胺-胺树状大分子G2-NOTA；其中G2.NH2和NOTA的摩尔比为1:5.0-5.3；
(2)将一端为羧基另一端为马来酰亚胺基团的聚乙二醇分子COOH-PEG-MAL和多肽RGD分别溶于DMSO中，然后混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到多肽RGD修饰的聚乙二醇分子COOH-PEG-RGD；其中COOH-PEG-MAL和RGD的摩尔比为1:1.2-1.4；
(3)将步骤(2)得到的COOH-PEG-RGD溶于DMSO中，活化处理，得到活化后的COOH-PEG-RGD的DMSO溶液，逐滴加入到步骤(1)得到的G2-NOTA的DMSO溶液中，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD修饰的第二代聚酰胺-胺树状大分子G2-NOTA-PEG-RGD；其中COOH-PEG-RGD、G2-NOTA的摩尔比为9.5-10.0:1；
(4)将步骤(3)得到的G2-NOTA-PEG-RGD溶解于水中，加入氯金酸水溶液，搅拌反应，然后加入预冷的硼氢化钠水溶液，冰浴搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到RGD修饰且包裹了金纳米颗粒的第二代聚酰胺-胺树状大分子G2-NOTA-PEG-RGD@Au；其中G2-NOTA-PEG-RGD、氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1:6-8:30-40；
(5)将步骤(4)得到的G2-NOTA-PEG-RGD@Au和MnSO4分别溶于水中，混合搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂G2-NOTA(Mn)-PEG-RGD@Au；其中G2-NOTA-PEG-RGD@Au和MnSO4的摩尔比为1:1.3-1.5。
2.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中混合搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为12～28h。
3.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中混合搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为72～76h。
4.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中COOH-PEG-RGD的DMSO溶液的浓度为5.0-7.0mg/mL；G2-NOTA的DMSO溶液的浓度为4.0-5.0mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中活化处理的工艺条件为：向COOH-PEG-RGD的DMSO溶液中首先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的DMSO溶液活化0.5h，然后逐滴加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS的DMSO溶液继续活化3h即得；其中COOH-PEG-RGD、EDC、NHS的摩尔比为10:50-60:50-60。
6.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为72～84h。
7.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌为磁力搅拌，反应温度为室温，反应时间为20～30min。
8.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中冰浴搅拌反应的时间为3～5h。
9.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中混合搅拌反应的工艺参数为：反应温度为室温，反应时间为24～28h。
10.根据权利要求1所述的一种具有RGD靶向功能基于G2.NH2的锰基MR/CT双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)～(5)中透析的工艺条件为：采用截留分子量为1000～3000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
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