CN104258422A - 一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的ct/mr双模态成像造影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，包括：(1)在超支化聚乙烯亚胺溶液中先加入EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液，再加入DOTA-NHS溶液，搅拌反应，得到功能化聚乙烯亚胺PEI-mPEG-DOTA；(2)在PEI-mPEG-DOTA水溶液中加入HAuCl4溶液，并用NaBH4溶液还原，然后加入Gd(NO3)3溶液继续搅拌，最后加入三乙胺和乙酸酐反应20-30h；(3)将步骤(2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得CT/MR双模态成像造影剂。本发明采用价廉易得的聚乙烯亚胺分子为载体，降低了材料的成本，所制备得到的CT/MR双模态成像造影剂具有良好的生物相容性，在体外和体内都有良好的CT和MR成像效果。
Description
技术领域
本发明属于纳米造影剂的制备领域，特别涉及一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法。
背景技术
CT成像技术由于其低廉的价格，较高的空间分辨率，较短的图像采集时间，并能提供高分辨的3D断层信息，使其成为临床上疾病诊断最为常见的一种工具，但是CT成像技术也存在一些亟需解决的问题，如软组织分辨率差、检测过程中存在较高的放射性辐射、传统含碘小分子CT造影剂高浓度使用时存在肾脏毒性等。MR成像技术是随着集成电路技术、超导体技术的发展而迅速发展起来的一种分子成像手段，具有较高的软组织分辨率和灵敏度，同时无电离辐射损伤，对人体友好。但是MR成像技术敏感性低、扫描时间长、空间分辨率低、测试费用昂贵，且临床上使用的钆剂也存在一定的肾脏毒性。
发展一种新型的、多功能的CT/MR双模态纳米造影剂，可以结合CT和MR两种成像技术的各自的优点从而提高疾病诊断的准确度，同时可以克服传统医用CT或MR成像造影剂的缺陷，如成像时间短，较高浓度存在肾脏毒性等。这对于疾病的诊断尤其是癌症的早期诊断具有重大意义，它一方面减少造影剂对患者的毒副作用，另一方面可以提供更加全面而清晰的诊断信息。
超支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI，内部有疏水的空腔，可以用来包裹金属离子，金属氧化物或其他小分子(Sun et al.，Chem.Commun.2011，47(13)，3817-3819)。同时由于表面氨基的正电荷性，PEI可以以阳离子聚电解质来发挥作用，对阴离子有机或无机材料有很强的吸引力。另外众多的氨基官能团还为各种重金属离子的配位作用提供了理想的配合基点，同时氨基的可修饰化作用为材料的进一步修饰提供了条件。这将为PEI在各种纳米粒子的合成与修饰提供广阔的空间。Li等用外围包裹AuNPs的聚乙二醇化的PEI稳定Fe3O4，制备的CT/MR(T2)双模态纳米探针具有良好的生物相容性和较长的血液循环半衰期，并且具有良好的CT和T2MR成像效果(Li et al.，ACS Appl.Mater.Interfaces 2013，5(20)，10357-10366)。同时Li等用表面修饰靶向试剂叶酸的多功能化PEI为高分子平台，稳定Fe3O4纳米颗粒，成功实现对肿瘤部位的靶向T2MR成像(Li et al.，Biomaterials 2013，134，8382-8292)。
检索国内外有关CT/MR双模态成像造影剂方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于超支化聚乙烯亚胺分子的包裹金纳米粒子、螯合钆离子的CT/MR双模态成像造影剂的制备与应用方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，本发明的制备过程简单，实验条件温和，为常温常压；本发明采用价廉易得的聚乙烯亚胺分子为载体，降低了材料的成本，所制备得到的CT/MR双模态成像造影剂具有良好的生物相容性，在体外和体内都有良好的CT和MR成像效果。这为发展新型的、廉价的多功能纳米造影剂提供了新的思路，为癌症的早期准确诊断提供了新的方法。
本发明的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，包括：
(1)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH的溶液中加入EDC·HCl的溶液，室温搅拌15-30min，然后加入NHS的溶液继续搅拌2-3h。将此混合溶液逐滴加入超支化聚乙烯亚胺(PEI)的溶液中反应2-4d。然后将DOTA溶液逐滴加入上混合液，继续搅拌反应1-2d，得到功能化聚乙烯亚胺分子溶液；透析，冷冻干燥，得到PEI-mPEG-DOTA；其中与EDC·HCl与mPEG-COOH的摩尔比为10∶1，EDC·HCl与NHS的摩尔比为1∶1，mPEG-COOH与PEI的摩尔比为30∶1，DOTA-NHS与PEI的摩尔比为10∶1；
(2)在上述PEI-DOTA-mPEG水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2-4h；然后加入硝酸钆(Gd(NO3)3)溶液，搅拌20-30h，再加入三乙胺(N(C2H5)3)搅拌20-40min，然后加入乙酸酐(Ac2O)，将PEI表面剩余的氨基乙酰化，搅拌反应20-30h；
(3)将步骤(2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得外围螯合钆离子、里面包裹金纳米粒子的CT/MR双模态纳米造影剂，标记为Gd-Au PENPs。
所述步骤(1)中溶液采用的溶剂均为二甲基亚砜DMSO。
所述步骤(1)中mPEG-COOH的分子量为2000g/mol，PEI的分子量为25000g/mol。
所述步骤(1)中PEI溶液的浓度为2-4mg/mL，mPEG-COOH溶液的浓度为10-15mg/mL，EDC·HCl溶液的浓度为10-15mg/mL，NHS溶液的浓度为10-15mg/mL，DOTA-NHS溶液的浓度为1-8mg/mL。
所述步骤(1)中的透析采用的膜为纤维素透析膜，MWCO为8000-14000，先在PBS透析1d，再在去离子水中透析2d。
所述步骤(2)HAuCl4溶液的浓度为5-10mg/mL，NaBH4溶液的浓度为3-6mg/mL，溶剂为冰水。
所述步骤(2)中HAuCl4与PEI的摩尔比为200∶1，NaBH4与HAuCl4的摩尔比为5∶1，Gd(NO3)3与DOTA的摩尔比为3∶1，N(C2H5)3与PEI的摩尔比为3288∶1，Ac2O与PEI的摩尔比为2740∶1。
所述步骤(3)中的透析采用的膜为纤维素透析膜，MWCO为8000-14000，在去离子水中透析2-3d。
所述步骤(3)中所得的产物为Gd-Au PENPs既可用于血池CT成像又可用于血池MR成像。
本发明使用1HNMR(核磁共振成像技术)、UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、CT成像及MR成像表征本发明制备的具有双模态造影功能的纳米造影剂的结果分别如下：
(1)1H NMR
参见说明书附图2，2.2-3.5ppm是PEI的亚甲基质子信号，3.5-3.6ppm是PEG的结构单元的亚甲基质子信号，根据它们积分面积之比，计算出每个PEI分子表面修饰上24个PEG(其投料摩尔比为mPEG-COOH∶PEI＝30∶1)。由于DOTA的峰与PEI的峰重叠，通过DOTA与PEI总的峰面积与PEG的峰面积之比，可以间接计算出，每个PEI分子链接上9个DOTA。
(2)UV-Vis测试结果
UV-Vis测试结果表明：在螯合钆离子或乙酰化前后，金纳米颗粒的表面等离子体共振(SPR)峰都位于520nm左右，参见说明书附图3。这表明螯合钆离子或乙酰化过程都不会影响或破坏金纳米离子的结构，同时也证明了金纳米颗粒的成功制备。
(3)TEM测试结果
TEM测试结果显示了该纳米颗粒分布均匀，平均粒径为4.0±0.8nm分布，是面心立方(fcc)晶体结构，参见说明书附图4。
(4)稳定性测试的试验结果
用紫外吸收光谱仪测定不同温度(4、25、37和50℃)条件下的超纯水配制的0.1mg/mLGd-Au PENPs溶液紫外吸收值，发现Gd-Au PENPs溶液在不同的温度条件下金纳米颗粒的SPR峰都位于520nm左右，无明显位移发生。同样地，用紫外吸收光谱仪测定pH分别为5、6、7和8的缓冲溶液配制0.1mg/mL Gd-Au PENPs溶液紫外吸收值，发现Gd-Au PENPs溶液在不同的pH条件下金纳米颗粒的SPR峰无明显位移发生。说明本发明制备的Gd-Au PENPs材料在不同的温度和pH条件下稳定性良好，参见说明附图5。
(5)体外CT和MR成像测试结果
CT成像测试结果表明制备的材料Gd-Au PENPs的X-射线衰减强度随金浓度的提高呈线性上升趋势，同时在相同金或碘的浓度下比临床上用的碘剂(Omnipaque)和Au PENPs具有更高X-射线衰减强度，表现出良好的X-射线衰减特性，参见说明书附图6b。
MR测试结果表明随着Gd(III)浓度的提高，所制备的材料Gd-Au PENPs具有较大的r1弛豫率和良好的线性关系，同时在相同浓度(Gd(III))下比PEI-mPEG-DOTA(Gd)和临床上用的钆剂(钆喷酸葡胺注射液)具有更高的r1弛豫率(Gd-Au PENPs的r1为1.43mM-1s-1，PEI-mPEG-DOTA(Gd)的r1为1.04mM-1s-1和钆喷酸葡胺注射液的r1为0.89mM-1s-1)，进一步说明在金纳米粒子的存在下能够协同增强材料的MR造影效果，参见说明书附图6d。
(6)细胞毒性实验
MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)细胞活力实验及细胞形貌观察表明：本发明制备的材料无明显细胞毒性，在Au浓度高达200μM时，细胞存活率仍高达80％，并且细胞形态良好，参见说明书附图7，8。
(7)细胞吞噬实验
本发明制备的材料与KB细胞(一种人类口腔上皮癌细胞株)共培养2h，然后用胰酶消化，离心，收集好的细胞团用王水溶解消化，用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-OES)测量细胞吞噬的Au的含量，参见说明书附图9。随着材料浓度的增加，细胞吞噬的材料也越多，Au浓度达到200μM，细胞吞噬的材料量达到5.685pg/细胞。说明本发明制备的材料是能够被细胞吞噬，并且吞噬的量随着材料浓度的增加而增加。
(8)注射不同剂量的小鼠血池CT成像研究
将Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，通过CT扫描检测得到的成像图(附图10)，从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉，注射90min后仍能够看见下腔静脉。注射60min和90min这两个时间点，肝脏部位与注射前相比明显变亮，说明材料主要通过肝脏来代谢，并可用于肝脏部位CT成像。成像时间与Omnipaque(＜5min)相比更长。当把剂量加大一倍([Au]＝0.1mol/L，300μL，PBS溶剂)时，静脉注射0.5min后，我们能看见更多的血管信息，包括下腔静脉、门静脉、肾静脉和主动脉。说明本发明制备的材料具有良好的血池CT成像效果，参见说明书附图11。
(9)注射不同剂量的小鼠血池MR成像研究
将Gd-Au PENPs([Gd]＝0.005mol/L，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的图片(附图12)，从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉，注射180min后仍能看见小鼠下腔静脉，再一次证明本发明制备的材料在体内具有较长的血液循环时间。当把浓度提高一倍([Gd]＝0.01mol/L，150μL，PBS溶剂)，同样能同时看见下腔静脉和主动脉，说明本发明制备的材料具有良好的血池MR成像效果，参见说明书附图13。
(10)体内组织分布及器官相容性研究
将Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，在不同的时间点将其麻醉处死，取其心、肝、脾、肺和肾，然后用王水消化溶解，用ICP-OES测其Au的含量，参见说明书附图14。说明本发明制备的材料主要通过肝、脾和肾来代谢。72h后材料主要集中在肝和脾，在其他组织含量已经很少，同时，在72h后材料在肝和脾中的含量也开始下降。说明本发明制备的材料可以在体内代谢，具有良好的组织相容性。
将Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，30天后将其麻醉处死，取其心、肝、脾、肺和肾。通过石蜡切片和H&E(苏木精-伊红)染色，参见说明书附图15。本发明制备的材料不会对组织器官造成破坏，和对照组相比，组织形貌无明显变化。说明本发明制备的材料可以在小鼠体内完全代谢，体内无残留，不会影响小鼠的组织器官，具有良好的生物相容性。
本发明方法制备的包裹金纳米粒子、螯合钆离子的CT/MR多功能化纳米造影剂尺寸小、分布较窄，具有良好的胶体稳定性。X-射线衰减强度测试结果表明，金纳米颗粒的X-射线衰减强度信号较好，体内试验也表明其具有良好的CT成像性能。MR成像测试结果表明，DOTA螯合的钆离子可以显著地缩短T1弛豫时间，显示信号增强，体内实验也表明其良好的MR成像性能。
有益效果
(1)本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，采用价廉易得的PEI高分子为基础平台，通过在其内部包裹金纳米颗粒用于CT成像，通过对其表面修饰的DOTA分子螯合钆离子用于T1MR成像，可以实现CT/MR双模态造影，具有很好的使用价值；
(2)本发明制备的材料，小剂量静脉注射可用于静脉的显影，动脉不显影。这有利于对血栓、瘤栓以及肝移植后血管狭窄显影有极大帮助，避免了动脉显影造成的干扰，提高疾病诊断准确度。大剂量静脉注射可以看见丰富的血管信息，有助于血池成像的研究。
(3)本发明制备得到的功能化的PEI的CT/MR双模态成像造影剂具有良好的CT/MR成像效果，为发展新型多功能造影剂的开发奠定了良好的基础。
附图说明
图1为本发明反应方程式简图(Ac2O为乙酸酐，N(C2H5)3为三乙胺)；
图2为PEI-mPEG(a)和PEI-mPEG-DOTA(b)核磁共振氢谱图；
图3为本发明制备的[(Au0)200-PEI.NH2-DOTA-mPEG]PENPs、[(Au0)200-PEI.NH2-DOTA(Gd)-mPEG]PENPs和[(Au0)200-PEI.NHAc-DOTA(Gd)-mPEG]PENPs的紫外吸收光谱图；
图4为本发明制备的Gd-Au PENPs的TEM图片(a)，粒径分布直方图(b)，高分辨(c)和选区电子衍射图(d)；
图5为不同温度(a)和不同pH(b)条件下Gd-Au PENPs的紫外吸收光谱图；
图6为本发明制备的Gd-Au PENPs(1)、Au PENPs(2)和Omnipaque(3)的CT成像图(a)和X-射线衰减与金或碘的浓度的线性关系图(b)；Gd-Au PENPs(1)，PEI-mPEG-DOTA(Gd)(2)和钆喷酸葡胺注射液(3)的T1-权重自旋回波伪彩图(c)和T1弛豫时间的倒数随钆浓度变化的线性关系图(d)；
图7为MTT法测定的KB细胞与不同浓度的Gd-Au PENPs共培养24h后的细胞存活率；
图8为KB细胞与不同浓度的Gd-Au PENPs共培养24h后的细胞形态；
图9为KB细胞与不同浓度的Gd-Au PENPs共培养2h后，细胞吞噬的材料量与金的浓度之间的柱状图(***，p＜0.001，所有的统计学分析数据都是与PBS对照组作为比较)；
图10为尾静脉注射Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)进体重为20-25g的小鼠体内，通过CT扫描检测得到的成像图(箭头指向下腔静脉，圆圈代表肝脏部位)；
图11为尾静脉注射Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，300μL，PBS溶剂)进体重为20-25g的小鼠体内，通过CT扫描检测得到的成像图和3D重建图；
图12为尾静脉注射Gd-Au PENPs([Gd]＝0.005mol/L，150μL，PBS溶剂)进体重为20-25g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的重建图(箭头指向下腔静脉)；
图13为尾静脉注射Gd-Au PENPs([Gd]＝0.01mol/L，150μL，PBS溶剂)进体重为20-25g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的重建图；
图14为尾静脉注射Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)不同时间后小鼠主要器官里金的含量；
图15为尾静脉注射PBS(100μL，作为对照组)或Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)30天后小鼠主要器官的H&E染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)在5mL mPEG-COOH的DMSO溶液(12mg/mL)中，加入5mL EDC的DMSO溶液(11.5mg/mL)，搅拌反应0.5h，然后加入3mL NHS的DMSO溶液(11.5mg/mL)，继续搅拌反应3h。然后逐滴滴加到10mL PEI的DMSO的溶液(2.5mg/mL)，搅拌反应3d。用5mL DOTA-NHS的DMSO溶液(1.52mg/mL)逐滴加到上述混合溶液，搅拌反应1d。首先用PBS缓冲溶液透析1d(3×2L)，然后用去离子水透析2d(6×2L)，冷冻干燥得到白色固体粉末PEI-mPEG-DOTA。
(2)取50mg PEI-mPEG-DOTA(0.25mg/mL，超纯水作为溶剂)，搅拌混匀后，逐滴加入5.31mL HAuCl4水溶液(10mg/mL)在室温下搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入5mL NaBH4冰水溶液(4.88mg/mL)，溶液瞬间变成深红色，继续室温搅拌3h；
(3)向步骤(2)的反应液中加入1mL Gd(NO3)3·6H2O的水溶液(8.736mg/mL)，搅拌反应24h，再加入200.5μL三乙胺，搅拌反应30min后，再向反应液中加入167.1μL乙酸酐，继续室温搅拌24h，随后将反应产物用去离子水透析3d(9×2L)，冷冻干燥得到基于功能化PEI的CT/MR双模态成像造影剂Gd-Au PENPs。
1H NMR谱在2.2-3.5ppm是PEI的亚甲基质子信号，3.5-3.6ppm是PEG的结构单元的亚甲基质子信号，根据它们积分面积之比，计算出每个PEI分子表面修饰上24个PEG(其投料摩尔比为mPEG-COOH∶PEI＝30∶1)。由于DOTA的峰与PEI的峰重叠，通过DOTA与PEI总的峰面积与PEG的峰面积之比，可以间接计算出，每个PEI分子链接上9个DOTA(附图2)。在螯合钆离子或乙酰化前后，金纳米颗粒的SPR峰都位于520nm左右(附图3)，这表明螯合钆离子或乙酰化过程都不会影响或破坏金纳米粒子的结构，同时也证明形成了金纳米颗粒。TEM测试结果显示了该纳米颗粒分布均匀，平均粒径为4.0±0.8nm分布，晶格清晰，是面心立方(fcc)晶体结构(附图4)。该纳米颗粒的ICP-OES数据表明，每个功能化PEI包裹198个金原子，外围螯合20个钆离子。这些测试结果表明已成功制备了基于功能化PEI的CT/MR双模态成像造影剂Gd-Au PENPs。
实施例2
用紫外吸收光谱仪测定不同温度(4、25、37和50℃)条件下的超纯水配制的0.1mg/mL的实施例1制备的Gd-Au PENPs溶液紫外吸收值，发现Gd-Au PENPs溶液在不同的温度条件下金纳米颗粒的SPR峰都位于520nm左右，无明显位移发生。同样地，用紫外吸收光谱仪测定pH分别为5、6、7和8的缓冲溶液配制0.1mg/mL的实施例1制备的Gd-Au PENPs溶液紫外吸收值，发现Gd-Au PENPs溶液在不同的pH条件下金纳米颗粒的SPR峰无明显位移发生。说明本发明制备的Gd-Au PENPs材料在不同的温度和pH条件下稳定性良好，参见说明附图5。
实施例3
用MTT实验检测实施例1制备的Gd-Au PENPs的细胞毒性。称取Gd-Au PENPs 1mg，配制成1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台用无菌的PBS配制Au浓度分别为0、100、250、500、1000、和2000μM的无菌纳米颗粒胶体(材料加入培养基中，其浓度要稀释10倍)。KB细胞(10000个细胞每孔)种植于96孔板后过夜使其贴壁，然后加入含不同浓度的Gd-Au PENPs培养基再培养24h。24h后向每个孔中加入20μLMTT，继续在37℃下静止培养4h，然后弃去培养液，并加入150μL DMSO，振荡15min后用酶标仪测量在570nm处紫外吸收值，并根据此值计算细胞的存活率(附图7)。发现不同浓度的Gd-Au PENPs处理后的细胞存活率都在80％以上。这说明本发明制备的Gd-AuPENPs在一定浓度下无明显细胞毒性。我们进一步通过倒置相差显微镜观察KB细胞与不同浓度的材料共培养24h后的细胞形貌。如附图8所示，发现与不同浓度的材料共培养24h后，细胞形貌良好，和PBS处理的细胞形态相比，无明显区别，进一步证明了实施例1制备的Gd-Au PENPs材料在一定浓度下具有较低的细胞毒性。
用ICP-OES技术检测细胞吞噬的实施例1制备的Gd-Au PENPs的量。不同浓度的Gd-AuPENPs与KB细胞共培养2h后用胰酶消化，离心，收集好的细胞团用王水溶解消化，用ICP-OES测量细胞吞噬的Au的含量，参见说明书附图9。随着材料浓度的增加，细胞吞噬的材料也越多，Au浓度达到200μM，细胞吞噬的材料量达到5.685pg/细胞。说明本发明制备的材料是能够被细胞吞噬，并且吞噬的量随着材料浓度的增加而增加。
实施例4
用医用CT扫描仪对实施例1制备的材料(Gd-Au PENPs)和对比例1合成的材料(AuPENPs)及Omnipaque的体外CT成像效果进行观察和比较。取实施例1样品13.3mg溶解在200μL超纯水中配制Au浓度为0.1M的溶液，再分别稀释至为0.06M、0.02M、0.01M和0.005M溶液各100μL。以同样的方法制备相同金或碘的浓度梯度的对比例1Au PENPs和Omnipaque。用CT测试仪测试各个样品的CT值并得出X-射线衰减与金或碘浓度的线性关系。附图6(a)为样品的CT成像图(其中1为Gd-Au PENPs，2为Au PENPs和3为Omnipaque)，附图6(b)为样品1，2和3的X-射线衰减与金或碘的浓度的线性关系图。从图6(a)中可以看出相同浓度的样品1比样品2的CT信号高，样品2比样品3的CT信号高，说明在Gd离子的存在下可以协同增强材料的CT造影效果。同样图6(b)中三个材料的浓度和CT值线性关系良好，样品1的CT值与金或碘的浓度的线性关系的斜率为6529.6大于样品2(5135.8)和样品3(3573.2)，进一步说明在Gd离子的存在下可以增强材料的CT造影效果，证明实施例1制备的材料具有良好的CT成像效果。
实施例5
用体外MR测试的弛豫率r1来评判实施例1制备的材料(Gd-Au PENPs)和对比例2合成的材料(PEI.NHAc-mPEG-DOTA(Gd))及临床上用的钆剂(钆喷酸葡胺注射液)的体外MR成像效果。取实施例1样品26.6mg溶解在2mL的超纯水中配制钆浓度为2mM的溶液，再分别稀释到钆浓度为0.67mM、0.33mM和0.17mM的溶液各1mL。以同样的方法制备相同钆浓度梯度的PEI.NHAc-mPEG-DOTA(Gd)和钆喷酸葡胺注射液。用医用3T MR测试仪测试各个样品的T1值并得出1/T1的值与钆浓度的线性关系。附图6(c)为样品的T1-权重自旋回波伪彩图(其中1为Gd-Au PENPs，2为PEI.NHAc-mPEG-DOTA(Gd)和3为钆喷酸葡胺注射液)，附图6(d)为样品1，2和3的T1弛豫时间的倒数随钆浓度变化的线性关系图。从图6(c)中可以看出相同浓度的样品1比样品2MR信号强度高，样品2比样品3的MR信号强度高。同样图6(d)中三个材料的浓度和1/T1值线性关系良好，并且样品1的r1为1.43mM-1s-1大于样品2的1.04mM-1s-1和样品3的0.89mM-1s-1，进一步说明在金纳米粒子的存在下能够协同增强材料的MR造影效果。
实施例6
将实施例1制备的Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，通过CT扫描检测得到的成像图(附图10)，从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉，注射90min后仍能够看见下腔静脉。注射60min和90min这两个时间点，肝脏部位与注射前相比明显变亮，说明材料主要通过肝脏来代谢，并可用于肝脏部位CT成像。成像时间与Omnipaque(＜5min)相比更长。当把剂量加大一倍([Au]＝0.1mol/L，300μL，PBS溶剂)时，注射0.5min后，我们能看见更多的血管信息，包括下腔静脉、门静脉、肾静脉和主动脉。说明本发明制备的材料具有良好的血池CT成像效果，参见说明书附图11。
实施例7
将实施例1制备的Gd-Au PENPs([Gd]＝0.005mol/L，150μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的图片(附图12)，从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉，注射180min后仍能看见小鼠下腔静脉，再一次证明本发明制备的材料具有较长的成像时间。当把浓度提高一倍([Gd]＝0.01mol/L，150μL，PBS溶剂)，同样能同时看见下腔静脉和主动脉，说明本发明制备的材料具有良好的血池MR成像效果，参见说明书附图13。
实施例8
将实施例1制备的Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，在不同的时间点将其麻醉处死，取其心、肝、脾、肺和肾，然后用王水消化溶解，用ICP-OES测其Au的含量，参见说明书附图14。说明本发明制备的材料主要通过肝、脾和肾来代谢。72h后材料主要集中在肝和脾，并且材料在其他组织含量已经很少，同时，在72h后材料在肝和脾中的含量也开始下降。说明本发明制备的材料可以在体内代谢，具有良好的组织相容性。
将实施例1制备的Gd-Au PENPs([Au]＝0.1mol/L，100μL，PBS溶剂)尾静脉注射进体重为20-25g的小鼠体内，30天后将其麻醉处死，取其心、肝、脾、肺和肾。通过石蜡切片和H&E染色，参见说明书附图15。本发明制备的材料不会对组织器官造成破坏，和对照组相比，组织形貌无明显变化。说明本发明制备的材料可以在小鼠体内完全代谢，体内无残留，不会影响小鼠的组织器官，具有良好的生物相容性。
对比例1
(1)在5mL mPEG-COOH的DMSO溶液(12mg/mL)中，加入5mL EDC的DMSO溶液(11.5mg/mL)，搅拌反应0.5h，然后加入3mL NHS的DMSO溶液(11.5mg/mL)，继续搅拌反应3h。然后逐滴滴加到10mL PEI的DMSO的溶液(2.5mg/mL)，搅拌反应3d。用5mL DOTA-NHS的DMSO溶液(1.52mg/mL)逐滴加到上述混合溶液，搅拌反应1d。首先用PBS缓冲溶液透析1d(3×2L)，然后用去离子水透析2d(6×2L)，冷冻干燥得到白色固体粉末PEI-mPEG-DOTA。
(2)取50mg PEI-mPEG-DOTA(0.25mg/mL，超纯水作为溶剂)，搅拌混匀后，逐滴加入5.31mL HAuCl4水溶液(10mg/mL)在室温下搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入5mL NaBH4冰水溶液(4.88mg/mL)，溶液瞬间变成深红色，继续室温搅拌3h；
(3)向步骤(2)的反应液中加入200.5μL三乙胺，搅拌反应30min后，向反应液中加入167.1μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用去离子水透析3d(9×2L)，冷冻干燥得到不含钆的CT成像造影剂Au PENPs。
ICP-OES测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个PEI的包金量为198个金原子，载钆量为0个Gd(III)离子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含钆的CT成像造影剂对比产物Au PENPs。
对比例2
(1)在5mL mPEG-COOH的DMSO溶液(12mg/mL)中，加入5mL EDC的DMSO溶液(11.5mg/mL)，搅拌反应0.5h，然后加入3mL NHS的DMSO溶液(11.5mg/mL)，继续搅拌反应3h。然后逐滴滴加到10mL PEI的DMSO的溶液(2.5mg/mL)，搅拌反应3d。用5mL DOTA-NHS的DMSO溶液(1.52mg/mL)逐滴加到上述混合溶液，搅拌反应1d。首先用PBS缓冲溶液透析1d(3×2L)，然后用去离子水透析2d(6×2L)，冷冻干燥得到白色固体粉末PEI-mPEG-DOTA。
(2)向步骤(1)的反应液中加入1mL Gd(NO3)3·6H2O的水溶液(8.736mg/mL)，搅拌反应24h，再加入200.5μL三乙胺，搅拌反应30min后，向反应液中加入167.1μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用去离子水透析3d(9×2L)，冷冻干燥得到不含金的成像造影剂对照产物PEI.NHAc-DOTA(Gd)-mPEG。
ICP-OES测定产物中Au和Gd的含量，结果表明平均每个PEI的载钆量为20个Gd(III)离子，0个金原子，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的不含金的成像造影剂对照产物PEI.NHAc-DOTA(Gd)-mPEG。
Claims (10)
1.一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，包括：
(1)在羧基化聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl的溶液，室温搅拌15-30min，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS的溶液继续搅拌2-3h；将此混合溶液逐滴加入超支化聚乙烯亚胺PEI的溶液中反应2-4d；然后将DOTA-NHS溶液逐滴加入上述混合液，继续搅拌反应1-2d，得到功能化聚乙烯亚胺分子溶液，透析，冷冻干燥，得到PEI-mPEG-DOTA；其中EDC·HCl与mPEG-COOH的摩尔比为10∶1，EDC·HCl与NHS的摩尔比为1∶1，mPEG-COOH与PEI的摩尔比为30∶1，DOTA-NHS与PEI的摩尔比为10∶1；
(2)在上述PEI-mPEG-DOTA水溶液中加入HAuCl4溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，继续搅拌2-4h；然后加入硝酸钆溶液，搅拌20-30h，再加入三乙胺搅拌20-40min，然后加入乙酸酐，搅拌反应20-30h；
(3)将步骤(2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得CT/MR双模态纳米造影剂，标记为Gd-Au PENPs。
2.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中溶液采用的溶剂均为二甲基亚砜。
3.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中mPEG-COOH的分子量为2000g/mol，PEI的分子量为25000g/mol。
4.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PEI溶液的浓度为2-4mg/mL，mPEG-COOH溶液的浓度为10-15mg/mL，EDC·HCl溶液的浓度为10-15mg/mL，NHS溶液的浓度为10-15mg/mL，DOTA-NHS溶液的浓度为1-8mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的透析采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，先在磷酸盐缓冲溶液PBS透析1d，再在去离子水中透析2d。
6.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)HAuCl4溶液的浓度为5-10mg/mL，NaBH4溶液的浓度为3-6mg/mL，溶剂为冰水。
7.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中HAuCl4与PEI的摩尔比为200∶1，NaBH4与HAuCl4的摩尔比为5∶1，Gd(NO3)3与DOTA的摩尔比为3∶1，N(C2H5)3与PEI的摩尔比为3288∶1，Ac2O与PEI的摩尔比为2740∶1。
8.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的透析采用的膜为纤维素透析膜，MWCO为8000-14000，在去离子水中透析2-3d。
9.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所得的产物既用于血池CT成像又用于血池MR成像。
10.根据权利要求1所述的一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所得的产物为Gd-Au PENPs，小剂量静脉注射可用于静脉的显影，动脉不显影；这有利于血栓、瘤栓以及肝移植后血管狭窄的显影，避免了动脉显影造成的干扰，提高疾病诊断准确度，而大剂量静脉注射可以看见丰富的血管信息，有助于血池成像的研究。
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Cited By (4)
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| CN105343899A (zh) * | 2015-10-16 | 2016-02-24 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种具有双模态成像的金纳米棒的制备方法 |
| CN106075459A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-11-09 | 东华大学 | 一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法 |
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