CN104399092B - 一种rgd修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：温和还原法制备PEI包覆的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒；USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面修饰异硫氰酸荧光素(FI)和PEG化的RGD复合物(COOH‑PEG‑RGD)，以及纳米颗粒表面的乙酰化处理。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒粒径较小、弛豫率很高，并且具有良好的胶体稳定性、生物相容性和特定的αvβ3整合素高表达肿瘤细胞的靶向性，在体内肿瘤靶向MR成像诊断领域具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于核磁共振成像造影剂的制备领域，特别涉及一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。
背景技术
近年来，超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒在生物医学领域有着越来越广泛的应用，特别是用作核磁共振成像(MRI)的造影剂。本课题组已通过简易的水热合成法制备了两种不同表面修饰的四氧化三铁纳米颗粒，并探索了其在MR成像诊断中应用的可行性(沈明武，蔡红东，史向阳。一种APTS修饰的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。专利号：ZL 2011 10104443.1；Cai et al.，ACS Appl.Mater.Interfaces 2013，5(5),1722–1731；37.史向阳，蔡红东，沈明武。一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号：201210277624.9，申请日期：2012-08-07)。这些制备的四氧化三铁纳米颗粒的弛豫率在80-160mM-1s-1之间，为了减少造影剂的剂量并达到灵敏检测的目的，制备具有更高弛豫率的四氧化三铁纳米颗粒就显得尤为有意义。在另一个研究工作中，通过温和还原法制备出超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒(USPIO)，其尺寸较小，并且表现出很高的弛豫率，在体内特定肿瘤的靶向MR成像诊断领域有着潜在的应用(沈明武，李静超，胡勇，孙文杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号：2014101828211，申请日期：2014-04-30)。
检索国内外文献，尚没有发现关于用还原法制备具有超高弛豫率的RGD特异靶向能力的USPIO纳米探针用于体外和体内脑胶质瘤模型的靶向MR成像诊断研究的相关报道。
发明内容
本发明提供一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；制备的USPIO磁性纳米颗粒能够长时间稳定地分散于水溶液中，不会出现团聚现象；所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
本发明的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟；然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得PEI包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI.NH2；
(2)将步骤(1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中；再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒；
(3)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应10～12小时，得到COOH-PEG-6-M；然后再将充分溶解于DMSO中的端基为巯基的RGD SH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，真空冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；
(4)将步骤(3)中制备的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化2～4h；将步骤(2)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，然后加入活化的COOH-PEG-RGD溶液，搅拌反应2～4天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒；
(5)向步骤(4)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20～40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20～30小时，磁分离洗涤并分散于超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD。
所述步骤(1)中的三价铁盐为FeCl3·6H2O；三价铁盐、超纯水、NH3·H2O的配比为1.2～1.4g:20～25mL:2～3mL，三价盐、亚硫酸钠、PEI的质量比为1.2～1.4:0.20～0.25:0.51～0.53。
所述步骤(1)中的NH3·H2O质量百分比浓度为25～28％。
所述步骤(1)中的超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。
所述步骤(2)中FI与USPIO/PEI.NH2表面氨基的摩尔比为1:39～40，优选1:40。
所述步骤(3)中RGD、6-M和PEG的摩尔比为1:1.0～1.2:1.0～1.2，优选1:1.2:1。
所述步骤(3)中NH2-PEG-COOH的分子量为2000。
所述步骤(4)中的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS的摩尔比为1:8～10:8～10，优选1:10:10。
所述步骤(4)中的COOH-PEG-RGD与USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:23～25，优选1:24。
所述步骤(5)中的三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒表面的PEI上的伯氨基摩尔比为8～10:10～12:1，优选10:12:1。
本发明合成了一种基于RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒。为了克服裸露USPIO普遍存在的磁学特性导致的聚集现象，并提高其在生物医学成像领域的可应用性，在反应过程中加入聚乙烯亚胺(PEI)用于介导USPIO的合成，从而实现简易“一步”还原法制备了胶体稳定性良好的PEI包覆的USPIO(USPIO/PEI.NH2)。为了使制备的该种USPIO/PEI.NH2能有效地应用到生物体内，在其表面接上异硫氰酸荧光素(FI)用于纳米颗粒的示踪和荧光成像；为实现特定肿瘤部位的成像检测，在其表面修饰聚乙二醇-RGD复合物(Polyethyleneglycol-RGD,COOH-PEG-RGD)；最后通过乙酰化中和PEI表面剩余的氨基，降低纳米颗粒的表面电势，从而进一步提高其生物相容性。此外，实验数据表明，制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD和对照材料USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒均有很显著的T2加权成像效果，其r2弛豫率分别高达550.04mM-1s-1和545.70mM-1s-1。最后以αvβ3整合素高表达的U87MG细胞(一种脑胶质瘤细胞)为模型细胞和移植瘤模型对制备的两种多功能纳米探针的性质进行一一评价。本发明制备的USPIO纳米探针在生物医学方面表现出良好特性，特别是超高的r2弛豫率，有望实现在不同疾病系统的准确和灵敏诊断，为USPIO纳米探针用作临床造影剂提供可靠的依据。
本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的分散性、胶体稳定性和生物相容性。与非靶向材料USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒相比，RGD修饰的USPIO纳米颗粒使得肿瘤细胞或肿瘤部位信号更低，表明其具有更高的靶向性。从而说明该方法制备的RGD修饰的USPIO纳米颗粒在MR分子影像诊断领域有着潜在的应用。
本发明使用X-射线衍射(XRD)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过磁共振成像仪测定纳米颗粒的T2弛豫性能，然后利用MTT法评价纳米颗粒的细胞毒性，再利用流式细胞仪、共聚焦显微成像以及体外和体内核磁共振成像实验检测RGD修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。具体测试结果如下：
(1)X-射线衍射(XRD)测试结果
通过对比和分析X-射线衍射图谱，还原法合成的USPIO/PEI.NH2(图1a)和裸的USPIO(图1b)纳米颗粒与Fe3O4图谱(ICSD 20-596)一致，表明PEI修饰的USPIO晶体结构为四氧化三铁。由于PEI的修饰，使得USPIO/PEI.NH2纳米颗粒的X-射线衍射图谱在22.5°左右出现的较宽的峰。
(2)紫外吸收(UV-Vis)测试结果
图2所示为USPIO/PEI.NH2和USPIO/PEI.NH2-FI在300到800nm的紫外吸收图谱。从图中可以看出，USPIO/PEI.NH2在400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而USPIO/PEI.NH2-FI在500nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面。
(3)核磁共振分析(1H NMR)测试结果
将合成的PEG-RGD溶于氘代DMSO中进行核磁共振分析(1H NMR)。如图3所示，7.3和7.4ppm处出现明显的谱峰，证明RGD已成功连接到PEG上，并通过峰面积积分可知，每一个PEG上连接0.5个RGD。
(4)热重分析(TGA)测试结果
为了检测PEG-RGD和mPEG在USPIO纳米颗粒表面的上载量，对修饰前后的纳米颗粒进行了TGA测试。由图4可以看出，USPIO/PEI.NH2-FI在温度升至700℃时，重量为原来的87.65％，经过计算，PEI和FI的总上载率为12.35％；修饰后，USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG和USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD的失重分别是15.68％和16.35％，经过计算，mPEG和PEG-RGD上载率3.33％和4.00％，由此表明mPEG和PEG-RGD均已成功连接到USPIO纳米颗粒的表面。
(5)电势和水动力粒径测试结果
电势结果显示乙酰化后USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的表面电势是+26.4mV和+28.3mV；其分散于水中后的水动力粒径分别是127.3nm和146.5nm(表1)。
(6)透射电子显微镜(TEM)测试结果
通过TEM观察本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的形态和尺寸(如图5)。TEM测试结果显示USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的形貌均是球形或准球形。分别随机测量300个纳米颗粒的直径,计算得到本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒的直径分别是9.1±1.9nm和9.0±1.7nm。
(7)弛豫率测量结果
r2弛豫率反映USPIO纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间(T2)，可通过不同浓度下的T2的倒数拟合计算得到。图6为本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出两种USPIO纳米探针的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.003-0.048mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的两种探针的r2弛豫率分别高达545.70mM-1s-1和550.04mM-1s-1。因此，本发明所制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒均可作为MR成像的优良T2信号衰减造影剂。
(8)MTT细胞活力测试结果
通过MTT比色法测定U87MG细胞的活力来检测本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的细胞相容性(如图7)。U87MG细胞分别与两种纳米颗粒(Fe浓度分别为0、10、25、50、75和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力。不同浓度的两种材料对细胞增殖的影响以PBS缓冲液处理的细胞为对照进行比较。与PBS对照组相比，在Fe的实验浓度为0到100μg/mL范围内，USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒对U87MG细胞的存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上。这充分说明两种纳米探针具有良好的细胞相容性，可以应用到细胞水平或生物体内MR成像诊断。
(9)流式细胞仪检测结果
通过流式细胞仪检测U87MG细胞对本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒在不同Fe浓度下的吞噬量和处理后细胞的平均荧光强度(如图8)来检测RGD靶向性效果。两种纳米颗粒分别与U87MG细胞(Fe浓度为0.125、0.25、0.50、1.00和1.50mM)在37℃下共培养4小时，然后通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度。如图8所示，在Fe浓度0.125-1.50mM范围内，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒培养的U87MG细胞的平均荧光强度明显高于USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒培养的U87MG细胞的平均荧光强度。结果表明，RGD的修饰使得USPIO纳米颗粒对U87MG细胞有特异靶向能力。
(10)共聚焦显微镜检测结果
RGD修饰的USPIO纳米颗粒的靶向性同样也通过共聚焦显微镜来验证。如图9所示，PBS、本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒分别与U87MG细胞在37℃下共培养4小时，然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号。从图9可以看出，经过PBS处理的细胞内没有荧光(9a)；经过USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒处理后的U87MG细胞内显示出非常微弱的荧光信号(9b)；而经过USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD处理后的U87MG细胞内显示出很强的荧光信号(9c)，这进一步说明RGD修饰的USPIO纳米颗粒对U87MG细胞有更好的靶向性。
(11)体外细胞MR成像结果
在体内实验之前，评价了本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的细胞MR成像效果(如图10)。U87MG细胞分别与USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒(Fe浓度为0.1、0.2、0.3和0.4mM)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。从图10a中可以看出，随着Fe浓度的增加，USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理后的U87MG细胞比USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG处理的U87MG细胞的MRI信号降低更明显，说明αvβ3整合素高表达的U87MG细胞对USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的吞噬量要大大高于对USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG的吞噬量。图10b是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐减少，而且在相同的Fe浓度下，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理的U87MG细胞的MRI信号值要明显低于USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-mPEG纳米颗粒处理的U87MG细胞的MRI信号值。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒对U87MG细胞的特异靶向性。
(12)体内肿瘤MR成像结果
两组裸鼠分别直接尾静脉注射本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(如图11a)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(如图11b)(Fe的质量为600μg，0.1mL)纳米颗粒PBS溶液，用临床核磁共振体系(3.0T)评价肿瘤部位(*)的MR成像效果。与注射前的对照组相比较，在注射0.5小时后，两组裸鼠肿瘤部位均开始变暗，1个小时后达到最暗。在注射2小时后，两个实验组的裸鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液循环已经从肿瘤部位逐渐代谢出去(图11a，11b)。图11c是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射0.5小时后，两组裸鼠肿瘤部位的信号值均降低，1个小时后信号值后达到最低。在注射2小时后，两组裸鼠肿瘤部位MRI信号值均有所增加，这与图11a、11b的结果一致。值得一提的是，图11a,11b和图11c均表明：随着时间的推移，注射USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD的裸鼠肿瘤MRI信号强度一直低于注射USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-mPEG的裸鼠肿瘤MRI信号强度。这些结果说明本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MR肿瘤成像诊断。
有益效果
(1)本发明采用简单的还原法制备水溶性良好的PEI包覆的USPIO纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面先后连接荧光素FI分子和mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD，最后对纳米颗粒的表面氨基进行乙酰化处理，即得到用于MR成像的多功能USPIO纳米颗粒；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；(2)本发明制备的USPIO纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象。PEI的包覆增加了USPIO纳米颗粒的稳定性，mPEG-COOH或COOH-PEG-RGD的表面修饰增加了USPIO纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且COOH-PEG-RGD的表面修饰赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的特异性靶向能力。这些优点使制备的RGD修饰的USPIO纳米颗粒可以有效地用作体内靶向MR成像的阴性造影剂。
附图说明
图1是本发明制备的USPIO/PEI.NH2(a)和USPIO(b)纳米颗粒的X-射线衍射图；
图2是本发明制备的USPIO/PEI.NH2(a)和USPIO/PEI.NH2-FI(b)的紫外吸收图谱；
图3是COOH-PEG-RGD核磁共振分析(1H NMR)图；
图4是本发明制备的USPIO/PEI.NH2-FI(a)、USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG(b)和
USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD(c)的热重分析图；
图5是本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(a，c)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(b，d)的透射电镜图片和尺寸分布直方图；
图6是本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图；
图7是MTT法测试的U87MG细胞经过PBS缓冲液(对照)和本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒(Fe的浓度范围在10-100μg/mL)处理24小时后的细胞活力；
图8是U87MG细胞与本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的PBS溶液(Fe的浓度为0、0.125、0.25、0.50、1.0和1.5mM)共培养4小时后的细胞的平均荧光强度；
图9是U87MG细胞分别经过PBS缓冲液(a)、本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒(b)(Fe浓度为0.5mM)和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒(c)(Fe浓度为0.5mM)处理4小时后细胞的共聚焦显微成像图片；
图10是U87MG细胞分别与本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒(Fe浓度范围在0.1-0.4mM)共培养4小时后的细胞T2MR成像图片(a)和相应的MRI信号值变化(b)；
图11是两组裸鼠分别尾静脉注射本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(a)、USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(b)纳米颗粒PBS溶液(Fe：600μg，0.1mL)后不同时间点裸鼠肿瘤的T2MR成像图片和相应的MRI信号值变化(c)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将1.30g FeCl3·6H2O溶解于20mL超纯水中，移入250mL三口瓶中搅拌；氮气鼓吹15分钟后，将0.2g亚硫酸钠溶于10mL超纯水后加入到三口瓶中，持续搅拌反应30分钟；然后依次将0.5g超支化聚乙烯亚胺PEI的水溶液和2mL的NH3·H2O也加入到三口瓶中，70℃下恒温搅拌反应30分钟；接着在室温下反应1.5小时；反应结束后，将所得到的黑色USPIO/PEI.NH2磁分离，除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复超纯水洗涤三次，以除去杂质，然后重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包覆的USPIO纳米颗粒(USPIO/PEI.NH2)。同时用相同的方法在缺少PEI的情况下制备裸露的USPIO作为对照。取3mL纳米颗粒溶液，真空冷冻干燥用于X-射线衍射检测。XRD结果显示了USPIO和USPIO/PEI.NH2纳米颗粒的晶体结构为四氧化三铁(见附图1)。
实施例2
取20mL USPIO/PEI.NH2(154mg)(实施例1)用DMSO洗涤后，重新分散于20mLDMSO溶液中。接着，将2mL DMSO溶解的FI溶液(3.6mg)加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1天，产物USPIO/PEI.NH2-FI磁分离并用超纯水洗涤，然后分散到水中。分别取25μLUSPIO/PEI.NH2(实施例1)、USPIO/PEI.NH2-FI的水溶液于2mL离心管中，再向其中加700μL超纯水，超声均匀，测紫外吸收(见附图2)。从图中可以看出，USPIO/PEI.NH2在400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而USPIO/PEI.NH2-FI在500nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面。
实施例3
将3.70mg 6-M与20mg NH2-PEG-COOH混合于5mL DMSO溶液中，搅拌反应10个小时，得到COOH-PEG-6-M；然后将充分溶解于2mL DMSO中的6.91mg RGD逐滴加入到COOH-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1天，用截留分子量1000的透析袋透析三天，然后真空冷冻干燥，即得COOH-PEG-RGD。取3mg合成的COOH-PEG-RGD溶于氘代DMSO中进行核磁共振分析(1H NMR)(见附图3)。从图中可以看出，在7.3和7.4ppm处出现的谱峰证明RGD成功连接到PEG上，并通过峰面积积分可知，每一个PEG上连接0.5个RGD。
实施例4
将实施例3中制备的25mg COOH-PEG-RGD、15.99mg EDC和9.60mg NHS混合溶解于5mL DMSO后，搅拌活化4h；将实施例2中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于10mL DMSO中，然后将活化的COOH-PEG-RGD溶液逐滴加入到USPIO/PEI.NH2-FI的DMSO溶液中，搅拌反应4天，再磁分离洗涤，即得USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD，并分散于10mL水中。取2mL USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG(对比例1)和USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD水溶液冻干进行热重分析(见附图4)。从图中可以看出，修饰后，USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG和USPIO/PEI.NH2-PEG-RGD的失重分别是15.68％和16.35％，通过比较USPIO/PEI.NH2-FI在700℃时的失重量，经过计算，PEI和FI的总上载率为12.35％，mPEG-COOH和COOH-PEG-RGD上载率为3.33％和4.00％。再结合实施例3，说明PEI、FI、mPEG和PEG-RGD均已成功连接到USPIO纳米颗粒的表面。
实施例5
向对比例1中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG和实施例4中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒水溶液(10mL)中分别加入505μL三乙胺(密度为0.726～0.729g/mL，浓度为99.0％)，并搅拌20～40分钟；然后向上述两种溶液中再分别加入412μL乙酸酐(密度为1.08g/mL，浓度为98.5％)(三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG、USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒表面氨基摩尔比＝10:10:1)，继续搅拌反应24小时；产物磁分离并加入适量超纯水超声分散，如此重复3次，最终分散到5mL超纯水中，即制得乙酰化的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒。取本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒悬浮液各100μL，用超纯水分别配制成1.5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径(见附表1)。电势结果显示乙酰化后USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的表面电势是+26.4mV和+28.3mV，而其分散于水中的水动力粒径分别是127.3nm和146.5nm。
取本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒水溶液各5μL，然后用超纯水分别配制成100μL的纳米颗粒悬浮液。并取5μL纳米颗粒悬浮液滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM测试(见附图5)。TEM结果显示USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(见附图5a)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图5b)纳米颗粒的形貌均为球形或准球形。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(见附图5c)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图5d)纳米颗粒的直径是9.1±1.9nm和9.0±1.7nm。
表1.纳米颗粒分散于水中的电势和水动力粒径
实施例6
将本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒水溶液通过ICP-OES测试法测定Fe元素的浓度，接着在EP管中用超纯水配制Fe浓度依次为0.003、0.006、0.012、0.024和0.048mM的水溶液2mL，通过磁共振成像仪测定材料在不同的Fe浓度下的T2弛豫效应(见附图6)。弛豫率测试结果表明两种纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.003-0.048mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD的r2弛豫率分别高达545.70mM-1s-1和550.04mM-1s-1。因此，本发明所制备的两种探针均有潜力作为MR成像的优良T2信号衰减造影剂。
实施例7
以U87MG细胞为模型细胞评价本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒对细胞活力的影响。用无菌PBS配置不同浓度纳米颗粒的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。将U87MG细胞种植于96孔板，培养过夜贴壁，分别与本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒(Fe浓度为0、10、25、50、75和100μg/mL)在37℃和5％CO2下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μLMTT，继续在37℃下培养4小时，弃去培养液，并加入200μL DMSO，振荡15分钟，在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(见附图7)。与PBS对照组相比，USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒在Fe的实验浓度为0到100μg/mL范围内对U87MG细胞存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上。这充分说明本发明合成的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD具有良好的生物相容性，可以应用到生物体内MR成像检测。
实施例8
通过流式细胞仪检测U87MG细胞经过不同浓度的本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理后的平均荧光强度(见附图8)，以此评估U87MG细胞对两种材料的吞噬量，并评价RGD修饰的USPIO的靶向性效果。将2×105个U87MG细胞种植于12孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2下培养过夜，使细胞贴壁，然后弃去培养基，分别用含USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的DMEM培养液(Fe浓度为0.125、0.25、0.50、1.00和1.50mM)在37℃和5％CO2下与U87MG细胞共培养4小时。培养结束后用PBS清洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS中，通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度。结果表明，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD培养的U87MG细胞的平均荧光强度明显高于USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG培养的U87MG细胞的平均荧光强度，说明RGD的修饰赋予了USPIO纳米颗粒对U87MG细胞的特异靶向能力。
实施例9
通过共聚焦显微镜来进一步验证RGD修饰的USPIO纳米颗粒的靶向性效果。先将盖玻片放置于12孔细胞培养板中并用DMEM培养基浸泡12h，然后每孔补充1.0mL培养基并接种2×105个U87MG细胞，培养一天。然后再将U87MG细胞分别与PBS、本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的DMEM培养液(Fe浓度为0.5mM)在37℃和5％CO2下共培养4小时。然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号(见附图9)。从图中可以看出，经过PBS处理的细胞内没有荧光；USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米材料培养的U87MG细胞内显示出非常微弱的荧光信号；而USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD培养的U87MG细胞内显示出很强的荧光信号，这进一步说明RGD修饰的USPIO纳米颗粒对U87MG细胞有很好的靶向性，从而为该材料成功高效地应用到体内靶向MR成像提供了可靠的依据。
实施例10
在体内实验之前，评价了本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的细胞MR成像效果(见附图10)，将3×106个U87MG细胞(2.0mL培养基)接种在六孔板中，培养过夜使其贴壁，弃去培养基，再分别与USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的DMEM培养液(Fe浓度为0.1、0.2、0.3和0.4mM)在37℃和5％CO2下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。培养结束后用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mLPBS(含0.5％琼脂糖)中，用临床核磁共振成像体系(3.0T)评价肿瘤部位的MR成像效果。在图10a中，随着Fe浓度的增加，USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG和USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理后的U87MG细胞比USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG处理的U87MG细胞的MRI信号降低更明显，说明U87MG细胞对USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒的吞噬量要大大高于对USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒的吞噬量。图10b是细胞经过不同浓度的两种纳米颗粒处理后的MRI信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐减少。而在相同的Fe浓度下，USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒处理后U87MG细胞的MRI信号值要明显低于USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG处理的U87MG细胞的MRI信号值。这些结果不仅说明本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒对U87MG细胞的特异靶向能力。
实施例11
为了验证本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒对肿瘤的靶向特异性，两组裸鼠分别直接尾静脉注射本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD(见附图11a)和USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图11b)(Fe的质量为600μg，0.1mL)纳米颗粒PBS溶液，用临床核磁共振成像体系(3.0T)评价肿瘤部位的MR成像效果(见附图11)。与注射前的对照组相比较，在注射后0.5小时，两组肿瘤部位均开始变暗，1个小时达到最暗。在注射2小时后，两个实验组的裸鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液循环已经从肿瘤部位逐渐代谢出去。图11c是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射0.5小时后，两组裸鼠肿瘤部位的信号强度均降低，1个小时信号强度候达到最低。在注射2小时后，两组裸鼠肿瘤部位MRI信号值均有所增加，这与图11a,11b的结果一致。值得一提的是，图11a,11b和图11c均表明：随着时间的推移，注射USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD的裸鼠肿瘤MRI信号强度一直低于注射USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG的裸鼠肿瘤MRI信号强度。这些结果说明本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MR肿瘤成像诊断。
对比例1
按照实施例1步骤制备得到PEI包覆的USPIO纳米颗粒(USPIO/PEI.NH2)，最终分散到水中。储存于4℃备用。按照实施例2制备得到USPIO/PEI.NH2-FI，磁分离并用超纯水洗涤，最终分散到水中。储存于4℃备用。
将16.69mg mPEG-COOH、15.99mg EDC和9.60mg NHS混合溶解于5mL DMSO，搅拌活化2～4h；将上述制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于10mLDMSO中，然后将活化的mPEG-COOH逐滴加入到USPIO/PEI.NH2-FI的DMSO溶液中，搅拌反应4天，磁分离并用超纯水洗涤3次，得到USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG纳米颗粒，最终分散于10mL水中。取本发明制备的2mL USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG水溶液冻干进行热重分析(见附图4)。从图中可以看出，修饰mPEG-COOH后，USPIO/PEI.NH2-FI-mPEG的失重是15.68％，通过比较USPIO/PEI.NH2-FI在700℃时的失重量，经过计算，mPEG-COOH上载率为3.33％。
按照实施例5步骤制备得到USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG，磁分离并用超纯水洗涤3次，最终分散到水中。储存于4℃备用。取本发明制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒悬浮液100μL，用超纯水配制成1.5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径(见附表1)。电势结果显示乙酰化后USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒的表面电势是+26.4mV，而其分散于水中的水动力粒径是127.3nm。TEM结果显示USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图5b)纳米颗粒的形貌均为球形或准球形。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG(见附图5d)纳米颗粒的直径是9.0±1.7nm。
Claims (10)
1.一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟；然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得PEI包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI.NH2；
(2)将步骤(1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中；再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒；
(3)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应10～12小时，得到COOH-PEG-6-M；然后再将充分溶解于DMSO中的端基为巯基的RGDSH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，真空冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；
(4)将步骤(3)中制备的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化2～4h；将步骤(2)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，然后加入活化的COOH-PEG-RGD溶液，搅拌反应2～4天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒；
(5)向步骤(4)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20～40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20～30小时，磁分离洗涤并分散于超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD。
2.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的三价铁盐为FeCl3·6H2O；三价铁盐、超纯水、NH3·H2O的配比为1.2～1.4g:20～25mL:2～3mL，三价盐、亚硫酸钠、超支化聚乙烯亚胺PEI的质量比为1.2～1.4:0.20～0.25:0.50～0.53。
3.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的NH3·H2O质量百分比浓度为25～28％。
4.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的超支聚乙化烯亚胺PEI的分子量为25000。
5.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中FI与USPIO/PEI.NH2表面氨基的摩尔比为1:39～40。
6.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中RGD:6-M:COOH-PEG-NH2的摩尔比为1:1～1.2:1～1.2；
COOH-PEG-NH2的分子量为2000。
7.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析2-4天。
8.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS的摩尔比为1:8～10:8～10。
9.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的COOH-PEG-RGD与USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:23～25。
10.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面上的伯氨基摩尔比为8～10:10～12:1。
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