CN105665736A - 一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法 - Google Patents

一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，种子生长法AuNSs；将过量的MTG滴加入到G3.NH2的溶液中，恒温反应得G3.NH2-SH，然后滴加入到AuNSs水溶液中，搅拌得G3-AuNSs；将6-M与COOH-PEG-NH2反应得COOH-PEG-MAL；然后SH-RGD与COOH-PEG-MAL反应得COOH-PEG-RGD，活化后加入到G3-AuNSs的DMSO分散液中，反应得Au？DSNSs，与VEGF？siRNA共同孵育，即得。本发明反应条件温和，工艺简单，易于操作，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。

Description

一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法
技术领域
本发明属于诊疗一体化纳米材料的制备领域，特别涉及一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法。
背景技术
近年来，纳米材料由于其在基因/药物传递、分子影像和靶向治疗方面的潜在应用，受到越来越广泛的关注。尤其是特殊形貌的金纳米颗粒，因为具有良好的化学稳定性、生物相容性、催化活性以及独特的光学性质，广泛应用在生物传感器、光热治疗和分子影像等领域。鉴于金纳米材料表面易被化疗药物和其他功能性基团修饰，所以常被作为多模态治疗和诊疗一体化的明星纳米平台。
金纳米星作为特殊形貌的金纳米颗粒的一种，已被验证可以成功应用于光热治疗、化学催化和分子影像等方面。前期的工作中，在CTAB存在的条件下，合成了金包覆氧化铁星形核壳结构的复合纳米颗粒，并成功应用于MR/CT双模态成像和肿瘤的光热治疗。(沈明武，李静超，胡勇，韦平，史向阳。一种金包覆氧化铁星形核壳结构纳米颗粒的制备及其成像和热疗的应用。申请号：CN201410333885.7，申请日期：2014-07-14)。但由于CTAB的存在，使得后期纯化过程较为繁琐。
前期工作已经证明，RGD对αvβ3整合素高表达的U87MG细胞具有很好的靶向作用(沈明武，胡勇，李静超，韦平，史向阳。一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。申请号：CN201410604468.1，申请日期：2014-10-31)。且功能化的树状大分子既作为金纳米星的稳定剂又可作为基因传递的载体，可以显著提高基因传递效率(史向阳，孔令丹。一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法。中国发明专利，申请号：CN201310291576.3，申请日期：2013-07-11)。
检索国内外文献，尚没有发现关于RGD靶向树状大分子稳定的功能化金纳米星的制备及其用于CT成像和光热与基因联合治疗的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备得到的多功能化的金纳米星具有良好的单分散性、胶体稳定性和生物相容性，且所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化实施的前景。
本发明的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：
(1)将柠檬酸三钠溶于超纯水中，然后加入到煮沸的氯金酸溶液中，煮沸至溶液颜色由无色变为酒红色，终止反应，冷却至室温，得到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒；其中，柠檬酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10；
(2)将步骤(1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌，加入AgNO3和抗坏血酸AA，搅拌反应2～4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs；其中，HAuCl4、AA、AgNO3的摩尔比为500：1：40～60；
(3)将巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺树状大分子G3.NH2的超纯水溶液中，60℃～80℃恒温反应12～48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺-胺三代树状大分子G3.NH2-SH；其中，MTG与G3.NH2的摩尔比为18～20:1；
(4)将步骤(3)中的G3.NH2-SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水溶液中，搅拌12～24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3-AuNSs；其中，G3.NH2-SH与AuNSs的质量比为5～10:1；
(5)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应8-10小时，得到COOH-PEG-MAL；然后再将充分溶解于DMSO中的巯基封端的RGD即SH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-MAL的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；其中，SH-RGD：6-M：COOH-PEG-NH2的摩尔比为1:1～1.2:1～1.2；
(6)将步骤(5)中的COOH-PEG-RGD经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中G3-AuNSs的DMSO分散液中，搅拌反应2～4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au-G3-PEG-RGDNSs，简称AuDSNSs；其中，COOH-PEG-RGD与AuDSNSs中树状大分子的摩尔比为4～6:1；
(7)将步骤(6)中的AuDSNSs与VEGFsiRNA共同孵育15-20分钟，得到复合物AuDSNSs/siRNA。
所述步骤(1)中煮沸的时间为15～20分钟。
所述步骤(1)和步骤(2)中加入为快速加入。
所述步骤(1)中的柠檬酸三钠Na3C6H5O7溶于超纯水后的质量分数为1％，体积为1.5mL，氯金酸溶液的浓度为1mM，体积为10mL。
所述步骤(2)中柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒与氯金酸溶液的体积比为1:100～125。
所述步骤(2)中HAuCl4、AA、AgNO3的配比为：10mL(0.25mM):50μL(0.1M):100μL(2mM)。
所述步骤(3)中巯基乙酸甲酯MTG的含量为95％。
所述步骤(3)中恒温反应为将应装置置于恒温水浴锅中恒温反应。
所述步骤(3)和步骤(5)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析3天。
所述步骤(5)中COOH-PEG-NH2的分子量为2000。
所述步骤(4)和步骤(6)中洗涤为水洗三次。
所述步骤(6)中COOH-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8～10:8～10。
所述步骤(6)中活化时间为2～4h。
所述步骤(6)中离心的转速为7000-8000rpm，时间为20min。
所述步骤(7)中VEGFsiRNA规格为10OD。
所述步骤(7)中AuDSNSs与VEGFsiRNA的N/P为10:1～25:1。
为了提高金纳米星的稳定性和生物相容性，先后在其表面修饰第三代聚酰胺-胺树状大分子和聚乙二醇-RGD(Polyethyleneglycol-RGD,COOH-PEG-RGD)。
本发明首先合成柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒作为种子，采用种子生长法合成金纳米星，然后在其表面修饰第三代树状大分子和聚乙二醇-RGD复合物(Polyethyleneglycol-RGD,COOH-PEG-RGD)，最后与VEGFsiRNA复合，形成复合物。实验结果表明，AuDSNSs/siRNA不仅可以作为体外CT成像造影剂，而且兼具肿瘤的光热治疗和基因治疗两种治疗模式，实现了诊疗一体化的创新理念。
本发明采用柠檬酸钠还原法制备出金种子，种子生长法得到金纳米星，用巯基化的第三代聚酰胺-胺树状大分子(G3.NH2-SH)稳定后，表面修饰PEG化的RGD(COOH-PEG-RGD)，最终和VEGFsiRNA共孵育形成复合物。本发明反应条件温和，工艺简单，易于操作；制备出的功能化金纳米星具有良好的单分散性，胶体稳定性，生物相容性，加之与VEGFsiRNA复合，可以实现光热治疗和基因治疗的协同治疗，辅以CT成像，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
本发明操作简单易行，原材料成本较低，对环境无污染，在没有表面活性剂存在的情况下，成功合成了较小尺寸的金纳米星，而且这种独特的星状结构使得该纳米颗粒在近红外区有较强的吸收峰，从而有望将光能转化为热能，达到杀死肿瘤细胞的目的。且后期经由靶向环肽RGD修饰，对U87MG细胞具有较高的靶向能力，可携带更多的VEGFsiRNA入胞，实现较高的细胞吞噬效率。
本发明使用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、核磁共振氢谱(1HNMR)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过CT成像仪测定纳米金星的X射线衰减系数，并评价了该纳米材料作为光热治疗试剂在近红外激光照射下的升温效果，采用凝胶阻滞实验确定最佳氮磷比，利用CCK8法来评价纳米材料的细胞毒性，再利用荧光显微镜、流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米材料的细胞吞噬量和胞内定位，最后采用WesternBlot来评价VEGFsiRNA介导的基因沉默效果。
有益效果
(1)本发明采用种子生长法合成不规则分支状的金纳米星，然后通过巯基化的第三代聚酰胺-胺树状大分子(G3.NH2-SH)稳定，继而修饰聚乙二醇化的RGD，实现靶向，最后与VEGFsiRNA共同孵育，形成复合物；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作纯化，所用均为环境友好的材料；
(2)本发明制备的RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性和特定细胞的靶向性。体外实验结果显示该多功能化的金纳米星不仅具有很好的CT成像效果，同时可以把光热治疗和基因治疗两种治疗模式集中在一个纳米平台上，协同增强了对癌细胞和肿瘤的治疗效果；可以预见，本发明制备的多功能化的金纳米星在分子影像、肿瘤的光热治疗和基因治疗领域有着潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中G3.NH2(a)和G3.NH2-SH(b)的核磁共振分析(1HNMR)图；
图2为实施例1中Au种子(a)和Au纳米星(b)的紫外吸收图谱；
图3为实施例1中Au种子(a-b)和Au纳米星(c-d)高分辨透射电镜图片；
图4为实施例2中AuNSs(a)和G3-AuNSs(b)的热重分析图；
图5为实施例3中COOH-PEG-RGD(a)和实施例4中Au-G3-PEG-RGD(b)的核磁共振分析(1HNMR)图；
图6为实施例5中AuDSNSs纳米材料在不同Au浓度下的CT成像图和CT值随金浓度变化的线性关系图；
图7为实施例6中AuDSNSs在不同Au浓度下经过近红外激光照射后的升温曲线图；
图8为实施例7中CCK8法测试的U87MG细胞经过PBS缓冲液(对照)的Au-G3-PEG-RGDNSs和Au-G3-mPEGNSs(Au的实验浓度范围在0-1mM)处理24小时后的细胞存活率；
图9为实施例8中CCK8法测试的U87MG细胞在与本发明制备的AuDSNSs(Au浓度0.2-0.8mM)共培养6小时后经过激光照射细胞的存活率；
图10为实施例9中AuDSNSs的凝胶阻滞实验电泳图谱；
图11为实施例10中AuDSNSs/siRNA复合物的电势和水动力粒径图；
图12为实施例11中AuDSNSs与Cy3-siRNA复合物在不同N/P比例下吞噬量和处理后细胞的平均荧光强度；
图13为实施例12中U87MG细胞分别经过PBS缓冲液(a)、VEGFCy3-siRNA和制备的AuDSNSs/Cy3-siRNA复合物(N/P＝10，15，20，25)处理4小时后细胞的共聚焦显微成像图片；图14为实施例13中AuDSNSs在N/P＝20时，以PBS为对照，U87MG细胞的低αvβ3整合素表达和高αvβ3整合素表达对载体/Cy3-siRNA复合物的细胞吞噬量比较图；
图15为实施例14中U87MG细胞分别经过PBS，VEGFsiRNA和AuDSNSs/siRNA复合物处理后的WesternBlot结果图；
图16为实施例15中CCK8法测试的U87MG细胞经过PBS缓冲液，单独的载体AuDSNSs，单独的VEGFsiRNA以及AuDSNSs/siRNA复合物处理48小时后，又经近红外激光照射后的细胞存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)称取10mgG3.NH2溶解于20mL超纯水中，并向其中加入3.25μL巯基乙酸甲酯(Methylthioglycolate，95％，Mw＝106.14，ρ＝1.187)在60℃水浴反应2天，用截留分子量为1000的透析袋在水中透析三天即得到部分琉基化的G3.NH2(G3.NH2-SH)，冻干后储存于-20℃下备用。分别取3mg冻干的G3.NH2和G3.NH2-SH溶于氘代水中进行核磁测试，从图1中可以看出，G3.NH2-SH(b)相较于G3.NH2(a)，在3.25处出现了一个额外增强的吸收峰，为树状大分子上的氨基和巯基乙酸甲酯发生反应生成的酰胺键的特征峰，并通过峰面积积分可知，每一个G3.NH2上连接15.51个巯基。
(2)称取100mg柠檬酸三钠，溶解于9.9mL超纯水中，待其充分溶解后取1.5mL加入到沸腾的HAuCl4溶液(1mM，10mL)中，在持续沸腾的情况下充分搅拌20分钟，溶液颜色由无色变为酒红色，得到柠檬酸钠稳定的金种子冷却并储存于4℃下备用。
(3)配制0.25mMHAuCl4溶液10mL，充分搅拌状态下加入100μL步骤(2)中的金种子，然后快速加入100μLAgNO3(2mM)和50μLAA(0.1mM)；待溶液变为蓝色后持续搅拌2小时，反应结束后，离心纯化，得到金纳米星溶液。后按照金纳米星与G3.NH2-SH的质量比为1:5的比例，向金纳米星溶液加入G3.NH2-SH的水溶液，搅拌反应24小时，离心，水洗三次，冷冻干燥，得到的G3-AuNSs，纯化冻干后储存于-20℃下备用。
实施例2
分别取实施例1制备的Au种子和Au纳米星的水溶液2mL离心管中，再向其中加700μL超纯水，超声均匀，测量紫外吸收(见图2，金种子和AuNSs在400到1000nm的紫外吸收图谱)。紫外结果表明，金种子(a)的吸收峰在520nm左右，而采用种子生长法合成的金纳米星(b)的紫外吸收峰在800nm左右，说明成功合成了在近红外区域具有独特吸收峰的金纳米星。
分别取实施例1中制备的Au种子和Au纳米星的水溶液5μL，然后用超纯水配制成100μL的纳米颗粒悬浮液。并将纳米颗粒悬浮液5μL滴在铜网表面，在空气中晾干后用于TEM测试(见图3，金种子和金纳米星的形貌和尺寸大小)。高分辨率TEM测试结果表明金种子(图3a-b)的形貌为球形，且分散均匀。分别随机测量300个金种子的直径,计算得到其直径为13.1±4.0nm；高分辨率TEM观察本发明制备的金纳米星(图3c-d)形貌为分支状的星形，平均直径大小为52.2±14.2nm。
为了检测G3.NH2-SH在AuNSs(a)表面的上载量，对修饰前后的纳米颗粒进行了TGA测试。由图4可以看出，G3-AuNSs(b)在温度升至900℃时，重量为原来的91.84％，即为金纳米星表面稳定剂G3.NH2的重量，由此表明G3.NH2-SH已经成功连接到金纳米星的表面。
实施例3
将3.70mg6-M与20mgNH2-PEG-COOH混合于5mLDMSO溶液中，搅拌反应10个小时，得到COOH-PEG-6-M；然后将充分溶解于2mLDMSO中的6.91mgRGD逐滴加入到COOH-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1天，用截留分子量1000的透析袋透析三天，然后冷冻干燥，即得COOH-PEG-RGD。取3mg合成的COOH-PEG-RGD溶于氘代DMSO中进行核磁共振分析(1HNMR)(见图5a)。从图中可以看出，在7.3和7.4ppm处出现的谱峰证明RGD成功连接到PEG上，并通过峰面积积分可知，每一个PEG上连接0.35个RGD。
实施例4
将实施例3中制备的25mgCOOH-PEG-RGD、15.99mgEDC和9.60mgNHS混合溶解于5mLDMSO后，搅拌活化4h；将实施例1中制备的G3-AuNSs用DMSO洗涤后，重新分散于10mLDMSO中，然后将活化的COOH-PEG-RGD(5mL)溶液逐滴加入到G3-AuNSs(10mL)的DMSO溶液中，搅拌反应4天，再磁分离洗涤，即得Au-G3-PEG-RGDNSs，并分散于10mL水中，同样的方法合成对照组材料Au-G3-mPEGNSs。为了检测COOH-PEG-RGD在G3.NH2上的上载率，取3mg合成的Au-G3-PEG-RGDNSs溶于氘代DMSO中进行核磁共振分析(1HNMR)(见图5b)并通过峰面积积分可知，每个G3.NH2上连接了0.72个RGD。
实施例5
在CT成像中，造影剂对X射线的衰减起重要作用。将实施例4制备的Au-G3-PEG-RGDNSs通过ICP-OES测试法测定溶液中Au元素的浓度，然后在EP管中用超纯水配制Au浓度依次为0.01、0.02、0.04、0.06和0.08mM的水溶液2mL用于评价其CT成像效应。如图6所示。结果表明随着金浓度的增加，纳米颗粒的CT信号强度也随之增加。并且从CT值随金浓度变化的线性拟合图可以看出复合纳米颗粒的CT值随着金浓度的变化具有很好的线性关系。说明了本发明的Au-G3-PEG-RGDNSs有望用作CT成像的造影剂。
实施例6
为了评价本发明制备的纳米材料的在近红外激光照射下的升温效果，依据实施例5测得的Au元素的浓度，在EP管中用超纯水配制Au浓度依次为1、5、10、15和20mM的水溶液各0.2mL，以等体积的水和金种子水溶液为对照，用808nm激光照射，观察温度变化情况(见图7)。结果表明水和金种子在照射后5分钟，温度仅稍微的升高。而对于Au-G3-PEG-RGDNSs，随着照射时间的延长，纳米星水溶液的温度明显增加。而且随着Au浓度的增加，温度的增加更加明显。
实施例7
通过CCK8比色法来评价Au-G3-PEG-RGDNSs和Au-G3-mPEGNSs对细胞增殖的影响。以U87MG细胞为靶向细胞评价实施例4制备的靶向组材料Au-G3-PEG-RGDNSs和对照组材料Au-G3-mPEGNSs对细胞增殖的影响。用无菌PBS配置不同浓度的Au-G3-PEG-RGDNSs的PBS溶液。U87MG细胞种植于96孔板分别与Au-G3-PEG-RGDNSs和Au-G3-mPEGNSs(Au浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mM)在37℃下共培养24小时。然后换为新的培养液100μL，后加入10μLCCK8，继续在37℃下培养4小时后，在450nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(见图8)，不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS为对照进行比较。与PBS对照组相比，Au-G3-PEG-RGDNSs和Au-G3-mPEGNSs在Au的实验浓度为0.2-0.8mM范围内对U87MG细胞的存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上。即使Au的实验浓度达到1.0mM，才显示出较低的细胞毒性，这充分说明合成的Au-G3-PEG-RGDNSs和Au-G3-mPEGNSs均具有良好的生物相容性。
实施例8
以U87MG细胞为模型细胞，在808nm激光照射下评价AuDSNSs对细胞的杀伤作用。用无菌PBS配置不同浓度的AuDSNSs的PBS溶液。U87MG细胞与本发明制备的AuDSNSs(Au浓度为0.2、0.4、0.6和0.8mM)共培养6小时后用808nm激光器照射5分钟，未照射的细胞用作对照组。然后，向培养板孔中加入10μLCCK8，继续在37℃下培养4小时后，在450nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(见图9)。结果表明随着浓度的增加，未照射的细胞仍然保持很高的细胞存活率；而经过激光照射5分钟，细胞表现出凋亡趋势，并且随着金浓度的增加，细胞的存活率越低。在材料浓度为0.8mM时，激光照射5分钟，细胞存活率仅为40％左右，该实验结果说明实施例4制备的AuDSNSs在近红外激光照射下能引起细胞的凋亡。
实施例9
凝胶阻滞实验用于表征载体对siRNA的包裹能力，首先采用定氮试剂盒法测出本发明制备的AuDSNSs的氨基数量，然后按照AuDSNSs与VEGFsiRNAN/P分别为0.25，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0的比例进行孵育15-20分钟，进行琼脂糖凝胶电泳(见图10)。实验结果表明实施例4所制备的Au-G3-PEG-RGDNSs可以在较低N/P(N/P＝2)下与VEGFsiRNA很好复合，将VEGFsiRNA完全阻滞，说明这种载体具有很好的siRNA包裹能力。
实施例10
粒径和表面电势测试用于表征载体AuDSNSs携带VEGFsiRNA的入胞能力。将实施例4制备的AuDSNSs与5μLVEGFsiRNA(N/P＝10，15，20，25)复合后，终体积固定在100μL，室温下孵育20min，然后加入lmL的PBS。采用马尔文激光粒度仪(Malvern，MK，633nm激光)对其粒径和表面电势进行了表征，结果如图11所示。测量结果表明，AuDSNSs/siRNA复合物的大小在合适转染的尺寸范围内，且复合物电势在N/P＝10，15，20时相差不大，都在适合转染的电势范围内。
实施例11
通过流式细胞仪检测制备的AuDSNSs/Cy3-siRNA的U87MG细胞吞噬效率。将2×105个/孔U87MG细胞种植于12孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2下培养过夜，使细胞贴壁，然后弃去培养基，将带有Cy3标记的VEGFsiRNA与AuDSNSs按照不同的N/P复合(N/P＝10，15，20，25)共同孵育15-20分钟，用含有此复合物的DMEM培养液替换并在37℃和5％CO2下与U87MG细胞共培养4小时。培养结束后用PBS清洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mLPBS中，通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度(见图12)。实验结果表明，在N/P＝20的时候，荧光强度最高，VEGFsiRNA的传递效率最好。
实施例12
采用共聚焦显微镜来进一步探究AuDSNSs与Cy3-siRNA复合物在胞内的定位及细胞吞噬量。先将盖玻片放置于12孔细胞培养板中并用DMEM培养基浸泡12h，然后每孔补充1.0mL培养基并接种2×105个/孔U87MG细胞，培养一天。然后再将U87MG细胞分别与含有PBS、siRNA和本发明制备的AuDSNSs/Cy3-siRNA(N/P＝10，15，20，25)的DMEM培养液在37℃和5％CO2下共培养4小时。然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号(见图13)。从图中可以看出，经过PBS处理的细胞内没有荧光，经过单独的VEGFCy3-siRNA转染的细胞有少量微弱的荧光，而经过不同N/P的AuDSNSs与Cy3-siRNA复合物处理的细胞均显示出了较高的荧光强度，其中与流式细胞术结果相符。当N/P＝20的时候，U87MG细胞内的荧光强度最强，基因传递效率最高。
实施例13
为了验证RGD修饰的功能化金纳米星对模型细胞U87MG具有靶向作用，自由RGD阻断实验用于表征载体的靶向转染能力，在U87MG细胞培养基中添加自由的RGD-SH来阻断αvβ3整合素的表达，使用AuDSNSs与Cy3-siRNA复合物分别转染未经处理的U87MG细胞和阻断的细胞。将自由的RGD-SH加入到U87MG细胞的培养基中，作用1-2小时，再加入PBS、siRNA和AuDSNSs/Cy3-siRNA(N/P＝20)复合物与细胞共培养4h，随后通过流式细胞仪检测复合物的荧光强度，结果如图14。实验结果表明，在N/P＝20的时候，未经处理的U87MG细胞相较于阻断的细胞来说表现出较高的荧光强度，且二者相比具有显著性差异，这也表明了RGD修饰的纳米材料对U87MG细胞具有较好的靶向作用。
实施例14
采用WesternBlot来评价U87MG细胞内VEGF蛋白表达情况，评估本发明合成的AuDSNSs作为基因治疗载体的转染效果。将U87MG细胞以5×105个/孔种植于6孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2下培养过夜，使细胞贴壁，弃去培养基，加入PBS、siRNA和本发明制备的AuDSNSs/siRNA(N/P＝20的DMEM培养基，继续培养24小时，裂解提取U87MG细胞总蛋白，后将蛋白质变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜，免疫反应，ECL化学发光，显影，定影，最终得到胶片图(图15)。PBS作为空白对照，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)作为内参蛋白。实验结果表明，内参蛋白GADPH的表达量在这三个实验组内保持恒定，而目标蛋白VEGF，相较于空白对照组PBS处理的细胞表达量而言，单独VEGFsiRNA处理的细胞，VEGF蛋白表达量没有明显变化，而经AuDSNSs/siRNA处理的实验组，U87MG细胞内VEGF蛋白表达量明显减少。这也证明了本发明合成的载体可以有效地携带siRNA入胞，并且实现基因治疗的目的。
实施例15
为了验证本发明合成的AuDSNSs/siRNA纳米材料具有光热治疗和基因治疗的协同联合治疗效果，将VEGFsiRNA、AuDSNSs和AuDSNSs/siRNA三组材料与细胞共孵育后经近红外激光照射，最后由CCK8比色法检测细胞存活率来评价纳米材料的治疗效果，PBS作为空白对照。将U87MG细胞以1×104个/孔种植于96孔细胞培养板中，在37℃和5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁，弃去培养基，分别加入含有PBS、siRNA、AuDSNSs和AuDSNSs/siRNA(N/P＝20)的新DMEM培养基，培养48小时后，将孔板置于808nm的激光下分别照射5分钟，未经照射的细胞作为对照组，由图16可以看出，当细胞经由AuDSNSs/siRNA复合物处理后，细胞的存活率在三个实验组中最低，加之激光照射后，细胞存活率又显著降低，达到22％左右，从而说明AuDSNSs/siRNA可以将光热治疗和基因治疗整合在一个纳米平台上，实现联合治疗。
上述实施例中siRNA和Cy3-siRNA两种核酸形式，其中Cy3-siRNA为细胞色素3标记的siRNA，类似于一种荧光色素，信息如表1所示：
表1siRNA和Cy3-siRNA的信息

Claims (10)

1.一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，包括：
(1)将柠檬酸三钠溶于超纯水中，快速加入到煮沸的氯金酸溶液里，持续反应，冷却，得到柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒；其中，柠檬酸三钠与氯金酸溶液的体积比为1.5:10；
(2)将步骤(1)中的柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒加入到氯金酸溶液中，避光搅拌，加入AgNO3和抗坏血酸AA，搅拌反应2～4h，纯化，冷冻干燥，得到金纳米星AuNSs；其中，HAuCl4、AA、AgNO3的摩尔比为500：1：40～60；
(3)将过量的巯基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺树状大分子G3.NH2的超纯水溶液中，60℃～80℃恒温反应12～48h，透析，冷冻干燥，得到部分巯基封端的聚酰胺-胺三代树状大分子G3.NH2-SH；
(4)将步骤(3)中的G3.NH2-SH溶于超纯水中，逐滴加入到步骤(2)中的AuNSs的水溶液中，搅拌12～24h，离心，洗涤，冷冻干燥，得到树状大分子稳定的金纳米星G3-AuNSs；其中，G3.NH2-SH与AuNSs的质量比为5～10:1；
(5)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应8-10小时，得到COOH-PEG-MAL；然后再将充分溶解于DMSO中的巯基封端的RGD即SH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-MAL的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；其中，SH-RGD：6-M：COOH-PEG-NH2的摩尔比为1:1～1.2:1～1.2；
(6)将步骤(5)中的COOH-PEG-RGD经过EDC和NHS活化，然后加入到步骤(4)中G3-AuNSs的DMSO分散液中，搅拌反应2～4天，离心，洗涤，冷冻干燥，得到Au-G3-PEG-RGDNSs，简称AuDSNSs；其中，COOH-PEG-RGD与AuDSNSs中树状大分子的摩尔比为4～6:1；
(7)将步骤(6)中的AuDSNSs与VEGFsiRNA共同孵育15-20分钟，得到复合物AuDSNSs/siRNA。
2.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中煮沸的时间为15～20分钟。
3.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中柠檬酸钠稳定的金纳米颗粒与氯金酸溶液的体积比为1:100～125。
4.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)MTG与G3.NH2的摩尔比为18～20:1。
5.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(5)中透析为用截留分子量1000的透析袋透析3天。
6.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中COOH-PEG-NH2的分子量为2000。
7.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中COOH-PEG-RGD、EDC和NHS的摩尔比为1:8～10:8～10。
8.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中活化时间为2～4h；离心的转速为7000-8000rpm，时间为20min。
9.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中VEGFsiRNA规格为10OD。
10.根据权利要求1所述的一种RGD修饰树状大分子稳定的功能化金纳米星/siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中AuDSNSs与VEGFsiRNA的N/P为10:1～25:1。
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