CN108815523A - 一种新型介孔硅球共载药纳米复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种新型介孔硅球共载药纳米复合物及其制备方法，所述介孔硅球共载药纳米复合物为Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp‑b‑PEG‑FA，制备方法如下：选用TEOS为硅源、CTAB为模板剂、正己烷为扩孔剂，合成具有双孔道核壳结构的介孔二氧化硅纳米粒，并对其进行了氨基化修饰；采用LSS相转移法及配位体交换反应，合成Fe3O4纳米粒，在氨基化MSN表面通过亲核取代修饰嵌合超顺磁性氧化铁纳米粒，构建磁性介孔二氧化硅纳米粒；以DCC为缩合剂酰胺化共价结合光敏剂Ce6，同时负载BCRP抑制剂Ko143；然后交联共聚物FA‑PEG‑b‑PAsp，最后负载抗肿瘤药物DOX。

Description

一种新型介孔硅球共载药纳米复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA及其制备方法。
背景技术
肿瘤是当代社会威胁人类生命健康的重大疾病，化疗是肿瘤临床治疗的重要手段之一。但目前临床常用的化疗药物不仅可对体内肿瘤细胞有杀伤作用，而且对正常组织和细胞也有广泛的杀伤，导致患者产生严重的全身性毒副作用，从而降低了患者对化疗的顺应性和临床治疗效果。因此，采用智能新型肿瘤部位靶向和缓控释载药系统将抗肿瘤药物精准高效地输送至病灶部位的研究己成为当前医药领域的热点。
随着纳米科技和纳米材料的发展以及对肿瘤微环境的深入研究，根据肿瘤微环境的生理特点设计局部环境响应性的智能型纳米载药系统是目前药剂学领域的研究热点，具有重要的理论意义和临床价值。其中利用肿瘤部位pH比正常组织较低的区别而设计的pH响应性载药系统，可使药物选择性的在肿瘤部位释放，从而降低了药物在运输过程中的渗漏，进而减少了其对正常组织部位的损害，可有效降低化疗过程中的全身性毒副作用，提高抗肿瘤效果。
无机介孔纳米材料特别是介孔硅为基础的纳米载体由于其稳定的结构，易于进行功能设计与化学修饰，良好的生物安全性，形貌、孔径、介观结构、化学组成均可通过改变反应条件来调控，尤其是介孔硅材料具有非常大的比表面积、大的孔体积而具有强大药物吸附结合能力，因而成为近年来新型纳米载药体系研究的热点。超顺磁纳米粒子生物相容性好、生物可降解，尺寸易于调控、磁各向异性和磁饱和强度较高，被广泛用于生物医学领域，包括各种分离技术、靶向药物输送系统、磁场协助放射性核素治疗、磁光热治疗、磁共振成像造影剂等，且己经被美国FDA和欧洲批准应用于缺铁性贫血的治疗和肿瘤的磁热治疗。因此，近年来基于有序介孔硅纳米材料的强大载药能力、超顺磁性Fe3O4纳米粒的靶向能力和核磁成像能力、pH响应性高分子材料为基础构建的多功能复合光敏剂纳米载药体系的构建和应用研究也是肿瘤治疗领域的研究热点之一。
肿瘤的光动力疗法是通过利用特定波长的激光或LED光照射肿瘤部位，使选择性聚集在肿瘤组织部位的光敏剂活化，生成活性很强的单线态氧与细胞内的生物大分子发生氧化反应，广泛、非特异性地作用在多种细胞器、细胞膜组织乃至核内DNA等位点，产生细胞毒性进而杀伤肿瘤细胞。与传统肿瘤疗法相比，PDT能够进行相对精确高效治疗，且副作用小。由于PDT这种广泛的、非特异性的杀伤机制，使其对化疗多药耐药的肿瘤细胞能够起到显著的杀伤作用，有效克服包括乳腺癌在内的化疗、放疗和激素治疗等因素引起的肿瘤耐药。现有技术中，关于本发明的共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA，目前还未见报道
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种新型介孔硅球共载药纳米复合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种新型介孔硅球共载药纳米复合物，所述介孔硅球共载药纳米复合物为Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA，制备方法如下：选用TEOS为硅源、CTAB为模板剂、正己烷为扩孔剂，合成具有双孔道核壳结构的介孔二氧化硅纳米粒，并对其进行了氨基化修饰；采用LSS相转移法及配位体交换反应，合成Fe3O4纳米粒，在氨基化MSN表面通过亲核取代修饰嵌合超顺磁性氧化铁纳米粒，构建磁性介孔二氧化硅纳米粒；以DCC为缩合剂酰胺化共价结合光敏剂Ce6，同时负载BCRP抑制剂Ko143，得Ce6@MMSN/Ko143纳米粒；然后交联共聚物FA-PEG-b-PAsp，最后负载抗肿瘤药物DOX。
作为本发明的一个优选实施方案，所述MSN表面氨基化方法如下：取MSN分散于无水乙醇中，搅拌均匀，在氮气的保护下，缓慢滴加硅烷偶联剂APTES，搅拌，离心收集产品，用去离子水和无水乙醇洗涤，烘干，即得有序介孔改性材料MSN-NH2。
作为本发明的一个优选实施方案，所述MMSN磁性纳米粒制备方法如下：取MSN-NH2分散于无水乙醇中，再加入Fe3O4-Br储备液，在N2保护下，恒温搅拌过夜；将产品用无水乙醇洗涤，钕铁硼磁铁分离收集，干燥，即得MMSN磁性纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述Ce6@MMSN/Ko143纳米粒制备方法如下：取MMSN分散于DMF溶液中，加入DCC和Ce6，避光搅拌，产品用DMF洗涤，钕铁硼磁铁分离，干燥，得Ce6@MMSN磁性纳米粒；取Ce6@MMSN磁性纳米粒，加入Ko143的DMF溶液，分散均匀，置入恒温摇床，25℃、200rpm避光振荡24h，钕铁硼磁铁分离收集，置于真空干燥箱干燥，得Ce6@MMSN/Ko143纳米粒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述聚合物FA-PEG-b-PAsp的制备方法如下：合成BLA-NCA，通过大分子引发剂FA-PEG-NH2引发BLA-NCA进行开环聚合得到叶酸-聚乙二醇-b-聚天冬氨酸苄酯(FA-PEG-b-PBLA)，最后通过碱性水解得到侧链为羧基的FA-PEG-b-PAsp。
作为本发明的一个优选实施方案，包括如下步骤：取Ce6@MMSN/Ko143 20mg分散于去离子水中，取FA-PEG-b-PAsp 40mg溶于去离子水中，将两种溶液混合，搅拌；加入含有NHS和EDC·HCl的混合溶液，冰浴、避光反应，加入DOX·HCl溶液，避光搅拌过夜，去离子水透析6h，透析袋的截留分子量为10KD，最后冷冻干燥，即得到负载DOX/Ko143的共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA。
本发明基于磁性介孔二氧化硅纳米复合材料构建共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA，首先采用改进方法合成粒径约100nm的介孔二氧化硅纳米粒(MSN)，并对其进行氨基化修饰，其次采用LSS相转移法合成粒径约10nm的Fe3O4纳米粒，采用配位体交换反应，将Fe3O4纳米晶体表面上的OA分子被2-溴代异丁酸(BMPA)取代，之后，在氨基化MSN表面共价结合超顺磁性氧化铁纳米粒，即得磁性介孔二氧化硅纳米粒。以DCC为缩合剂共价结合光敏剂Ce6，同时负载BCRP抑制剂Ko143，并交联共聚物FA-PEG-b-PAsp，最后负载抗肿瘤药物DOX，完成共载药纳米复合物的构建，并利用常用分析测试手段完成对该共载药纳米复合物的表征。
结果显示：Ce6的负载量约为5.7％，Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA中DOX的载药量为21.76％，pH相应性释药研究表明其具有pH敏感控制释放性能，在弱酸性条件下60h时，DOX累积释放率高达80.53％，pH响应性释药能够减少DOX在正常组织部位的释放，增加了肿瘤组织中药物浓度，能够更高效地发挥抗肿瘤作用；通过磁滞回线测试仪检测构建的共载药纳米复合物，结果显示其具有良好的超顺磁性，可以达到良好的磁靶向效果。
附图说明
附图1为共载药纳米复合物构建流程示意图。
附图2为FA-PEG-b-PAsp合成流程图。
附图3为MSN的形貌表征(a扫描电镜图；b,c透射电镜图)。
附图4为MSN粒径分布(a)及Zeta电位图(b)。
附图5为傅里叶变换红外光谱图。a萃取后的MSN；b未萃取的CTAB/MSN复合物。
附图6为MSN的氮气吸附-脱附等温线(a)和孔径分布曲线(b)。
附图7为纳米材料透射电镜图。a:Fe3O4；b:MMSN；c:Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA。
附图8为Ce6及Ce6@MMSN紫外吸收图谱。
附图9为磁滞回线及磁场作用聚集实物图。
附图10为BLA-NCA的核磁图谱。
附图11为FA-PEG-b-PBLA和FA-PEG-b-PAsp的核磁图谱。
附图12为PEG-b-PBLA和PEG-b-PAsp的核磁图谱。
附图13为Ce6紫外吸收谱图(a)及其标准曲线(b)。
附图14为DOX紫外吸收谱图(a)及其标准曲线(b)。
附图15为阿霉素体外pH响应性释放曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明基于磁性介孔二氧化硅纳米复合材料构建共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA，首先采用改进方法合成粒径约100nm的介孔二氧化硅纳米粒(MSN)，并对其进行氨基化修饰，其次采用LSS相转移法合成粒径约10nm的Fe3O4纳米粒，采用配位体交换反应，将Fe3O4纳米晶体表面上的OA分子被2-溴代异丁酸(BMPA)取代，之后，在氨基化MSN表面共价结合超顺磁性氧化铁纳米粒，即得磁性介孔二氧化硅纳米粒。以DCC为缩合剂共价结合光敏剂Ce6，同时负载BCRP抑制剂Ko143，并交联共聚物FA-PEG-b-PAsp，最后负载抗肿瘤药物DOX，完成共载药纳米复合物的构建，并利用常用分析测试手段完成对该共载药纳米复合物的表征，合成流程示意图如图1所示。
实施例
一、实验材料
(一)实验仪器
(二)实验试剂
二、实验方法
(一)介孔二氧化硅纳米粒(MSN)的合成
采用改进的法合成双孔道类核-壳结构有序介孔二氧化硅纳米粒。称取模板剂CTAB 1.0g，在水浴35℃、搅拌(300rpm)的条件下，溶解于160ml去离子水中。搅拌15min后，滴加3ml浓氨水，继续搅拌30min充分混合，形成均匀透明溶液。之后将混合于恒压滴液漏斗中的溶液(4ml TEOS和20ml正己烷)，缓慢逐滴滴入反应体系中，整个滴加过程约30min，继续反应12h，反应体系逐渐变成均一的乳白色胶体溶液，离心(7000rpm，10min)收集产品，用去离子水和无水乙醇交叉洗涤3次。然后将离心洗涤收集的固体样品(介孔二氧化硅/CTAB复合物)，用溶剂萃取法去除模板剂CTAB，将固体样品超声分散于2.0ml 5M盐酸和100ml无水乙醇混合溶液中，90℃回流搅拌5h，重复溶剂萃取操作2次，离心(7000rpm，10min)收集产品，用无水乙醇洗涤3次，最后将样品置于真空干燥箱中烘干，即得有序介孔二氧化硅纳米粒(MSN)。
(二)MMSN磁性纳米粒的制备
1、MSN表面氨基化
采用后合成法利用APTES的硅醇基与MSN表面的硅羟基发生缩合反应，将氨基嫁接到MSN上，从而获得富含氨基又不堵塞孔口的有序介孔改性材料MSN-NH2，以期为后续的功能化修饰提供更适宜的材料。操作如下：称取干燥MSN粉末200mg超声分散于100ml无水乙醇中，30℃搅拌均匀，在氮气的保护下，缓慢滴加硅烷偶联剂APTES 100μl，搅拌过夜后，离心(7000rpm，10min)收集产品，用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，然后将样品置于真空干燥箱中烘干，即得有序介孔改性材料MSN-NH2。
2、Fe3O4-Br纳米粒的制备
首先采用LSS(liquid–solid–solution)相转移法合成Fe3O4-OA，称取1.568g六水合硫酸铁铵溶解于20ml去离子水中，得Fe2+前体，为A液；称取2.0g氢氧化钠溶于20ml去离子水，超声溶解为B液；量取20ml油酸和20ml无水乙醇，超声均相为C液；B、C液超声混合均匀后，将A液滴入B、C的混合溶液里，立即出现淡绿色沉淀，数分钟后转变为棕色，将上述混合溶液利用细胞破碎仪超声5min，形成棕色均相体系，然后转移至水热釜中，密封，180℃水热反应10h。钕铁硼磁铁分离收集反应产物，用无水乙醇洗涤产物3次，置于真空干燥箱中干燥，即得Fe3O4-OA。其次，采用配位体交换反应将Fe3O4纳米晶体表面上的OA分子被2-溴代异丁酸(BMPA)取代，实验如下：称取BMPA 5.0g、柠檬酸0.5g溶于160ml氯仿/DMF(v/v＝1:1)混合溶液；在氮气环境下，加入上述油酸修饰的纳米晶体Fe3O4-OA 150mg，恒温30℃、磁力搅拌过夜，将产品离心醇洗，钕铁硼磁铁分离收集，最后分散于无水乙醇中，得Fe3O4-Br储备液，存于4℃备用。
3、MMSN磁性纳米粒的合成
通过亲核取代反应将Fe3O4纳米粒负载至改性材料MSN-NH2的表面。称取70mg干燥改性材料MSN-NH2粉末超声分散于50ml无水乙醇中，再加入10ml Fe3O4-Br醇储备液，在N2保护、30℃恒温条件下，磁力搅拌过夜；将产品用无水乙醇洗涤3次，钕铁硼磁铁分离收集，置于真空干燥箱干燥，即得MMSN磁性纳米粒。
(三)Ce6@MMSN纳米粒的制备
通过缩合剂DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)，使光敏剂Ce6羧基基团选择性地和改性介孔材料MSN-NH2表面的氨基反应。称取50mg干燥MMSN粉末超声分散于20ml DMF溶液中，加入75mg DCC和10mg Ce6，25℃、200rpm避光搅拌24h。将产品用DMF洗涤三次，钕铁硼磁铁分离，置于真空干燥箱干燥，即得Ce6@MMSN磁性纳米粒。收集DMF洗涤液，利用UV-Vis仪测定664nm波长处回收液吸光度值。
(四)Ce6@MMSN/Ko143纳米粒的制备
称取干燥Ce6@MMSN磁性纳米粒50mg，加入0.5mg/ml Ko143DMF溶液5ml，超声分散均匀，置入恒温摇床，25℃、200rpm避光振荡24h，钕铁硼磁铁分离收集，置于真空干燥箱干燥，即得Ce6@MMSN/Ko143纳米粒。
(五)FA-PEG-b-PAsp的合成
高分子聚合物叶酸-聚乙二醇-b-聚天冬氨酸(FA-PEG-b-PAsp)的合成主要分成三步，首先是L-天冬氨酸苄酯-N-羧酸酐(BLA-NCA)的合成，其次通过大分子引发剂FA-PEG-NH2引发BLA-NCA进行开环聚合得到叶酸-聚乙二醇-b-聚天冬氨酸苄酯(FA-PEG-b-PBLA)，最后通过碱性水解得到侧链为羧基的FA-PEG-b-PAsp。合成流程如图2，方法步骤如下：
1、BLA-NCA的合成
称取2.4g天冬氨酸苄酯(BLA)于连着尾气吸收装置的150ml三口瓶中，加入30ml干燥四氢呋喃，油浴升温至60℃，磁力搅拌混合均匀，加入3g三光气，反应中产生的气体通过尾气吸收装置排出，待反应物变为澄清的淡黄色溶液后，通N2以除去多余的光气及反应产生的HCl气体，取出三口瓶，通过旋转蒸发法浓缩反应液至略粘稠，随后加入适量的氯仿稀释反应液，再加入10倍体积的正己烷，将三口瓶放置于4℃沉淀12h，抽滤得到BLA-NCA的粗产物，再用乙酸乙酯/正己烷(1:1)重结晶粗产物，4℃冰箱沉淀12h后抽滤得到白色结晶，真空干燥得BLA-NCA。
2、FA-PEG-b-PBLA的合成
称取2.5g BLA-NCA加入100ml圆底烧瓶中，加入30ml干燥CH2Cl2，磁力搅拌溶解，再加入溶解在20ml干燥CH2Cl2的0.5g FA-PEG-NH2，在32℃、氮气保护下，磁力搅拌反应72h。利用旋转蒸发法浓缩反应液后，向圆底烧瓶中加入用10倍体积的无水乙醚，然后放置于4℃沉淀12h，抽滤后，将固体样品放置于真空干燥箱干燥，即得FA-PEG-b-PBLA粉末。
3、FA-PEG-b-PBLA的碱性水解
称取1g FA-PEG-b-PBLA置于100ml圆底烧瓶中，加入25ml四氢呋喃和25ml NaOH(1mol/L)溶液，室温磁力搅拌10h后，利用旋转蒸发法浓缩反应液，用0.1mol/L HCl溶液透析24h以中和未反应的NaOH，再用去离子水透析24h两次(透析袋的截留分子量为10KD)，冷冻干燥即得淡黄色色絮状FA-PEG-b-PAsp。
(六)Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA的制备
称取Ce6@MMSN/Ko143 20mg超声分散于5ml去离子水中，另取FA-PEG-b-PAsp 40mg溶于5ml去离子水中，将两种溶液混合，400rpm搅拌20min；过后加入含有NHS 4.0mg和EDC·HCl 17mg的混合溶液6ml，冰浴、避光反应4h后，加入4.0ml DOX·HCl溶液(5mg/ml)，避光搅拌过夜，去离子水透析6h(透析袋的截留分子量为10KD)后冷冻干燥，即得到负载DOX/Ko143的共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA。
(七)其它纳米复合物的构建
Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG在制备过程中与高分子聚合物反应时选用PEG-b-PAsp；Ce6@MMSN/DOX@PAsp-b-PEG-FA在制备时不加入抑制剂Ko143，其他操作方法及步骤同上。
三、表征与测试
(一)纳米材料的形貌和介观结构表征
取少量纳米材料粉末通过导电胶粘于样品台上，工作电压设定为20kV，放入样品室抽真空，利用Philips XL-30型扫描电子显微镜观察纳米粒的形貌特征并拍照记录。取少量纳米材料于适量无水乙醇中，超声分散均匀，滴加数滴于碳膜铜网上，烘干后通过高分辨透射电子显微镜(日本JEOL JEM2011型)观察实验各阶段纳米粒的微观形貌。取少量纳米材料超声分散于去离子水中，采用马尔文激光粒度-Zeta-电位测定仪检测纳米材料粒径大小、分布及Zeta电位，评价材料的稳定性能及分散特性。将适量纳米材料粉末样品置于180℃和真空的条件下，脱气至少8h，通过QuadraSorb SI吸附仪测得氮气吸附-脱附等温线。取适量纳米粒固体粉末，利用比表面积分析仪测定材料的结构参数，用BJH(Barrett-Joyner-Halanda)和BET(Barrett-Emmett-Tellter)方法计算孔径和比表面积分布，以相对压力P/P0＝0.99时的吸附量来计算孔容，以氮气作为吸附气体、炭黑作为参照物获得校准曲线。通过傅立叶变换红外光谱(FTIR)分析MSN里CTAB的去除情况，取适量粉末样品，用适量溴化钾混合研磨均匀后压片，在400～4000cm-1范围内扫描测定待测样品红外光谱，对比红外光谱峰型特征分析CTAB的去除情况。紫外-可见分光光度法(UV-Vis)对比光敏剂结合前后吸收峰的变化，表征光敏剂的成功结合，取适量光敏剂Ce6、Ce6@MMSN分别溶于DMF中，进行全波长扫描，对比吸收峰位置。
(二)纳米材料的磁性表征
磁滞回线测试仪检测纳米材料的磁饱和度和超顺磁性，通过多功能振动样品磁强计(VSM)测得，首先取适量实验各阶段的纳米材料干燥粉末装于样品杯中，然后置于磁强度范围为-15000～15000Oe的磁场中进行扫描，将测得的数据用Origin软件作图，绘制磁滞回线，并由曲线计算出每个样品的饱和磁化强度Ms(emu/g)，剩余磁化强度Mr和矫顽力Hc。
(三)聚合物的核磁表征
采用1H-NMR测试高分子聚合物FA-PEG-b-PAsp的成功合成：将适量的前体FA-PEG-b-PBLA和FA-PEG-b-PAsp粉末分别用氘代氯仿和重水溶于核磁测试管中，使用核磁共振波谱仪，在25℃、600MHz下测定样品的1H-NMR谱图，内标为四甲基硅烷。BLA-NCA、PEG-b-PBLA选用氘代氯仿作为溶剂，PEG-b-PAsp选用重水作为溶剂溶于核磁测试管中，同法测定1H-NMR谱图。
(四)Ce6@MMSN中光敏剂Ce6载药量的测定
1、光敏剂Ce6溶液标准曲线的建立
称取光敏剂Ce6 5.0mg，精密称定，置5ml棕色容量瓶中，DMF定容至刻度，得1.0mg/ml Ce6储备液，4℃下避光保存备用。用DMF将Ce6储备液配制成浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg/ml的Ce6标准溶液。利用UV-Vis仪进行全波长扫描，仪器扫描参数：始于波长800nm，终于波长200nm，扫描速度240nm/min，狭缝宽度2.0nm，采样间隔2.0nm，记录扫描曲线，获得特征吸收波长664nm。利用UV-Vis仪测定各浓度Ce6标准溶液在664nm处吸光度值，以Ce6浓度(X，μg/ml)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程。
2、Ce6@MMSN中光敏剂Ce6负载量的计算
吸取DMF洗涤液适量，利用UV-Vis仪测定回收液在664nm处的吸光度值，根据Ce6标准曲线，计算回收液中Ce6的含量，按照下列公式计算出光敏剂Ce6在Ce6@MMSN中的载药量。
(五)共载药纳米复合物中DOX载药量的测定
1、DOX溶液标准曲线的绘制
参考光敏剂标准曲线的建立方法，利用UV-Vis仪进行全波长扫描，记录扫描曲线，选择DOX的特征吸收波长481nm。用1×PBS溶液配制浓度梯度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/ml的DOX标准溶液，测定各浓度标准溶液在481nm处吸光度值，以DOX浓度(X，μg/ml)为横坐标，吸光度值(Y)为纵坐标进行线性回归，得到DOX在1×PBS溶液中紫外吸收标准曲线。
2、共载药纳米复合物DOX载药量的计算
精密称取4.0mg Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA干燥粉末，分散于100ml pH＝5.2的PBS缓冲溶液中，避光超声2h后离心(10000rpm，5min)，利用UV-Vis仪测定上层清液在481nm处的吸光度。再结合DOX的标准曲线，计算上层清液中DOX的浓度，通过公式计算载药量。
(六)共载药纳米复合物体外pH响应性释药的研究
精密称取4.0mg Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA干燥粉末，分别分散于3mlpH 5.2、pH 7.4PBS缓冲溶液中，再将溶液转移至截留分子量为10KD透析袋中，然后将透析袋放置总体积为50ml的相对应pH的PBS缓冲溶液中。37℃，200rpm避光振荡，在0.5、1、2、4、8、12、24、30、36、48、60h时，从烧杯中吸取1ml透析液，同时在补加等体积的新鲜PBS缓冲溶液。利用UV-Vis仪测定所取溶液在481nm处的吸光值，根据建立的DOX标准曲线，计算出各个时间点的累积释药百分比，绘制体外累积药物释放曲线。
累积释药计算公式：
公式中：V0：释放介质的总体积(ml)
Ct：各时间点透析液中的药物浓度(μg/ml)
V：取出的样品溶液的体积(ml)
W：0h时透析袋中的药物的含量(mg)
V×ΣC：取出的样品溶液中药物的总量(mg)
四、实验结果与讨论
(一)纳米材料的形貌及介观表征
采用改进的法合成双孔道核-壳结构介孔二氧化硅，SEM照片结果显示(图3a)，MSN呈球形且分散性好，平均尺寸约100nm；TEM照片(图3b)可看出样品具有独特的核-壳结构，形貌较为圆整，平均直径约为100nm，与SEM照片结果吻合，在高倍TEM图(图3c)中可以清晰地看到排列有序的介孔孔道，内核孔道呈立方结构，直径约为80nm，而外壳孔道呈树枝状，厚度约为10nm。这种独特的双孔道核-壳结构是由于在低浓度碱性条件下，反应速率较慢，逐步沉积生长出一层具有树枝状发散排列的介孔壳层。独特的介孔结构使MSN具有负载结合多种药物的能力，达到缓释、控释药物的效果，因此可以设计成为高效的多药载药缓释系统。马尔文激光粒度-Zeta-电位测定仪检测MSN的水合粒径及Zeta电位，平均粒径为141.1±4.8nm(图4a)，Zeta电位值为-9.21±1.4mV(图4b)。
通过傅立叶变换红外(FTIR)光谱定性分析在制备MSN过程中模板剂CTAB的去除情况。傅立叶变换红外光谱图(图5)显示，萃取后的MSN(图5a)在特征区没有明显特征吸收峰；未萃取的CTAB/MSN复合物(图5b)在波数为2800-3000cm-1的范围内具有明显特征吸收峰，2852cm-1、2922cm-1可以归属为模板剂CTAB的C-H的伸缩振动峰。实验结果表明经过两次酸性乙醇萃取后，制备的MSN中模板剂CTAB被完全去除，溶剂萃取法对MSN的骨架结构及表面的羟基影响小，能够更好的进行功能化设计和化学修饰。
为了进一步研究MSN的比表面积和孔径分布情况、量化介孔特征参数，我们对MSN进行了氮气吸附-脱附测试。MSN的氮气吸附/脱附等温线(图6a)呈现类似IUPAC提出的Ⅳ型等温线特征，并出现一大一小的滞后环，表明具有介孔特征。MSN的比表面积BET为1375m2/g，总的孔体积为2.47cm3/g，根据等温线的数据，通过BJH方法计算出MSN的孔径为5.36nm，孔径分布较窄，说明MSN具有均一的孔径(图6b)。较大的比表面积和孔容及丰富的介孔，使MSN具有更强的药物负载能力从而能够有效负载多种药物，成为一种优良的药物载体。
我们选用六水合硫酸铁铵作为前驱体，采用LSS相转移法，合成了Fe3O4-OA纳米粒，然后通过配位体交换反应将Fe3O4-OA纳米粒表面上的OA被BMPA取代，制备了Fe3O4纳米粒。TEM图(图7a)可以看出，Fe3O4纳米粒规整呈均一的球形，粒径约10nm，无团聚现象，表明Fe3O4纳米粒具有高的分散性。借助MSN表面的硅羟基，利用硅烷化试剂APTES对介孔二氧化硅进行表面氨基化修饰制得MSN-NH2，然后通过亲核取代反应将Fe3O4纳米粒子修饰在MSN-NH2的表面。图7b能明显地看出，球形的Fe3O4纳米粒分布在MSN的外壳层，MSN球形形貌依旧保持完整，同时孔道没有受到破坏仍具有有序的介观结构。通过缩合剂DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)，使光敏剂Ce6羧基基团选择性地和改性介孔材料MSN-NH2表面的氨基反应，图8为Ce6及Ce6@MMSN紫外吸收图谱，从图中可以看到在664nm均出现Ce6特征吸收峰，表明Ce6成功修饰到MSN-NH2外表面及孔道内表面。通过酰胺化反应修饰两亲性嵌段共聚物FA-PEG-b-PAsp，同时负载BCRP抑制剂Ko143及抗肿瘤药物DOX，样品记为Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA，从TEM(图7c)可以看出，嵌段共聚物FA-PEG-b-PAsp包裹在MMSN的外壳层，MMSN形貌规整，仍然保持有序的介孔结构。嵌段共聚物中聚天冬氨酸PAsp端在酸性和中性条件下的亲疏水性可作为pH响应性释放“开关”，同时PEG端增加了共载药纳米复合物的亲水性。以上结果表明我们成功构建了Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA共载药纳米复合物。
(二)纳米材料的磁性表征
超顺磁Fe3O4纳米粒制备简单，具有比表面积效应和磁效应，晶体表面易修饰可使其具有良好的生物相容性，亦可作为造影剂应用于磁共振成像，因具有上述优点，超顺磁Fe3O4纳米粒越来越多的应用于医学领域研究。我们利用VSM分别考察了Fe3O4、MMSN、Ce6@MMSN及Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA纳米材料的磁性特征并绘制磁滞回线，结果显示(图9)，纳米材料进行功能化修饰前后均具有超顺磁性，矫顽力、剩磁几乎为零；Fe3O4纳米粒的磁饱和强度高达47.6emu/g，MMSN、Ce6@MMSN和Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA磁饱和强度分别为12.6emu/g、10.5emu/g和5.3emu/g。虽然对MSN进行功能化修饰后，磁饱和强度明显下降，主要原因是因为超顺磁Fe3O4纳米粒在复合材料中所占比重逐渐降低所致，但其超顺磁性并未受到影响，图9插图结果显示在外界施加磁铁5min后，Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA可全部聚集于磁铁部位，说明其仍具有良好的的超顺磁性，可以达到良好磁靶向效果。
(三)高分子聚合物的表征
高分子共聚物FA-PEG-b-PAsp的合成是由BLA在无水THF、60℃条件下与三光气反应制得BLA-NCA；通过CH2Cl2的催化，BLA-NCA与FA-PEG-NH2发生开环聚合得到FA-PEG-b-PBLA，在碱性下水解去除苄醇最终得到共聚物FA-PEG-b-PAsp。高分子聚合物修饰于磁性介孔二氧化硅表面，提高了纳米材料的亲水性和生物相容性，同时使纳米材料具有pH响应功能，有效控制药物释放。
图10为BLA-NCA的1H-NMR谱图。如图所示，a和b分别为五元环上的亚胺基峰(δ＝6.21ppm)和次甲基峰(δ＝4.59ppm)，c为天冬氨酸侧链上的亚甲基峰(δ＝2.80-3.13ppm)，d为侧链亚甲基峰(δ＝5.20ppm)，e为苯环峰(δ＝7.38，7.27ppm)，由此可以看出产物为BLA-NCA。
图11中分别为FA-PEG-b-PBLA和FA-PEG-b-PAsp的1H-NMR谱图。图谱中a为聚乙二醇主链亚甲基吸收峰(δ＝3.65ppm)，b为天冬氨酸主链上次甲基吸收峰(δ＝4.31ppm)，c为天冬氨酸侧链上亚甲基保护峰(δ＝2.69-3.14ppm)，d为侧链保护基亚甲基(δ＝5.06-5.19ppm)，e为苯环吸收峰(δ＝7.29ppm)。对比两图谱发现侧链的保护基团吸收峰已完全消失，表明聚合物已充分水解，生成终产物FA-PEG-b-PAsp，而且各个吸收峰信号完全对应且无杂峰存在，表明合成的聚合物纯度很高。
图12为PEG-b-PBLA，PEG-b-PAsp的1H-NMR谱图。对比两图谱发现侧链的保护基团吸收峰已完全消失，说明聚合物已经完全水解，生成终产物PEG-b-PAsp，而且各个吸收峰信号完全对应且无杂峰存在，表明合成的聚合物纯度很高。
(四)Ce6@MMSN中光敏剂Ce6载药量的测定
利用UV-Vis法，测定不同浓度Ce6标准溶液紫外吸收曲线(图13a)，选择664nm作为Ce6的特征吸收波长。测定梯度浓度Ce6溶液在664nm处的吸光度值，以Ce6浓度为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)，绘制Ce6的紫外吸收标准曲线(图13b)，得回归方程：y＝0.07017x+0.0623，R2＝0.9981，0.5～20μg/ml。根据Ce6回收液的吸光度值及回归方程得出Ce6@MMSN中光敏剂Ce6载药量为5.7％。
(五)共载药纳米复合物中DOX载药量的测定
利用UV-Vis法，测定DOX标准溶液紫外吸收曲线(图14a)，选择481nm作为DOX的特征吸收波长。分别测定用1×PBS溶液配制浓度梯度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/ml的DOX标准溶液在481nm处的吸光度值，以DOX浓度(x，μg/ml)，吸光度值为纵坐标(y)，进行线性回归，绘制DOX的紫外吸收标准曲线(图14b)，建立回归方程：y＝0.0163x+0.0648，R2＝0.9999，0.5～50μg/ml。利用直线回归方程计算载药量，DOX的载药量为21.76％。
同法测定Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG载药量为18.62％，Ce6@MMSN/DOX@PAsp-b-PEG-FA载药量为19.35％。
(六)共载药纳米复合物体外pH响应性释药的研究
肿瘤组织具有独特生理结构及代谢特征，有氧糖酵解旺盛，乳酸产生较多，导致其生理微环境pH值低于正常组织。因此，选取pH5.2及7.4的PBS缓冲溶液分别模拟肿瘤组织及正常组织微环境，考察共载药纳米复合物的累积药物释放量。释放曲线表明(图15)，共载药纳米复合物在pH5.2、pH7.4PBS缓冲溶液中，60h的DOX的累积释放量分别达到80.53％、53.98％，并且在24h药物释放量接近最高，释药4h后，两种条件下的DOX累计释放率具有统计学意义，表明共载药纳米复合物具有一定的pH响应性。pH响应性主要因为高分子聚合物的PEG端具有亲水性，PAsp端为疏水性，在中性条件下，PEG-b-PAsp是与介孔硅表面有较强的相互作用紧紧环绕在介孔硅表面；在偏酸性条件下，PAsp端质子化而增强亲水性，同时发生缓慢溶胀，进而使介孔通道开放，DOX得以释放。pH响应性释药能够减少DOX在正常组织部位的释放，增加了肿瘤组织中药物浓度，能够更高效地发挥抗肿瘤作用。
本发明首先采用改进方法，选用TEOS为硅源、CTAB为模板剂、正己烷为扩孔剂，合成了具有双孔道核壳结构的介孔二氧化硅纳米粒，并对其进行了氨基化修饰，通过SEM、TEM、SAXS等检测方法对MSN介观结构和孔道性质进行一系列表征，MSN粒径大小约为100nm，形貌规整呈球形，且分散性较好，总孔容为2.47cm3/g，孔径为5.36nm，较大的比表面积和孔容，使MSN能够有效负载大量的药物，成为一种优良的药物载体。
其次我们采用LSS相转移法及配位体交换反应，合成了粒径约10nm的Fe3O4纳米粒，之后，在氨基化MSN表面通过亲核取代修饰嵌合超顺磁性氧化铁纳米粒，构建了磁性介孔二氧化硅纳米粒。以DCC为缩合剂酰胺化共价结合光敏剂Ce6，同时负载BCRP抑制剂Ko143，并交联共聚物FA-PEG-b-PAsp以改善共载药纳米复合物的生物相容性和药物控释作用，最后负载抗肿瘤药物DOX，完成了共载药纳米复合物Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA的构建。
最后我们对构建的共载药纳米复合物的特性进行了一系列的检测。Ce6@MMSN交联光敏剂Ce6的负载量约为5.7％，Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA中DOX的载药量为21.76％，pH相应性释药研究表明其具有pH敏感控制释放性能，在弱酸性条件下60h时，DOX累积释放率高达80.53％，pH响应性释药能够减少DOX在正常组织部位的释放，增加了肿瘤组织中药物浓度，能够更高效地发挥抗肿瘤作用；通过磁滞回线测试仪检测构建的共载药纳米复合物，结果显示其具有良好的超顺磁性，可以达到良好的磁靶向效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种新型介孔硅球共载药纳米复合物，其特征在于，所述介孔硅球共载药纳米复合物为Ce6@MMSN/DOX/Ko143@PAsp-b-PEG-FA，制备方法如下：选用TEOS为硅源、CTAB为模板剂、正己烷为扩孔剂，合成具有双孔道核壳结构的介孔二氧化硅纳米粒，并对其进行了氨基化修饰；采用LSS相转移法及配位体交换反应，合成Fe3O4纳米粒，在氨基化MSN表面通过亲核取代修饰嵌合超顺磁性氧化铁纳米粒，构建磁性介孔二氧化硅纳米粒；以DCC为缩合剂酰胺化共价结合光敏剂Ce6，同时负载BCRP抑制剂Ko143，得Ce6@MMSN/Ko143纳米粒；然后交联共聚物FA-PEG-b-PAsp，最后负载抗肿瘤药物DOX。
2.根据权利要求1所述的新型介孔硅球共载药纳米复合物，其特征在于，MSN表面氨基化方法如下：取MSN分散于无水乙醇中，搅拌均匀，在氮气的保护下，缓慢滴加硅烷偶联剂APTES，搅拌，离心收集产品，用去离子水和无水乙醇洗涤，烘干，即得有序介孔改性材料MSN-NH2。
3.根据权利要求1所述的新型介孔硅球共载药纳米复合物，其特征在于，MMSN磁性纳米粒制备方法如下：取MSN-NH2分散于无水乙醇中，再加入Fe3O4-Br储备液，在N2保护下，恒温搅拌过夜；将产品用无水乙醇洗涤，钕铁硼磁铁分离收集，干燥，即得MMSN磁性纳米粒。
4.权利要求1所述的新型介孔硅球共载药纳米复合物，其特征在于，Ce6@MMSN/Ko143纳米粒制备方法如下：取MMSN分散于DMF溶液中，加入DCC和Ce6，避光搅拌，产品用DMF洗涤，钕铁硼磁铁分离，干燥，得Ce6@MMSN磁性纳米粒；取Ce6@MMSN磁性纳米粒，加入Ko143的DMF溶液，分散均匀，置入恒温摇床，25℃、200rpm避光振荡24h，钕铁硼磁铁分离收集，置于真空干燥箱干燥，得Ce6@MMSN/Ko143纳米粒。
5.根据权利要求1所述的新型介孔硅球共载药纳米复合物，其特征在于，所述聚合物FA-PEG-b-PAsp的制备方法如下：合成BLA-NCA，通过大分子引发剂FA-PEG-NH2引发BLA-NCA进行开环聚合得到叶酸-聚乙二醇-b-聚天冬氨酸苄酯(FA-PEG-b-PBLA)，最后通过碱性水解得到侧链为羧基的FA-PEG-b-PAsp。
6.根据权利要求1所述的新型介孔硅球共载药纳米复合物，其特征在于，包括如下步骤：取Ce6@MMSN/Ko143 20mg分散于去离子水中，取FA-PEG-b-PAsp 40mg溶于去离子水中，将两种溶液混合，搅拌；加入含有NHS和EDC·HCl的混合溶液，冰浴、避光反应，加入DOX·HCl溶液，避光搅拌过夜，去离子水透析6h，透析袋的截留分子量为10KD，最后冷冻干燥，即得到负载DOX/Ko143的共载药纳米复合物。
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