CN102935241B - 一种用于诊断乳腺癌的mri对比剂及其制备方法 - Google Patents
一种用于诊断乳腺癌的mri对比剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于诊断乳腺癌的MRI对比剂及其制备方法。其制备方法,包括如下步骤:(1)以疏水型SPIO纳米粒子和mal-PEG-PCL为原料,制备mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束;(2)在mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入环状五肽cRGD或/和单链抗体scFv-ErbB。制备得到的用于诊断乳腺癌的MRI对比剂在敏感度和特异性上均高于现有的MRI对比剂。
Description
技术领域
本发属于生物医学工程领域,具体涉及一种用于诊断乳腺癌的MRI对比剂及其制备方法。
背景技术
全世界每年约有 120 万妇女患乳腺癌,每年有 50 万妇女死于乳腺癌,每年以 2 %~3 %的速度递增,居我国女性恶性肿瘤发病率的第一位,早期诊断是降低乳腺癌死亡率的关键。X 线摄影等乳腺常规影像学检查的敏感性及特异性较低,对一些早期浸润性乳腺癌、乳腺原位癌等的诊断有一定的漏诊率,而且在发现乳腺小病灶、多灶性、多中心性、位于乳腺深部病灶以及评估肿瘤对周围组织的侵犯方面存在很大的局限性。磁共振成像(MRI)具有良好的乳腺等软组织分辨率及空间分辨率,无放射线损伤,对发现乳腺癌具有很高的敏感性,大大提高了乳腺癌的早期检出率和诊断符合率,但其特异性仍需提高。乳腺癌早期肿瘤的病灶尺寸微小,容易发生漏诊,迫切需要敏感性和特异性更好的 MRI 技术。提高 MRI 识别效果的一个最有效途径是应用具有肿瘤靶向富集功能的特异性 MRI 对比剂。目前国内临床上所使用 MRI 对比剂基本上都是进口产品,极个别的仿制产品也效果较差,缺乏自主创新的技术和产品。
从文献报道及市场上MRI对比剂产品来看,低分子量的钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)螯合物是目前应用最多的一种T1对比剂,特点是它们易被肾脏排泄清除,血液半衰期短,作为“血池剂”(blood pool agent)使用时,效果较好。将Gd-DTPA附着在纳米粒子表面,对于延长对比剂的血液半衰期及获得靶向传输有一定的效果,一种途径是将Gd-DTPA连接到纳米树状高分子上,常用的是聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM),而PAMAM的生物相容性较差而且不能生物降解,使用后无法通过代谢途径排出体外,影响这类MRI对比剂作为诊断试剂应用。
与低分子量顺磁螯合物Gd-DTPA相比,超顺磁性铁氧化物纳米粒子(SPIO)是一种T2阴性造影剂。SPIO试剂是由分子式为Fe2 3+O3M2+O氧化铁微晶组成,当M2+为亚铁离子(Fe2+)时,SPIO具有磁性。在不存在外加磁场的情况下,SPIO内部的磁场无规取向,净磁场为零;而在外加磁场存在时,磁偶极子发生取向,从而使净磁矩急剧提高,大大缩短周围质子的T1、T2/T2* 弛豫时间,使SPIO所处局部在MR图像中与周边部位产生显著的对比,SPIO的这种MR信号对比增强作用取决于粒子的成分、粒径、材料本身的饱和磁化、在单位成像体积内粒子的浓度以及采集MRI数据时所用的物理参数。在各种基于SPIO的T2对比剂中,葡聚糖包裹亲水SPIO的溶液(商品名:Feridex,美国)是一种成熟的T2对比剂,其粒径为80~ 150nm,T2和T1弛豫度分为98.3和23.9 Fe mM-1s-1,在注射后数分钟内,即在肝和脾高度聚集(分别约占注入量的80%和5-10%),它的血液半衰期只有6分钟左右,所以Feridex只能用作肝、脾部位的显像。
整联蛋白受体只在新生血管中有高水平的表达,是乳腺癌等肿瘤新生血管成像的一个重要分子靶点;乳腺癌细胞表面的原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER-2)蛋白水平较周围正常乳腺上皮细胞高出数十倍乃至数百倍,是公认的重要肿瘤分子标志之一。
发明内容
为了克服现有技术中诊断乳腺癌的MRI对比剂存在敏感度和特异性低的问题,本发明针对整联蛋白受体和原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER-2)提供了一种敏感度和特异性高的用于诊断乳腺癌的MRI对比剂的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于,提供一种用于诊断乳腺癌的MRI对比剂。
一种用于诊断乳腺癌的MRI对比剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)以疏水型超顺磁性铁氧化物纳米粒子即疏水型SPIO纳米粒子( 制备方法参见H. Ai, C. Flask, B. Weinberg, X. Shuai, M. D. Pagel et al, “Magnetite- loaded polymeric micelles as novel magnetic resonance probe”, Adv. Mater., 2005, 17,1949-1952. )和马来酰亚氨基聚乙二醇-聚己内酯即mal-PEG-PCL为原料,制备负载疏水型SPIO纳米粒子的mal-PEG-PCL纳米胶束即mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束;
(2)在mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入环状五肽cRGD或/和单链抗体scFv-ErbB(单链抗体scFv-ErbB的制备方法参见Siyi Hu, et.al. Codon optimization, expression,and characterization of an internalizing anti-ErbB2 single-chain antibody in Pichia pastoris. Protein Expression and Purification,2006,47:249-257),其引入方法包括如下步骤:将环状五肽cRGD或/和单链抗体scFv-ErbB与mal-PEG-PCL-SPIO按照比例混合,放置过夜,即在mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入单链抗体scFv-Erb或/和单链抗体scFv-ErbB,制得用于诊断乳腺癌的MRI对比剂即双靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束。
所述的环状五肽cRGD是指含精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸的环状五肽。
作为一种优选方案,所述的环状五肽cRGD为环-(Arg-Gly-Asp-Phe-Lys)。
所述环状五肽cRGD和单链抗体scFv-ErbB可按任意体积比、质量比或摩尔比混合。
作为一种优选方案,所述的环状五肽cRGD、单链抗体scFv-ErbB和mal-PEG-PCL-SPIO的重量比为0~1000μg:0~1000μg:10~100mg。
作为一种更优选方案,所述的环状五肽cRGD、单链抗体scFv-ErbB和mal-PEG-PCL-SPIO的重量比为100~300μg:300~600μg:30~70mg。
作为一种最选方案,所述的环状五肽cRGD、单链抗体scFv-ErbB和mal-PEG-PCL-SPIO的重量比为200μg:500μg:50mg。
作为一种优选方案:步骤(1)中所述的马来酰亚氨基聚乙二醇-聚己内酯中的聚乙二醇-聚己内酯为两嵌段共聚物,其中聚乙二醇-聚己内酯段的数均分子量分别为2KD和1KD(PEG2k-PCL1k);步骤(2)中所述的放置过夜,是指在4℃下放置过夜。
所述的mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束是通过如下步骤制备得到:
(1)将疏水型SPIO纳米粒子和mal-PEG-PCL混合溶于有机溶剂中,超声下缓慢滴加到去离子水中,室温下搅拌至有机溶剂挥发完全;
(2)将上述溶液在室温下4000~6000 rpm离心20~40 min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用10000~15000rpm离心2~4h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,过滤即得;
其中,步骤(1)中疏水型SPIO纳米粒子、mal-PEG-PCL 、有机溶剂和去离子水的用量比为,0.5~1.5mg:20~40mg:0.5~1.5ml:5~20ml。
作为一种优选方案:所述的mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束是通过如下步骤制备得到:
(1)将疏水型SPIO纳米粒子和mal-PEG-PCL混合溶于四氢呋喃中,超声下缓慢滴加到去离子水中,室温下搅拌至四氢呋喃挥发完全;
(2)将上述溶液室温下5000 rpm离心30 min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用12000rpm离心3h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,用220nm水相滤头过滤即得;
其中,步骤(1)中疏水型SPIO纳米粒子、mal-PEG-PCL 、四氢呋喃和去离子水的用量比为,1mg:30mg:1ml:10ml。
作为一种优选方案:所述的环状五肽cRGD在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:将环状五肽 cRGD溶解在含EDTA 的HEPES缓冲液中,再向里面加入羟胺;其中环状五肽、HEPES缓冲液和羟胺的体积用量比为4~6:4~6:1~2。
作为一种优选方案:所述的环状五肽cRGD在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:将环状五肽 cRGD溶解在0.5ml含 10质量%EDTA的HEPES缓冲液中,再向里面加入羟胺;其中环状五肽、HEPES缓冲液和羟胺的体积用量比为5:5:2。
所述的单链抗体scFv-ErbB在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:1) 将单链抗体scFv-Erb用 EDTA溶液预处理10~20min;2) 把巯基乙胺溶解在含EDTA的磷酸盐缓冲液中,在0~8℃孵育10~20min;然后加入到步骤1)的溶液中,在30~40℃孵育,超滤离心;其中步骤1)中单链抗体scFv-Erb和EDTA的用量比为1mg:1~3μL,其中步骤2)中巯基乙胺和磷酸盐缓冲液的用量比为1g:4~6ml。
作为一种优选方案:所述的单链抗体scFv-ErbB在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:1) 将单链抗体scFv-Erb用0.5 M 的EDTA溶液预处理15 min;2) 把巯基乙胺溶解在含10μL 0.5 M EDTA的磷酸盐缓冲液中,在4℃孵育15 min;然后加入到步骤1)的溶液中,在37℃孵育90 min,然后超滤离心3次;其中步骤1)中单链抗体scFv-Erb和EDTA的用量比为1mg:2μL,其中步骤2)中巯基乙胺和磷酸盐缓冲液的用量比为1g:5ml。
一种利用本发明所述的制备方法制备得到的用于诊断乳腺癌的MRI对比剂即双靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束。
所述环状五肽cRGD和单链抗体scFv-ErbB可按任意体积比、质量比或摩尔比混合。
步骤(1)中所述的原料mal-PEG-PCL,由如下步骤合成:采用活性阴离子聚合、以醇化钾为引发剂合成烯丙基封端的聚乙二醇(Allyl-PEG-OH),然后Allyl-PEG-OH变NH2-PEG-OH,这步反应是由双键与2-氨基硫醇盐酸盐的自由基加成反应来完成;H2N-PEG-OH ( Mn = 2000 Da) 溶解到饱和碳酸氢钠水溶液中,冷却到0℃,在强烈搅拌下加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺至上述溶液得到mal-PEG-OH;用辛酸亚锡作为引发剂,引发己内酯开环,得到mal-PEG-PCL。
本发明可通过优化纳米胶束表面的环状五肽cRGD与单链抗体scFv-ErbB两种靶向配体的比例,制得100%环状五肽cRGD、100%单链抗体scFv-ErbB靶向、或50%环状五肽cRGD和50%单链抗体scFv-ErbB靶向的MRI对比剂。
负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束(PEG-PCL-SPIO纳米胶束)是通过如下步骤制备得到:
(1)将疏水型SPIO纳米粒子1 mg和PEG-PCL (即聚乙二醇-聚己内酯) 30mg的混合物溶于1 mL有机溶剂中,超声下缓慢滴加到10 mL的去离子水中,室温下搅拌至有机溶剂挥发完全;
(2)将上述溶液室温下5000 rpm离心30 min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用12000rpm离心3h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,过滤即得。
一种利用本发明所述的制备方法制备得到的用于诊断乳腺癌的MRI对比剂即双靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束。
本发明具有如下有益效果:
(1)本发明通过可生物降解的PEG-PCL纳米胶束负载超顺磁性铁氧化物,用于制备高度灵敏和高特异性的磁共振显像纳米探针,聚乙二醇(PEG)与聚已内酯(PCL)等聚酯合成嵌段共聚物,形成胶束负载 SPIO 粒子,在 PEG 链端引入反应官能团马来酰亚氨基团(mal-),用于连接靶向癌细胞的特异配体,通过优化共聚物性质和组成,调控胶束尺寸和 SPIO 装载效率,提高纳米粒子的体内传输效果和安全性。
(2)本发明在PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入环状五肽cRGD或/和单链抗体scFv-ErbB,获得对乳腺癌细胞及肿瘤新生血管内皮细胞的双靶向功能(即分别针对整联蛋白受体和HER-2两个靶点),通过发挥双靶向功能分子 1+1>2 的效应,在肿瘤细胞及肿瘤新生血管部位获得很高的局部胶束浓度,显著提高肿瘤的 MR 显影效果,提高特异性,实现乳腺癌的早期诊断。完成优化的 MRI 对比剂的临床前安全性评价研究;
(3)本发明以可降解聚合物(PEG-PCL)胶束负载表面疏水的SPIO,可以使胶束成为一种高敏感性的MRI T2对比剂,通过结构控制,本发明所述的MRI对比剂的MRI敏感性显著高于目前市场上的T2对比剂,聚合物胶束具有体内循环时间长的突出特点,合理的胶束结构设计可以减少胶束非特异性网状内皮系统(例如肝、脾等)的吸收;而且通过在胶束表面引入靶向效果明确的环状五肽cRGD和单链抗体scFv-ErbB,可以使聚合物胶束对肿瘤及其新生血管内皮细胞具有高度靶向传输功能,上述措施的共同作用使得胶束在肿瘤部位高浓度富集而提高显像效果,促进对乳腺癌的早期诊断和治疗,是一种用于乳腺癌早期诊断的新型高效靶向MRI对比剂。
附图说明
图1 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的粒径动态光散射分布图;
图2负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束透射电镜形貌图;
图3负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束在血清中的稳定性图;
图4负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束磁滞回线图;
图5负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束与负载亲水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束MRI T2 Mapping图;
图6负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束与负载亲水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束弛豫率回归分析图;
图7负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束与负载亲水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束弛豫率回归分析图;
图8cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束动物实验MRI T2*图;
图9 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明,但实施例对发明不做任何形式的限定。
实施例1 mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的制备
(1)将疏水型SPIO纳米粒子1 mg和mal-PEG-PCL 30mg的混合物溶于1 mL四氢呋喃中,超声下缓慢滴加到10 mL的去离子水中,室温下搅拌至有机溶剂挥发完全;
(2)将上述溶液室温下5000 rpm离心30 min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用12000rpm离心3h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,用220nm水相滤头过滤过滤即得。
实施例2 cRGD-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的制备
(1)取0.5mg环状五肽 cRGD溶解在0.5ml 含10%质量分数EDTA 的HEPES缓冲液中,再向里面加入0.2ml羟胺,备用;(2)mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束与经步骤(1)处理过的环状五肽cRGD复合过夜,再超速离心除去游离的环状五肽cRGD,用220nm水相滤头过滤,制得cRGD-PEG-PCL-SPIO纳米胶束。本实施例所用的环状五肽 cRGD英文名称为cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-Lys),生产厂家为美国Creative Peptides,分子式为C27H41N9O7,规格为5mg。
实施例3 scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的制备
(1)单链抗体scFv-Erb 5mg用10 μL 0.5 M 的EDTA溶液预处理15 min;(2)把0.1g 巯基乙胺溶解在0.5 mL含10μL0.5 M EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS)中,在4℃孵育15 min;然后加入到步骤(1)的溶液中,在37℃孵育90 min,然后超滤离心3次(用PBS洗涤含EDTA),除掉过量的巯基乙胺;(3)经步骤1和2处理过的单链抗体scFv-Erb立即按照比例与mal-PEG-PCL-SPIO混合,在4℃放置过夜,即在mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入单链抗体scFv-Erb,制得scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束。
实施例4 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的制备
(1)取0.5mg环状五肽 cRGD溶解在0.5ml 含10%质量分数EDTA 的HEPES缓冲液中,再向里面加入0.2ml羟胺,备用;
(2)将单链抗体scFv-Erb 5mg用10 μL 0.5 M 的EDTA溶液预处理15 min;然后把0.1g 巯基乙胺溶解在0.5 mL含10μL0.5 M EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS)中,在4℃孵育15 min;再将上述处理过的单链抗体scFv-Erb和巯基乙胺混合,在37℃孵育90 min,然后超滤离心3次(用PBS洗涤含EDTA),除掉过量的巯基乙胺;
(3)将经步骤(1)处理过的环状五肽 cRGD和经步骤(2)处理过的单链抗体scFv-Erb按体积比1:1混合,在4℃放置过夜,即制得cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束。本实施例所用的环状五肽 cRGD英文名称为cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-Lys),生产厂家为美国Creative Peptides,分子式为C27H41N9O7,规格为5mg。
实施例5负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束(PEG-PCL-SPIO纳米胶束)的制备
(1)将疏水型SPIO纳米粒子1 mg和PEG-PCL 30mg的混合物溶于1 mL有机溶剂中,超声下缓慢滴加到10 mL的去离子水中,室温下搅拌至有机溶剂挥发完全;
(2)将上述溶液室温下5000 rpm离心30 min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用12000rpm离心3h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,过滤即得。
实施例6 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的粒径动态光散射分布
用粒度测定仪检测负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束样品的粒径,入射激光波长λ=532 nm,入射角θ=90°,温度为25℃;粒径值取三次测量值的平均值。
粒径对纳米胶束在动物体内的循环时间也有影响,粒径小,容易透过血脑屏障,不易被肝脏血窦吸收,所以循环时间相对较长,我们选用小粒径纳米胶束用来连接靶向分子做动物实验体内循环显像,制备出双靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束,粒径数据为39.9±2.3nm。
实施例7负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束透射电镜形貌
胶束样品的形貌用透射电镜进行表征,将制备好的胶束样品稀溶液取一滴滴在纯碳膜的铜网上,在室温下放入干燥器中干燥。用型号为 JEOL JEM-2010HR 的透射电镜下观察,找样品均匀浓度合适的区域拍照。
从图2可以看出,通过我们制备的窄分布的嵌段共聚物的样品,制备胶束后,未经任何其它特殊处理得到的胶束粒径在35nm左右分布比较均匀,这为我们制备较小粒径的功能型纳米颗粒提供了比较好的基础。SPIO负载后的胶束粒径略有增大,粒径要增大5~10nm,但都保持了均匀分布,我们甚至能够清晰的分辨出疏水内核中单个的SPIO纳米粒子。聚合物连接靶向分子后,胶束粒径与基本形貌没有太大变化,验证体系稳定性。
实施例8 负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束在血清中的稳定性
胶束稳定性可以通过其在血清中粒径变化来测量,纳米胶束在血清中粒径测试方法为取1mg/ml浓度的样品1ml,加入到10ml的10%胎牛血清中,分别间隔12h测一次粒径变化,从图3中可以看到 ,负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束的粒径变化不大,故再次验证胶束稳定性很好。
实施例9 负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束的磁滞回线
为了产生理想的MRI信号强度对比,所用的MRI造影剂应该具备在外加磁场撤出时能迅速将磁矩释放。因此,SPIO被PEG-PCL胶束负载后能不能保留超顺磁性是一个非常重要的参数。疏水型SPIO和两个PEG-PCL-SPIO样品的磁滞回线,测试温度为10 K和300 K。在10 K下,三个样品都表现出铁磁性(ferromagnetic),疏水型6 nm SPIO的矫顽磁力为 240 Oe,小粒径PEG-PCL1k-SPION和大粒径PEG-PCL7k-SPIONs两样品的矫顽磁力分别为220 Oe和230 Oe。在室温下,三个样品都表现为超顺磁性,零矫顽力和零净磁化强度。疏水型6 nm SPIO的饱和磁化强度64.7 Fe emu g-1,小粒径PEG-PCL1k-SPION和大粒径PEG-PCL7k-SPIONs两样品的饱和磁化强度分别为65.6 和64.4 Fe emu g-1,10 K和300 K下的矫顽力和饱和磁化强度数据说明负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束的磁化性能没有改变。
实施例10负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束与负载水溶性SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束磁共振成像(MRI)T2 Mapping及弛豫率回归分析。
通过测试含有胶束样品的水溶液中质子的横向和纵向弛豫时间(T1和T2)考察了PEG-PCL聚合物胶束负载SPIO磁纳米粒子做为MRI显像试剂的灵敏度。MRI成像的基本原理是,水中质子沿着外加磁场的横向和纵向的自旋弛豫动力学的局部差异产生图像对比度差异。因此缩短质子纵向(自旋-晶格)弛豫时间(T1)使在含造影剂的部位T1加权信号变亮或缩短质子横向(自旋-自旋)弛豫时间(T2)使在含造影剂的部位T2加权信号变暗可以增强正常组织很病变组织的明暗强度差异,改善图片质量,提高病变的有效检出率。MRI造影剂也根据作用在纵向弛豫度r1或横向弛豫度r2的不同而分成两种,一种是T1造影剂,另一种是T2造影剂,其中r1影响纵向弛豫时间T1,r2影响横向弛豫时间T2。T2造影剂是中负性MRI显影剂,可以是组织的信号变暗。T2造影剂的r2和r2/ r1越高,其成像效果越好。我们用小分子表面活性剂把疏水型SPIO表面改性制备成水溶型的WSPIO用做对照样品。
PEG-PCL胶束负载的SPIO的r2均有所增强,而r1都有所减弱。水溶性铁纳米粒子(WSPIO)的r2为40 Fe mM-1s-1、r1为3.2 Fe mM-1s-1, 小粒径PEG-PCL1k-SPION的r2为108.1 Fe mM-1s-1、r1为1.7 Fe mM-1s-1,大粒径PEG-PCL7k-SPIONs的r2为221.2 Fe mM-1s-1、r1为2.1 Fe mM-1s-1。这都导致了PEG-PCL胶束负载的SPIO的r2/r1值显著增加,这暗示了PEG-PCL负载的SPIO作为T2造影剂的灵敏度会显著增强。
实施例11 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束的动物实验
采用雌性裸鼠(体重25±3 g)做乳腺癌动物模型,10%水合氯醛麻醉状态下注射200μL无血清BT474细胞培养液(含肿瘤细胞1×107个)构建皮下移植肿瘤模型,移植瘤长到直径为3-5mm时用于MRI显像。样品调成0.9%NaCl的溶液,通过尾静脉注射进入裸鼠体内,应用剂量为10 mg Fe/kg。MRI扫描仪为荷兰产的Philips Inter,磁场强度为1.5T,测试用上海晨光医疗科技有限公司生产的246 mm×106mm×131mm老鼠用线性极化鸟笼射频核磁共振线圈。尾静脉注射样品后用场回波-梯度回波(FFE-GRE)梯度回波T2加权成像,参数设置如下:TR/TE,200/14.7 ms;翻转角度,25度,FOV,80 mm;矩阵,256×256,切片厚度,1 mm,记录不同时间点裸鼠肿瘤MRI信号强度值。肿瘤内MRI成像T2弛豫时间测试采用单区域多自旋回波(2000/144)方法,梯度回波时间,八梯共18-144 ms;回波间距,18 ms;FOV,80 mm;矩阵,256×256,切片厚度1 mm。由厂家提供的软件用最小二乘回归的方法计算出T2 maps,观察双靶向组肿瘤内的信号强度。
胶束样品注射前0h到注射后5h内后老鼠乳腺癌病灶部位T2-加权图像均变暗,说明胶束在肿瘤内持续性累积,更重要是老鼠T2-加权图像强烈的证明了小粒径的双靶向样品cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束(图8信号值从0h的1.59降低至5h 的0.48)样品的肿瘤内的吸收增强,而靶向肿瘤内的吸收增强,同时靶向样品信号降低程度明显降低程度强,与非靶向造影剂相比,靶向特异性胶束能够更早地检测到肿瘤的生成充分验证了聚合物发挥双靶向分子的协同增效作用,提高MRI对比剂的敏感度和特异性,从而促进MRI在乳腺癌早期诊断中的应用。
实施例12 cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束血液半衰期实验
本研究用原子吸收分光光度法测定血液中铁含量变化并计算负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束的t1/2 。血液样品用10%HCL溶解5d,通过原子吸收分光光度计测铁含量。
超小型超顺磁氧化铁粒子(USPIO)的体内半衰期为200min,而我们所制备的对比剂由于将粒径控制在40nm以下,而且经PEG-PCL包裹,使体内半衰期延长至300min小时以上,不仅有利于将更多的磁性粒子输送到肿瘤部位,进行肿瘤的早期诊断,而且也是一种极佳的血池型对比剂。在不同的磁场内,该对比剂信噪比(signal noise ratio,SNR)及对比噪声比(contrast noise ratio,cNR)在平衡期均下降缓慢,形成一个较长的平台期,这一特点可明显提高平台期的SNR和CNR,有利于进行高分辨成像,所以本研究合成的纳米胶束是一种性能优良的MRI对比剂,该纳米胶束经过单链抗体scFv-ErbB表面修饰后,血液半衰期大大延长,具有潜在应用价值。具体数据见表1。
实施例13 负载疏水型SPIO纳米粒子的PEG-PCL纳米胶束溶血实验
血细胞悬液的配制:取兔血5ml,加入洁净干燥的小烧杯中,用玻棒轻轻搅拌除去纤维蛋白原。加入0.9%氯化钠溶液约10倍量,摇匀,离心15分钟(1500r/min)、倾去上清液,反复3次至上清液呈无色为止。量取血球0.7ml,加生理盐水稀释至35ml,成2%的混悬液供试验用。本实验采用采用新鲜兔血作为研究对象。
液溶血试验观察:取试管7支,按下列顺序加入各种溶液,第1到第5管为受试物管,纳米胶束浓度为10mg/ml,1-6号管依次为0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml,7号管为阴性(生理盐水)对照管,8号管为(蒸馏水)阳性对照管。依次加入2%红细胞悬液、生理盐水和蒸馏水后轻轻摇匀,立即置37℃恒温箱中进行温育。观察并记录0min、15min、30min、45min、1h、2h、3h的结果。
如溶液变清并染红色,即表示溶血,必要时可用显微镜观查红细胞是否破裂。如候选药物0.3ml,在0.5h内引起溶血者即不宜作注射用。最好是候选药物在0.3ml,3h内不引起溶血。
温育15min后,受试物的8号试管中(阳性对照)溶液皆呈较澄明红色,管底有少许红细胞残渣,表明有溶血发生。至3h时,受试物管与阴性对照管均未见溶血现象。显微镜下观察:1-6号(0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、5 mg/ml)受试物管内溶液红细胞形态未见异常;6号管(生理盐水管)内溶液红细胞形态未见异常。7号管(蒸馏水管)可见少量红细胞,但视野内大多为变形红细胞及碎片,未见不能分散沉淀。通过试验结果表明7号阳性对照管有溶血发生。7号阴性对照管无溶血发生。1-6号受试物管中无溶血现象以及凝聚发生。受试物管中的溶液在3小时内未发生溶血。吸取上清液,置分光光度计比色皿中,于545 nm处测量吸光度,也未见明显变化。因此,据实验结果认为5 mg/ml纳米胶束浓度不会引起溶血反应。
Claims (7)
1.一种用于诊断乳腺癌的MRI对比剂的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)以疏水型超顺磁性铁氧化物纳米粒子即疏水型SPIO纳米粒子和马来酰亚氨基聚乙二醇-聚己内酯即mal-PEG-PCL为原料,制备负载疏水型SPIO纳米粒子的mal-PEG-PCL纳米胶束即mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束;
(2)在mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入环状五肽cRGD和单链抗体scFv-ErbB,其引入方法包括如下步骤:将环状五肽cRGD和单链抗体scFv-ErbB与mal-PEG-PCL-SPIO混合,放置过夜,即在mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束表面引入环状五肽cRGD和单链抗体scFv-ErbB,制得用于诊断乳腺癌的MRI对比剂即双靶向cRGD/scFv-ErbB-PEG-PCL-SPIO纳米胶束;
步骤(2)中所述环状五肽cRGD在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:将环状五肽cRGD溶解在含EDTA的HEPES缓冲液中,再向里面加入羟胺;其中环状五肽、HEPES缓冲液和羟胺的体积用量比为4~6:4~6:1~2;
所述单链抗体scFv-ErbB在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:1)将单链抗体scFv-ErB用EDTA溶液预处理10~20min;2)把巯基乙胺溶解在含EDTA的磷酸盐缓冲液中,在0~8℃孵育10~20min;然后加入到步骤1)的溶液中,在30~40℃孵育,超滤离心;所述步骤1)中单链抗体scFv-ErB和EDTA的用量比为1mg:1~3μL,所述步骤2)中巯基乙胺和磷酸盐缓冲液的用量比为1g:4~6ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(1)中所述的马来酰亚氨基聚乙二醇-聚己内酯中的聚乙二醇-聚己内酯为两嵌段共聚物,其中聚乙二醇-聚己内酯段的数均分子量分别为2KD和1KD;步骤(2)中所述的放置过夜,是指在4℃下放置过夜。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束是通过如下步骤制备得到:
(1)将疏水型SPIO纳米粒子和mal-PEG-PCL混合溶于有机溶剂中,超声下缓慢滴加到去离子水中,室温下搅拌至有机溶剂挥发完全;
(2)将上述溶液在室温下4000~6000rpm离心20~40min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用10000~15000rpm离心2~4h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,过滤即得;
其中,步骤(1)中疏水型SPIO纳米粒子、mal-PEG-PCL、有机溶剂和去离子水的用量比为,0.5~1.5mg:20~40mg:0.5~1.5ml:5~20ml。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述的mal-PEG-PCL-SPIO纳米胶束是通过如下步骤制备得到:
(1)将疏水型SPIO纳米粒子和mal-PEG-PCL混合溶于四氢呋喃中,超声下缓慢滴加到去离子水中,室温下搅拌至四氢呋喃发完全;
(2)将上述溶液室温下5000rpm离心30min,除去下层大的聚集体;将上层溶液再用12000rpm离心3h,弃去上层液体,将下层沉淀用去离子水洗涤除去空胶束后,在超声下加去离子水将样品重新分散,用220nm水相滤头过滤即得;
其中,步骤(1)中疏水型SPIO纳米粒子、mal-PEG-PCL、四氢呋喃和去离子水的用量比为,1mg:30mg:1ml:10ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的环状五肽cRGD在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:将环状五肽cRGD溶解在0.5ml含10%质量分数EDTA的HEPES缓冲液中,再向里面加入羟胺;其中环状五肽、HEPES缓冲液和羟胺的体积用量比为5:5:2。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的单链抗体scFv-ErbB在与mal-PEG-PCL-SPIO混合前经过如下步骤处理:1)将单链抗体scFv-ErB用0.5M的EDTA溶液预处理15min;2)把巯基乙胺溶解在含10μL0.5M EDTA的磷酸盐缓冲液中,在4℃孵育15min;然后加入到步骤1)的溶液中,在37℃孵育90min,然后超滤离心3次;其中步骤1)中单链抗体scFv-ErB和EDTA的用量比为1mg:2μL,其中步骤2)中巯基乙胺和磷酸盐缓冲液的用量比为1g:5ml。
7.一种由权利要求1~6任一项所述制备方法得到的用于诊断乳腺癌的MRI对比剂。
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