CZ306167B6 - Superparamagnetické nanočástice oxidu železa s vylepšenými T2 relaxačními indexy pro zobrazování magnetickou rezonancí a způsob jejich přípravy - Google Patents

Abstract

Superparamagnetické nanočástice oxidu železa, zejména pro využití v magnetické rezonanci (MRI) jako negativní kontrastní látky na bázi oxidu železa, složené z jádra oxidu železa tvořeného nestechiometrickým super paramagnetickým Fe.sub.3.n.O.sub.4.n. a povrchové slupky tvořené kyselinou 2-amino-tereftalovou (ATA) nebo kyselinou tereftalovou (TA).

Description

Superparamagnetické nanočástice oxidu železa s vylepšenými T₂ relaxačními indexy pro zobrazování magnetickou rezonancí a způsob jejich přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká superparamagnetických nanočástic oxidu železa (SuperParamagnetic Iron Oxides - SPIO) s vylepšenými T₂ kontrastními vlastnostmi danými povrchovou vrstvou πkonjugovaných molekul pro využití v zobrazování magnetickou rezonancí (Magnetic Resonance Imaging - MR1) a způsobu jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Doposud bylo zjištěno, že ve vodě stabilní, koloidní suspenze anorganických částic o velikosti nanometrů mají vysoký technologický potenciál v mnoha oblastech lékařské diagnostiky a terapie [(a) Lee, N.; Hyeon, T. Chem. Soc. Rev. 2012,41, 2575. (b) Xie, J.; Liu, G.; Eden, H. S.; Ai, H.; Chen, X. Acc. Chem. Res. 2011, 44, 883]. Superparamagnetické nanočástice oxidů železa (SPIO), zvláště ty s obsahem jader magnetitu (Fe₃O₄) nebo maghemitu (Y-Fe₂O₃), jsou používány jako magneticky detekovatelné značky neboli kontrastní látky, zvyšující kontrast při zobrazování magnetickou rezonancí (MRI magnetic resonance imaging ) nebo jako magnetické nosiče při cíleném transportu léčiv, v protinádorové terapii pomocí magnetické fluidní hypertermie, v biosenzorech a jako součásti různých diagnostických přístrojů [(a) Cheng, K.; Peng, S.; Xu, C.; Sun, S. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 10637. (b) Piao, Y.; Kim, J.; Na, Η. B.; Kim, D.; Baek, J. S.; Ko, Μ. K.; Lee, J. H.; Shokouhimehr, M.; Hyeon, T. Nat. Mater. 2008, 7, 242. (c) Lu, A-H.; Salabas, E. L.; Schůth, F. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 1222. (d) Mahmoudi, M.; Hosseinkhani, H.; Hosseinkhani, M.; Boutry, S.; Simchi, A.; Joumeay, W. S.; Subramani, K.; Laurent, S. Chem. Rev. 2011,111,253].

Kontrastní látky pro MRI jsou syntetické systémy, které slouží ke zvýšení viditelnosti zobrazovaných orgánů a tkání v klinické praxi. Kontrastní látky pro MRI ovlivňují (urychlují) relaxační časy atomů uvnitř zobrazovaných tkání skrze magnetickou interakci. Tyto látky jsou podávány perorálně nebo intravenózně. Při použití MRI jako diagnostického prostředku v klinické praxi jsou zobrazované části těla vystaveny silnému magnetickému poli (obvykle 1,5T až 3T, kde 1 T = 1 Tesla). Poté jsou aplikovány radiofrekvenční pulsy za účelem ovlivnění spinových relaxačních procesů (TI = spin-mřížková, T2 = spin-spinová) atomů vybraných tkání (obvykle protony vodíku, H). Po vypnutí radiofrekvenčních pulsů spiny relaxují zpět do rovnovážného stavu. Tento proces relaxace vyzařuje energii ve formě elektromagnetického signálu, který je detekován a převeden do obrazové podoby. Snímky jsou získávány v TI nebo T2 vážených obrazech na základě vyhodnocení signálu z pohledu TI (longitudinální) nebo T2 (transverzální) relaxačních časů. [Magnetic Resonance Imaging: Physical Principles and Applications. Vadim Kuperman, Academic Press (USA), 2000. ISBN:0-12-429150-3],

V současnosti nejpoužívanější a lékařsky ověřené sloučeniny pro zvýšení kontrastu sledovaných orgánů a tkání za použití MRI jsou založeny na bázi gadolinia (Gadovist, Omniscan, Primovist aj.). Tyto látky se označují jako pozitivní kontrastní látky (tzv. hyperintenzní) zkracující relaxační dobu TI. Druhým typem kontrastních látek pro MRI jsou tzv. negativní (hypointenzní) kontrastní látky na bázi SPIO. Tyto kontrastní látky se skládají z nanočástic oxidů železa (nejčastěji Fe₃O₄ či gama-Fe₂O₃) ve formě vodné koloidní disperze a jejich účinek na zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) je založen především na snížení T₂ signálu (negativní kontrast) absorbující tkání. SPIO kontrastní látky byly úspěšně použity pro diagnostiku jatemích nádorů nebo jiných orgánů, byly např. použity i na zobrazení gastrointestinálního traktu. [Yi-Xiang J. Wang Quantitative Imagine in Medicine and Surgery 2011, 1, 35], V literatuře jsou nejčastěji rozděleny SPIO kontrastní látky oxidů železa na: (i) Super paramagnetický oxid železitý (SPIO) a (ii) velmi

Syntetické magnetické nanosystémy na bázi SPIO musí, aby byly aplikovatelné jako kontrastní látky při MRI, vykazovat současně následující vlastnosti:

(a) vysokou hodnotu saturační magnetizace (obvykle více než 40 emu/g), (b) superparamagnetické chování při nízkých magnetických polích (< 1 T), (c) biokompatibilitu, nízkou cytotoxicitou (d) koloidní chování SPIO suspenze ve vodném prostředí (tzv. ferofluidy) (e) schopnost zvyšovat Ri (l/Τι) a/nebo R₂ (1/T₂) relaxační indexy neboli dosáhnout krátkých relaxačních časů zobrazovaných tkání) [(a) C. Tu, A. Y. Louie, Wires Nanomedicine and Nanobiotechnology 2012, doi : 10.1002/wnan.ll70. (b) D. P. Cormode, T. Skajaa, Z. A. Fayad, W. J.M. Mulder Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2009, 29, 992. (c) Na, Η. B.; Song, I. C.; Hyeon, T. Adv. Mater. 2009, 21,2133],

Komerční magnetické nanočástice na bázi oxidů železa (typu SPIO), vytvořené pro účely zvýšení kontrastu v T2 vážených sekvencích, byly v posledních letech na trhu prodávány pod označením: Lumírem® (velikost částic > 300 nm, negativní T₂ látka, používaná pro snímání gastrointestinálního traktu, perorální podání), Abdoscan® (velikost částic 200-300 nm, negativní T₂ látka, používaná pro snímání gastrointestinálního traktu, perorální podání), Resovist ® (velikost částic 100 až 200 nm, negativní T₂ látka, orgánově specifická pro zobrazení jater a lymfatických uzlin, intravenózní podání), Sinerem ® (velikost částic 40 nm, negativní T₂ látka, orgánově specifická, používaná pro zobrazení jater, lymfatických uzlin, intravenózní podání), NC-100150 ® (velikost částic 20 nm částice, k zobrazení jater, intravenózní podání). Biodistribuce se liší v závislosti na velikosti částic SPIO; SPIO systémy o velikostech > 20 nm vykazují absorpci játry (RES), cca 20 nm částice tvořící klastry až do velikostí řádově jednotek mikrometrů jsou podávány perorálně; částice v rozmezí 10 až 20 nm jsou pohlcovány lymfatickými uzlinami, používají se v angiografii či k zobrazení kardiovaskulárního systému, jsou to látky určené do krevního řečiště a částice ve velikostním rozsahu 4 až 6 nm jsou cíleně učené pro značení hepatocytů.[http://www.medcyclo- paedia.com/library/topics/volume_i/rn/mr_contrast_medium.aspx. Většina kontrastních látek pro MRI na bázi nanočástic oxidů železa již není v současnosti komerčně dostupných na farmaceutickém trhu, s výjimkou perorální látky oxidu železitého MRI, Lumirem®/Gastromark ®.

U všech kontrastních látek typu SPIO je povrch magnetického jádra vždy potažen povrchovou vrstvou z organického materiálu za účelem dosažení stability a snížení případné toxicity nanočástic (in vitro a/nebo in vivo). Holé, povrchově nestabilizované (neobalené) nanočástice typu SPIO mají tendenci agregovat do velkých klastrů a není je proto možné použít v klinické praxi [O. V. Salata J.Nanobiotech. 2004, 2,12. doi: 10.1186/1477-3155-2-12].

Chemické složení, velikost a morfologie super paramagnetického jádra stejně tak i vlastnosti povrchové diamagnetické vrstvy mají zásadní význam pro biotechnologické aplikace SPIO nanočástic [(a) Na, Η. B.; Song, I. C.; Hyeon, T. Adv. Mater. 2009, 21, 2133. (b) M . Mahmoudi, A. Simchi, A.S. Milani, P. Stroeve J. Coll. Interf. Sci. 2009, 336, 510].

Syntetické postupy vedoucí k povrchové modifikaci nanočástic pomocí různých polymemích látek a příprava ferofluidních nanočásticových kapalin byly podrobně zkoumány a jsou popsány v literatuře [A. K. Gupta, M. Gupta Biomaterials 2005, 26, 3995]. Obecný přístup je založen na přídavku ve vodě-rozpustných a biokompatibilních ligandů, a to buď přímou adsorpcí na povrch, přidáním různých molekulárních vrstev, výměnou ligandů, a/nebo iontovými interakcemi. Jiné přístupy vychází z přímé in situ tvorby hydrofilních nanočástic v přítomnosti stabilizujících ligandů jakými jsou cukry (např. dextran, d-manóza), poly-alkoholy (např. polyethylenglykol (PEG)), polyvinylalkohol (PVA), dendrimery či polymery (např. HOOC-PEG-COOH), obsahující dvě nebo více funkčních skupin umožňujících reagovat s povrchem částic.[J. K. Oh, J. M. Park Prog. Pol. Sci. 2011,36, 168], Dále bývají používány organosilany jako je tetraethyl orthosilicate (TEOS), aminopropyltriethoxysilan (APTES), (3aminopropyl) trimethoxysilan (APTMS) nebo oxid křemičitý (SiO₂). Mezi nimi je APTES jednou z nejčastěji používaných látek k výrobě aminosilanu (SiO^-NHÚ noskvtuiícího SiO₂-NH₂-Dokrvté SPIO (SPIO®SiO₂-NH₂) nanočástice kombinující dobrý buněčný příjem a zároveň vykazují nízkou cytotoxicitu [X-M. Zhu, Y-X. J. Wang, K. C-F. Leung, S-F. Lee, F. Zhao, D-W. Wang, J. Μ. Y. Lai, C. Wan, C. Η. K. Cheng, A. T. Ahuja, Int. J. Nanomedicine 2012, 7,953.]

Konstrukce magnetických systémů vycházejících ze syntetických postupů popsaných výše mohou vést k různým typům morfologií, jako jsou např. „core-shell“ systémy magnetické jádropolymemí slupka (A), shluk magnetických jader zapouzdřených do polymemí matrice (B), magnetické nanočástice imobilizované na povrchu polymemí matrice (C), větvené polymemí řetězce navázané k magnetickému jádru (D). Tyto morfologicky různorodé struktury jsou jako ukázkový 10 příklad znázorněny v grafické podobě na obr. 1.

V drtivé většině nanočástic typu SPIO pro MRI má magnetické jádro na svém povrchu diamagnetické organické látky obsahující σ -konjugované řetězce. Tyto řetězce obsahují některé další volné funkční skupiny (-OH,-COOH,-NH₂). Například: (i) Feridex®, SPIO koloid modifikovaný 15 nízkým molekulárním dextranovým povlakem o velikosti částic 120 až 180 nm. Relaxivity r₂ a η nabývají hodnot 98,3 a 23,9 mM'¹ sec '. (ii) Resovist ®, nazývaný také Ferucarbotran (Resovist, Bayer Healthcare), jsou SPIO částice potažené karboxydextranem s hydrodynamickým průměrem pohybujícím se mezi 45 a 60 nm. Relaxivity r₂ a η jsou 151,0 a 25,4 mM'¹ sec'¹ (iii) Clariscan™ (PEG-fero, Feruglose, NC100150) vyvinutý dřívějším Nycomed Imaging (nyní součástí 20 firmy GE Healthcare) je tvořený SPIO částicemi, které jsou složeny z jednotlivých krystalů (v průměru mezi 4 a 7 nm), ty jsou stabilizovány vrstvou z polyethylen glykolu (PEG). Výsledný průměr částic NC100150 je přibližně 20 nm. Některé současné patenty dále poukazují na široké použití molekul obsahujících dlouhé alifatické řetězce jako povrchových vrstev SPIO částic: (iv) polyolové a polyetherové komplexy oxidu železa jako farmakologické a/nebo MRI kontrastní 25 látky, AMAG Pharmaceuticals Inc,.

V přihlášce vynálezu CN 102935241 je popsána nanomicela sestávající ze superparamagnetic. . ..cLkýclimanočástic.oxidu železa (SPIO) pokrytých sloupkou kopolymeru mal-PEG-PCL (kopolymer povrchu které je následně navá30 ’ - záwc-yklický-peptid (cRGD) nebo jednořetězovýfragment protilátky (scFv-ErbB). Náš vynález se týká SPIO částic s ATA nebo TA pí konjugovanými molekulami na povrchu. Tato povrchová slupka zapříčiňuje zvýšení MR kontrastu jako takového na rozdíl od všech doposud konjugovaných povrchových slupek typu dextran, PEG, aj.

V přihlášce vynálezu CN 103893783 je popsán nanokompozit sestávající ze superparamagnetických nanočástic oxidu železa (SPIO) pokrytých sloupkou biokompatibilního kopolymeru polyethylenglykolu, poly-e-kapronolaktonu a dextranu, na povrchu které jsou vázány oligopeptidové aptamery. V celém patentu není zmínka o pí konjugovaných molekulách na povrchu SPIO nanočástic.

Ve všech doposud známých SPIO kontrastních látkách (viz výše) či patentech zaměřujících se na přípravu SPIO nanočástic hraje povrchová diamagnetická biokompatibilní vrstva, složená převážně vždy ze σ -konjugovaných řetězců, pasivní roli při magnetickém relaxačním efektu, neboť funguje pouze jako biokompatibilní slupka zabraňující agregaci (shlukování) částic Díky velké 45 šířce diamagnetické vrstvy (desítky nanometrů) dochází k výraznému omezení spin-spinové interakce mezi povrchem magnetického jádra a okolním prostředím obsahujícím molekuly vody, což má za následek zeslabení kontrastního účinku při zobrazení v MRI a tedy nižší hodnoty r₂ a r₂*.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je příprava nových SPIO nanočástic na bázi oxidu železa s aktivní povrchovou úpravou na bázi π-konjugovaných molekul umožňujících zvýšení MR kontrastního účinku aje jich použití jako kontrastních látek s vysokým negativním kontrastem (T₂) určených pro klinické zobrazování pomocí magnetické rezonance MRI.

Uvedeného cíle je dosaženo přípravou sloučeniny obsahující magnetické jádro typu SPIO, zejmé5 na pro využití v magnetické rezonanci (MRI) jako negativní kontrastní látky na bázi oxidu železa, jejíž podstata spočívá v tom, zeje složena z jádra oxidu železa tvořeného nestechiometrickým super paramagnetickým Fe₃O₄ a povrchové slupky tvořené kyselinou 2-amino-tereftalovou (ATA). .

Stejného výsledku je dosaženo přípravou sloučeniny s magnetickým jádrem typu SPIO, zejména pro využití v magnetické rezonanci (MRI), jako negativní kontrastní látky na bázi oxidu železa, jejíž podstata spočívá vtom, že je složena z jádra oxidu železa tvořeného nestechiometrickým super paramagnetickým Fe₃O₄ a povrchové slupky tvořené kyselinou tereftalovou (TA).

Uvedeného cíle je dosaženo způsobem přípravy super paramagnetických nanočástic oxidu železa (Fe₃O₄), (s průměrnou velikostí částic kolem 10 nm, dále nazývaných SPIO), které jsou povrchově upraveny v průběhu reakce růstu magnetických krystalů (nukleace) a to obalením kyselinou tereftalovou (dále nazývanou ΤΑ-SPIO) nebo kyselinou 2-amino-tereftalovou (dále nazývanou ATA-SPIO).

Právě povrchová funkcionalizace ve formě TA a ATA poskytuje výhodné vlastnosti připravených nanosystémů jako jsou vysoká saturační magnetizace (~ 74 emu/g), vysoká stabilita ve vodném prostředí (min. čtyři týdny ve formě koloidní suspenze, při pH = 7), vysoká biokompatibilita ' - nízká cytotoxicita (hodnota IC50 (polovina maximální inhibiční koncentrace) odpovídá ¹ 25 3 78,3 pg/ml pro ATA-SPIO a 333,6 pg/ml pro ΤΑ-SPIO) a extrémně vysoké T₂ relaxační indexy (vážený r₂* = 451 mM^s’¹ pro ATA-SPIO a 735 mMݹ pro ΤΑ-SPIO). Tyto fyzikálně'· -chemické vlastnosti předurčují ATA-SPIO a ΤΑ-SPIO nanočástice pro využití jako účinné negaíii ť tivní kontrastní látky při diagnostice za použití magnetické rezonance MRI.

á Předložený vynález přesahuje znalosti řešené problematiky ve smyslu nového přístupu při navr2 hování aktivních povrchových látek SPIO nanočástic na bázi malých π-konjugovaných organic* - kých molekul a to kyseliny tereftalové (dále jako TA) a kyseliny 2amino-tereftalové (dále jako •i ATA). Díky TA a ATA molekulám na povrchu superparamagnetického jádra dochází k účinné spin-spinové interakci mezi povrchem nanočástic a okolními molekulami vody, čímž se dosáhne 35 velmi rychlých relaxačních časů na rozdíl od doposud používaných látek na bázi σ -konjugovaných řetězců majících při použití MRI jako diagnostického prostředku pouze pasivní roli (ochrana magnetických jader před agregací), [(a) A. K. Gupta, M. Gupta Biomaterials 2005, 26, 3995. (b) R. Banerjee, Y. Katsenovich, L. Lagos, M. Mclintosh, X. Zang, C. Z. Li Curr. Med. Chem. 2010,17,3120],

Syntetický postup, který je předmětem toho vynálezu zahrnuje jednokrokovou, rychlou a levnou přípravu dvou magnetických nanosystémů, ΤΑ-SPIO (magnetické jádro oxidu železa potažené kyselinou tereftalovou) a ATA-SPIO (magnetické jádro oxidu železa potažené kyselinou 2amino-tereftalovou). Níže uvedené fyzikálně-chemické vlastnosti připravených nanomateriálů 45 ΤΑ-SPIO a ATA-SPIO je činí jedinečnými pro snadnou přípravu a výhodné použití jako efektivní negativní kontrastní látky (a-f) při použití v zobrazování magnetickou rezonancí MRI:

(a) Superparamagnetické nanočástice oxidů železa ΤΑ-SPIO a ATA-SPIO byly připraveny jednokrokovou reakcí ve vodném prostředí za mírných reakčních podmínek (80 °C). Tato reak50 ce umožňuje připravit uniformní nanomateriály ΤΑ-SPIO a ATA-SPIO v gramových množstvích. Takto připravené nanočástice jsou hydrofilní a vykazují vlastnosti tzv. core-shell (jádro-slupka) struktury, schematicky znázorněné na obr. 1A. Monodisperzní magnetická jádra TA-SP1O a ATA-SPIO obsahují nestechiometrický oxid železnato-železitý (Fe₃O₄), známý pod mineralogickým názvem magnetit (b) Syntéza umožňuje přímou povrchovou funkcionalizaci vznikajících superparamagnetických jader přidáním TA a ATA během reakce, čímž vznikají hybridní systémy (struktura jádroslupka) o definované velikosti (průměrná velikost 10 nm).

(c) Výše zmíněná syntéza vede k přípravě superparamagnetických nanokrystalických částic vykazujících vysokou hodnotu saturační magnetizace (M_s ~ 74 emu/g) (d) Výše zmíněná syntéza vede k přípravě TA-SPIO a ATA-SPIO nanočástic majících kladný náboj. Připravené kladně nabité nanosystémy tvoří koloidní suspenze (ve vodě, pH = 7), kteio ré jsou stabilní po dobu několika týdnů při laboratorní teplotě, jen s malým náznakem k ag- regaci, ve srovnání s holými (bez TA nebo ATA povrchové úpravy) SPIO syntetizovanými stejným způsobem, dle bodu (a).

(e) Připravené TA-SPIO a ATA-SPIO magnetické nanocástice vykazují velmi nízkou in vitro 15 cytotoxicitu vůči buňkám myších fibroblastů.

(f) Oproti komerčním SPIO kontrastním látkám bylo dalším cílem předloženého vynálezu redukovat šířku diamagnetické vrstvy, která v případě ATA-SPIO a TA-SPIO navíc poskytuje π-konjugované vazby zvyšující účinek spinového transferu z kovového jádra k povrchu na20 nočástic, kde dochází ke kontaktu s okolním prostředím (voda). Tyto organické látky (ATA a TA) zvyšují magnetické interakce mezi připravenými magnetickými nanosystémy a okolními molekulami vody, dochází tak ke zkrácení spin-spinové relaxace (T2, kde r₂* je 450,8 pro ATA a 735,3 pro TA_SPIO), čímž se výrazně zvyšuje jejich účinek v MRI kontrastu (např. v porovnání s běžně dostupným Lumirem®/Gastromark®, r₂ = 3,8 mm¹ sec'¹, při 25 1.0 T). .Díky malým π-konjugovaným molekulám na povrchu SPIO jader tak lze dosáhnout

.. . . - .nepoměrně vyšších hodnot r₂* v.porovnání s komerčními či v literatuře zmiňovanými SPIO ^/.A^^systémyv které obsahují jádro se srovnatelnou saturační magnetizací, ovšem jsou obaleny pa~ u í.n-Tií-./caisivj^ řetězce.

Objasnění výkresů

Vynález bude blíže vysvětlen pomocí výkresů, kde obr. 1 znázorňuje různé typy morfologií syntetických magnetických nanočástic (NPs) pro MRI aplikaci (A) struktura jádro-slupká, (B) multi35 jaderné enkapsulované nanočástice (C). částice imobilizované na povrchu a (D) částice obsahující na povrchu dlouhé větvené polymery, obr. 2a chemické reaktanty a reakční schéma vedoucí k přípravě SPIO nanočástic obalených ATA a TA povrchovými látkami, obr. 2b Mossbauerovská spektra vzorku ATA-SPIO, měřená při (A) T = 300 a (B) T = 150 K, detail v obrázcích zobrazuje distribuci hyperjemného magnetického pole při T = 300 K, obr.2c Mossbauerovská spektra TA40 SPIO vzorku měřeného u (A) T = 300 a (B) T = 150 K; detail znázorňuje distribuci hyperjemného magnetického pole při T = 300 K, obr.2d znázorňuje chemickou strukturu kyseliny terefialové (TA) tvořící povrchovou vrstvu a obr.2e chemickou strukturu kyseliny 2-amino-tereftalové (ATA) jako povrchového materiálu, obr. 3 znázorňuje termogravimetrické (TGA) analýzy ATASPIO a TA-SPIO, obr. 4 znázorňuje snímky z transmisního elektronového mikroskopu (TEM) 45 TA-SPIO a ATA-SPIO nanočástic (snímky vlevo, velikost měřítka 100 nm), zvětšené části vybraných nanočástic (pravé snímky) poukazující na sférické tvary nanočástic a amorfní organický obal o velmi malé šířce (cca 1 nm) obklopující jádra oxidů železa, obr. 5 znázorňuje hysterezní smyčku změřenou při pokojové teplotě (T = 300 K) (A) ATA-SPIO (velikost částic 10 ± 3 nm) a (B) TA-SPIO (velikost částic 10 ± 4 nm) nanosystémy; horní vložené detaily v obr. 5A 50 a v obr. 5B ukazují ZFC and FC magnetizační křivky měřené v magnetickém poli 1 kOe. Detail vložený vpravo dole v obr. 5A a v obr. 5B ukazuje hysterezní smyčku měřenou při T = 5 K. Inset vložený vlevo dole je zvětšená hysterezní smyčka při pokojové teplotě v nízkých vnějších magnetických polích (0.05 kOe). (C). XRD spektra ATA-SPIO (černá) a TA-SPIO (šedá) společně s jejich TEM SAED záznamy (horní snímky), obr. 6 znázorňuje na fotografiích (A) Suché ATA55 SPIO nanočástice (6.5 g) (B) Vodná suspenze ATA-SPIO nanočástic (ferofluid) po čtyřech týdCL 306167 B6 nech od vytvoření disperze ve vodném prostředí, a (C) stejná suspenze vystavená vnějšímu magnetu poukazující na ferofluidní charakter připravených nanočástic, obr. 7 znázorňuje TEM snímky holých SPIO nanočástic majících větší velikostní distribuci částic (15 ± 5 nm), obr. 8 znázorňuje snímky z optické mikroskopie nepokrytých (holých) SPIO (A), pokrytých TA-SPIO (B) a 5 ATA-SPIO částic (C) ukazující výrazně nižší tendenci k agregaci pokrytých částic, a obr. 9 znázorňuje (A) Profil cytotoxicity ATA-SPIO (tmavě šedé sloupce) a TA-SPIO (šedé sloupce) nanočástic. Sloupec označený C představuje kontrolní vzorky (bez přidaných ATA/TA-SPIO). (B) Příčné hodnoty relaxace (1/T₂*) vztažené k Fe koncentraci ATA-SPIO (černé kruhy) a TA-SPIO (šedé kruhy) nanočástic s odpovídajícím lineárním proložením. (C) Fantomové experimenty pro 10 TA-SPIO a ATA-SPIO nanočástice se stejnými koncentracemi Fe (mM) jako v (B).

Příklady uskutečnění vynálezu

Uvedené příklady znázorňují příkladné varianty nanomateriálů připravených způsobem podle tohoto vynálezu, které však nemají z hlediska rozsahu ochrany žádný omezující vliv.

Inovativní povaha připravených nanomateriálů, splňující cíl vynálezu, kterým je příprava nanočástic oxidu železa s výrazně vylepšenými T₂ relaxačními indexy, tudíž kontrastními vlastnostmi při použití MRI, a to pomocí použití malých π-konjugovaných organických molekul (ATA a TA) jako povrchových vrstev, společně s popisem výhod a tvrzeními uvedenými v podstatě vynálezu 20 (body a-f), je názorně demonstrována detailním popisem syntézy a fyzikálně-chemických vlastností TA-SPIO a ATA-SPIO nanočástic v následující části.

Na obr. 2a je znázorněna chemická cesta vedoucí k jednokrokové syntéze nanočástic typu ATA_ /«a* SPIO a TA-SPIO. Oba nanosystémy, obsahující nestechiometrický magnetit (složený z Fe₃O₄ s

232’2« přítomností Fe₂O₃) pokrytý mono-vrstvou kyseliny ATA nebo TA, tvoří tzv. core-shell částice míi (jádro-slupka). Uvedená syntéza umožňuje přípravu těchto látek ve velkém množství (desítky ž. gramů).

Přiklad 1

Syntéza ATA-SPIO nanočástic. Pro syntézu ATA-SPIO byly použity následující látky:

(A) 4,68 g FeCl₃.6H₂O (ACS činidlo, 97% čistota, MW = 270,30 g/mol, CAS: 10025-77-1) (B) 1,72 g FeCl₂.4H₂O (>99.0% čistota, MW = 198,81, CAS: 13478-10-9) (C) 3,30 g kyseliny 2-amino-tereftalové (analytické kvality, ATA, MW = 181,15 g/mol, CAS: 35 10312-55-7) (D) 90 ml deionizované (Dl) vody

Látky (A) až (D) se současně umístí do reakční nádoby, zahřejí na teplotu 80 °C a ponechají po dobu 60 min magneticky míchat (400 rpm) v proudu dusíku proudícím přímo do reakční nádoby. 40 Poté se do roztoku přidá 10 ml látky (E) NH4OH (29% ve vodě, 14,8 M, CAS: 1336-21-6), mající za následek nukleaci (tvorbu jader) SPIO částic. Následně se výsledná suspenze ponechá v reakční nádobě při teplotě 80 °C po dobu 60 min za stálého magnetického míchání (1000 rpm) a poté se ochladí na pokojovou teplotu, přičemž výsledné pH roztoku leží v intervalu 10.0 < pH < 11.0. Takto vytvořené černé magnetické nanočástice se magneticky stáhnou a nejméně čtyřikrát 45 promyjí ve směsi deionizované vody a etanolu (10 ml, objem 1:1), což má za důsledek izolaci 6,5 g obalených ATA-SPIO nanočástic. Použitím poloviny množství činidel (A) až (E) se připraví polovina množství (3,25 g) ATA-SPIO nanočástic.

Příklad 2

Syntéza TA-SPIO nanočástic. Pro syntézu TA-SPIO byly použity následující látky:

(A) 4,68 g FeCl₃.6H₂O (ACS činidlo, 97% čistota, MW = 270,30 g/mol, CAS: 10025-77-1)

ZDÁ 1 -70 „ ,1U η κηη Λ0Ζ A4\U=1OQS1 PAC· 17/178_1Ο_Ολ (C) 3,02 g kyseliny tereftalové (analytická čistota, TA, MW = 166,13 g/mol, CAS: 100-21-0) (D) 90 ml deionizované (Dl) vody (A) až (D) byly současné přidány do reakční nádoby, zahřátý na teplotu 80 °C po dobu 60 min za 5 magnetického míchání (400 rpm) v proudu dusíku proudícím přímo do reakční nádoby. Poté se do roztoku přidá 10 ml látky (E) NH4OH (29% ve vodě, 14,8 M, CAS: 1336-21-6) mající za následek nukleaci SPIO částic. Suspenze byla udržována při teplotě 80 °C po dobu 1 h (60 min) za stálého magnetického míchání (1000 rpm) a následně ochlazena na laboratorní teplotu. Přičemž výsledné pH roztoku leží v intervalu 10.0 < pH < 11.0. Takto vytvořené černé magnetické nano10 částice byly magneticky izolovány a nejméně čtyřikrát promyty ve směsi deionizované vody a etanolu (10 ml, objem 1:1), což umožnilo izolaci 6,3 g částic potahem TA-SPIO. Použitím poloviny množství činidel (A) to (E) se připraví polovina množství (3,15 g) TA-SPIO částic.

Příklad 3

Syntéza holých SPIO bez ATA, bez TA povrchové vrstvy. Pro syntézu holých SPIO byly použity následující látky:

(A) 2,34 g FeC13.6H₂O (ACS činidlo, 97% čistota, MW = 270,30 g/mol, CAS: 10025-77-1) (B) 0,86 g FeCI₂.4H₂O (>99.0% čistota, MW = 198,81, CAS: 13478-10-9) (C) 45 ml deionizované (Dl) vody (A) až (C) byly současné vloženy do reakční nádoby, zahřátý na teplotu 80 °C po dobu 1 h (60 min) za stálého magnetického míchání (400 rpm) s dusíkem proudícím přímo do reakční nádoby. Dále bylo do roztoku naráz přidáno 5 ml (D) NH₄OH (29% ve vodě, 14.8 M, CAS: 1336-21-6), 25 což mělo za následek nukleaci SPIO částic.. Tato suspenze byla dále udržována při teplotě 80 °C . , po.další hh (60 min) za stáléhamagnetického míchání (1000 rpm) a následně ochlazena na labo- urrato roztoku bylo 10.0 < pit 11 .0„.Takto vytvořené černé magnetické izolovány-a'několikrátýnejméněčtyřikrát) promyty ve směsi deioSPIO (bez ATA, 30 bez TA).

Mossbauerova spektroskopie v nulovém poli provedena jak při pokojové (T = 300 K) tak při nízké teplotě (T = 150 K) ukázala, že ATA-SP1O (viz obr. 2b.) a TA-SPIO (viz obr. 2c) jsou složeny z nestechiometrických jader magnetitu. Tabulka 1 ukazuje detailní hodnoty odvozených 35 Mossbauerových parameterů (δ je izomerický posun, AEq je kvadrupólové štěpení, B_hf je hyperjemné magnetické pole a RA je relativní plocha spektra).

Vzorek	T (K)	Složka	δ ±0.01 (mm/s)	AEq ± 0.01 (mm/s)	Bhf± 0.3 (T)	RA± 1 (%)	Uspořádání
ATA-SPIO	150	Sextet 1	0.38	0.00	48.9	57	Tetraedrické a oktaedrické Fe3+
		Sextet 2	0.57	0.00	44.5	43	Oktaedrické Fe2+- Fe3+
TA-SPIO	150	Sextet 1	0.39	0.00	48.4	58	Tetraedrické a oktaedrické Fe3+
		Sextet 2	0.55	0.00	43.8	42	Oktaedrické Fe2+- Fe3+

Tabulka 1. Hyperjemné parametry Móssbauerovy spektroskopie v nulovém poli pro ATA-SPIO a TA-SPIO, měřené při T = 150 K, kde δ je izomemí posun, AEq je kvadrupólové štěpení, B_hf je hyperjemné magnetické pole, a RA je relativní plocha jednotlivých složek spektra. * Protože sextet byl proložen pomocí distribuce hyperjemného pole, hodnota Bhf odpovídá nejvíce pravděpodobné hodnotě odvozené z daného profilu Bhr distribuce.

Množství povrchové vrstvy (organických látek, TA nebo ATA molekul), získané přímo z procesu 5 růstu nanokrystalů odpovídá (dle TGA analýzy), jak v případě TA-SPIO tak ATA-SPIO, pouze 2,5% celkové hmotnosti nanočástic (viz obr. 3). Výsledky demonstrují tvorbu tenké organické mono-vrstvy tvořené TA a ATA molekulami imobilizovanými na povrchu SPIO nanočástic. Další důkazy o tvorbě těchto tenkých organických vrstev byly získány z TEM snímků měřených < při vysokém rozlišení (viz obr. 4), které také poukazují na syntézu sférických částic o průměrné 10 velikosti 10 nm s ultratenkou slupkou na povrchu.

Magnetická měření vysušených ATA-SPIO a TA-SPIO částic získaná měřením magnetické odezvy závislé na poli a teplotě potvrdila velmi podobný magnetický charakter pro oba materiály (viz podrobnosti v Tabulce 2.) Při T = 300 K, magnetizační křivky nevykazují žádnou hysterezi 15 (Obr. 5, hlavní křivky) a zároveň velmi nízké hodnoty koercitivity a remanence. Výsledky demonstrují superparamagnetické chování ATA-SPIO a TA-SPIO při pokojové teplotě. Hodnoty nasycení magnetizace (Ms ~ 73,6 emu/g and Ms ~ 74,3 emu/g pro ATA-SPIO a TA-SPIO nanosystémy) jsou mírně sníženy oproti objemovým protějškům Fe₃O₄ (~ 95 emu/g) a Y-Fe₂O₃ (~ 87 emu/g), a to díky nanočásticovému charakteru a jevům spojeným s konečnou velikostí čás20 tie. Nicméně hodnoty M_s při malých vnějších magnetických polích jsou velmi vysoké (~ 10 kOe) díky vynikajícím krystalickým vlastnostem magnetických jader, což je zásadní předpoklad pro aplikaci ATA/TA-SPIO v klinické MRI praxi. Izotermické magnetizační křivky zaznamenané při T = 5 K, vykazují hysterezi (viz detaily v obr. 5, Panel A a B). Při ochlazení vzorků, byl jasně patrný přechod z režimu SPM (superparamagnetismu) do magneticky zablokované23»®“ ho stavu při maximu T ~ 55 K (průměrná blokovací teplota, Tb,_sv) v nulovém poli ochlazených » --^*^(ZFC) magnetizačních křivek, změřených v magnetickém poli 1 kOe (viz detaily v obr. 5_; Panel

A a B). Krystalická povaha takto vytvořených látek ATA-SPIO a TA-SPIO je dále demonstrována dobře definovanými snímky z elektronové difrakce (SAED - Selected Area Electron Difíractir WJ^on), vykazujícími jasné difrakční kroužky krystalových rovin magnetitu (220), (311), (400), (422), (511) a (440), které jsou ve shodě s difrakčními píky zaznamenanými rentgenovou dif^ř rakční (XRD - X-ray diffraction) analýzou (Obr. 5_;Panel C).

VZOREK	T (K)	Mmax+(7T) ±0.01 (emu/g)	Mmax- (~ 7 T) ±0.01 (emu/g)	Hc+ ±5 (Oe)	Hc±5 (Oe)	mr+ ±0.01 (emu/g)	mr. ±0.01 (emu/g)
ATA-	5	83.99	- 83.99	189	-197	19.90	-19.79
SPIO	300	73.60	-73.60	18	-18	2.18	-2.25
TA-SPIO	5	83.27	- 83.27	268	-278	23.19	-22.38
	300	74.32	-74.32	14	- 14	1.62	-1.62

Tabulka 2. Parametry M-H křivek měřených při T = 5 K a T = 300 K, kde M_max+ (7 T) a M_max_ (- 7 T) jsou maximální magnetizace při 7 T and - 7 T, Hc+ and Hc- jsou pozitivní a negativní koercitivity a M_R+ a M_R_jsou pozitivní a negativní zbytkové remanentní magnetizace.

Takto připravené ATA-SPIO a TA-SPIO látky získané v množstvích jednotek gramů (viz Obr. 6A) tvoří stabilní vodné suspenze (viz obr. 6B) ferofluidní povahy (Obr. 6C), které při pokojové teplotě zůstávají nezměněny po dobu čtyř týdnů. Z analýzy optické mikroskopie je patrné (viz obr. 8), že ATA-SPIO a TA-SPIO jeví velmi malý sklon k agregaci v roztocích v porovnání se 45 SPIO nanočásticemi bez povrchové vrstvy (viz také obr. 7), které byly připraveny stejným způsobem, jak je popsáno. Z výsledků zeta-potenciálu pro ATA-SPIO a TA-SPIO získané z dynanimbAhn rn^nťvln cvÁtk ÍDI K) wnlvvá klndnv nahni na novrchu částic vzhledem k vodnému prostředí (17,5 mV pro TA-SPIO a 8,39 mV pro ATA-SPIO). Holé SPIO mají větší kladný náboj (32,0 mV).

Biologický vliv ATA-SPIO a TA-SPIO magnetických nanočástic na změny buněčného metabo5 lismu, od zdravých buněk po apoptotické a/nebo nekrotické, byl zjištěn pomocí MTT testu (MTT, 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid). In vitro stanovení biokompatibilty připravených částic bylo stanoveno na NIH3T3 buňkách (buňky myších fibroblastů). Byly použity různé koncentrace nanočástic, a to 500, 250, 125, 60, 30, 15, 7 a 0 (kontrolní) pg/ml. Buňky byly inkubovány za přítomnosti nanočástic v 96jamkových plastových destičkách (P-Lab, ίο Česká republika) při teplotě 37 °C, v 5 % CO₂ po dobu 24 h. Před začátkem MTT experimentů bylo DMEM médium (Dulbecco's Modified Eagle Medium s 10% Fetálním Bovinním Sérem) nahrazeno PBS (fosfátový pufr, pH = 7.4) obsahujícím 5 mM glukózy, bylo přidáno 10 μ! 20 mM MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) rozpuštěného v PBS a buňky byly inkubovány po dobu 3 h při teplotě 37 °C a 5 % CO₂. Roztoky MTT byly opatrně 15 odstraněny a bylo přidáno 100 μΐ DMSO na rozpuštění fialových krystalů formazanu. Absorbance výsledných roztoků byly měřeny v 96jamkovém plastovém readeru Synergy HT (BioTek, USA) při 570 nm. Životaschopnost buněk byla určena jako procentní poměr vzhledem ke kontrolním buňkám (100 χ průměr testované skupiny/průměr kontrolní skupiny). Hodnoty IC50 (polovina maximální inhibiční koncentrace) byly statisticky určeny pomocí 3T3NRU Phototox soft20 waru (COLIPA, Německo). Do koncentrace 125 μg Fe/ml byly ATA-SPIO a TA-SPIO nanočástice velmi dobře snášeny bez jakýchkoliv známek snížené životaschopnosti buněk. Výsledky jsou znázorněny na obr. 9, Panel A. Výraznější známka cytotoxicity se vyskytla u koncentrací nad 250 pgFe/ml. Hodnoty IC50 byly stanoveny pro ATA-SPIO 378,3 pg/m, a pro TA-SPIO 333,6 pg/ml. Tyto hodnoty cytotoxicity jsou totožné s hodnotami popsanými v literatuře pro stej25 né buňky v interakci s jinými SPIO nanočásticemi (nanočástice magnetitu potažené poly-vinylalkoholem) [Mahmoudi, M.; Simchi, A.; Imani, M. J. Phys. Chem. C 2009, 113,9573].

ATA-SPIO a TA-SPIO nanočástice připravené výše uvedeným způsobem se ukázaly být velice s účinnými v MRI zobrazení. Relaxační časy byly měřeny pomocí klinického 3T MR celotělového jo skeneru (Siemens Skyra, Erlangen, Německo). Pro všechna měření byla použita 8kanálová víceúčelová cívka (Noras 8Ch CPC, Hochberg, Německo) za účelem získání vysokého poměru signál-šum. Vodné ferofluidní suspenze ATA-SPIO a TA-SPIO byly zředěny destilovanou H₂O a smíchány s 1% agarózovým gelem v objemovém poměru 1:1. Série vzorků obsahovala koncentrace od 0,5mM do 0,03ImM. Pro měření relaxivit R₂ byly použity 2D Carr-Purcell-Meiboom35 Gill (CPMG) sekvence s echo-časem 11,1 ms a 24 ozvěnami, TR = 5000 ms, FOV = 90 χ 73mm, fáze- (OS) = 50%, matrice =192 x 156 a 5 mm řádkování. R₂* bylo stanoveno pomocí 2D MultiEcho-Gradient-Echo (GRE) pro krátké TR časy od 2,69 ms do 22,82 ms, TR = 500 ms, alpha = 25°, NEX = 4, FOV =90 x 70 mm, fáze-OS = 60%, matrice = 100 x 128 a řádkování 5 mm. Kromě toho byly také pořízeny T₂* vážené snímky při TE = 19 ms. R| bylo měřeno pomocí Inversi40 on-Recovery-Fast-Spin-Echo (IR-FSE) při 6 různých inverzních časech (50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 ms), při teplotě 23,2 °C, s turbo faktorem 3, TR = 5000 ms, FOV = 90 x73mm, fázeOS = 50%, matrice = 192 x 156 a Imm řádkování. T₂ vážený snímek byl pořízen při TE = 99 ms. Příčné a podélné (TQ relaxační časy byly vypočítány pomocí laboratorního programu (IDL, Exelis lne., CO, USA). Časy T₂ a T₂* byly určeny lineárním proložením logaritmické intenzity signá45 lu v průběhu echo času (pro všechny použité TE časy bylo SNR > 5) zatímco pro CPMG sekvence bylo první echo ignorováno. Čas T| byl vypočítán použitími 3-parametrového proložení IRFSE datasetu podle signálu Rovnicel (Rovnicel = S_IR = A χ [1-B exp (-Ti/T_L)]). η, r₂ and r₂* byly vypočítány ze sklonu lineární regrese mezi R_b R₂ a R₂* a Fe koncentrací v mM.

Obr. 9b ukazuje získané hodnoty relaxačních časů vztažené ke koncentraci Fe ATA-SPIO a TASPIO nanočástic. Výsledky potvrdily výrazné spin-spinové relaxace molekul vody v blízkosti SPIO nanočástic Hodnoty η a r₂ jsou uvedeny v Tabulce 3. Index relaxivity r₂* dosáhl unikátních hodnot a to 450.8 mM 's ¹ proATA-SPIO a 735.3 mM^s ¹ pro TA-SPIO nanočástice. Hodnoty relaxivit jsou výrazně vyšší, než hodnoty zaznamenané pro komerčně dostupný Resovist® (r₂* ~

300 mMV, klinické T₂ činidlo), stejně jako pro Lumirem®/Gastromark®, jehož r₂ =3.8 mM'¹ sec'¹, při 1.0 T. Negativní kontrast ATA-SPIO a TA-SPIO částic byl také zaznamenán na fantomech s agarózou (Obr. 9c), měřený v T₂*-vážených obrazech. Z obrázku je patrný výrazný pokles intenzity signálu se zvyšujícími se koncentracemi nanočástic v agarových fantomech, což odráží vysokou účinnost těchto SPIO částic jako MRIT₂ kontrastních látek.

Magnetická nanočástice	Relaxivita (mM^s’1)
n	Γ2	r2*
ATA-SPIO	0.635	37.8	450.8
TA-SPIO	0.962	56.7	735.3

Tabulka 3. Hodnoty relaxivity η, r₂ a r₂* ATA-SPIO a TA-SPIO nanočástic.

Průmyslová využitelnost

Z výše popsaných fyzikálně-chemických vlastností ATA-SPIO a TA-SPIO nanočástic je zřejmé, 15 že bylo dosaženo cíle vynálezu, kterým je příprava vysoce účinných SPIO negativních kontrastních látek pro MRI zobrazování, a to především díky inovativnímu přístupu povrchové úpravy SPIO nanočástic, na bázi malých π-konjugováných molekul, která vůbec poprvé hraje v efektu kontrastního účinku aktivní roli. Na rozdíl od běžných SPIO kontrastních látek, obsahujících převážně velké σ-molekuly, tak vykazují ATA-SPIO a TA-SPIO nanočástice výrazně vyšších 20 hodnot relaxivit v T2-vážených obrazech a jsou tak předurčeny k využití v klinické MRI praxi _; jako negativní kontrastní látky pro široké spektrum intravenózních aplikací.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Superparamagnetické nanočástice oxidu železa, vyznačující se tím, že jsou slo30 ženy z jádra tvořeného oxidem železa obsahující ionty Fe³⁺, Fe²⁺ nebo jejich kombinace a povrchové vrstvy, tvořené látkou složenou z malých π-konjugováných molekul vybrané ze skupiny 2amino-tereftalové kyseliny a/nebo tereftalové kyseliny.
2. 2. Superparamagnetické nanočástice oxidu železa podle nároku 1, vyznačující se 35 tím, že jejich jádro je tvořeno nestechiometrickým super paramagnetickým Fe₃O₄.
3. 3. Superparamagnetické nanočástice oxidu železa podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že povrchové vrstvy jsou tvořené kyselinou 2-amino-tereftalovou.

   40
4. 4. Superparamagnetické nanočástice oxidu železa podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že povrchové vrstvy jsou tvořené kyselinou tereftalovou.
5. 5. Použití superparamagnetických nanočástic oxidu železa podle nároků 1 až 4 v magnetické rezonanci MRI jako negativní kontrastní látky.
6. 6. Způsob přípravy superparamagnetických nanočástic oxidu železa, podle nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že syntéza superparamagnetických nanočástic oxidu železa s povrchovou vrstvou tvořenou 2-amino-tereftalovou kyselinou se provede v jednom kroku a pro syntézu se použijí látka (A) 4,68 g FeCl₃.6H₂O, látka (B) 1,72 g FeCl₂.4H₂O, látka (C) 3,30 g kyseliny 50 2-amino-tereftalové a látka (D) 90 ml deionizované (Dl) vody, látky (A) až (D) se společně umis ti do reakční nádoby, zahřejí na teplotu 80 °C a ponechají po dobu 60 min magneticky míchat (400 rpm) v proudu dusíku proudícím přímo do reakční nádoby, poté se do roztoku naráz přidá 10 ml látky (E) NH₄OH, načež se výsledná suspenze ponechá v reakční nádobě při teplotě 80 °C po dobu 60 min za stálého magnetického míchání (1000 rpm) a poté se ochladí na pokojovou teplotu, přičemž výsledné pH roztoku leží v intervalu 10.0 < pH < 11.0 a takto vytvořené černé magnetické nanočástice se magneticky stáhnou a nejméně čtyřikrát promyjí ve směsi deionizované vody a etanolu (10 ml, objem 1:1).
7. 7. Způsob přípravy superparamagnetických nanočástic oxidu železa, podle nároku 1 až 5,0, vyznačující se t í m, že syntéza superparamagnetických nanočástic oxidu železa s povrchovou vrstvou tvořenou tereftalovou kyselinou se provede v jednom kroku a pro syntézu se použijí látka (A) 4,68 g FeCh.ófyO, látka (B) 1,72 g FeCl₂.4H₂O, látka (C) 3,02 g kyseliny tereftalové a látka (D) 90 ml deionizované (Dl) vody, látky (A) až (D) se společně umístí do reakční nádoby, zahřejí na teplotu 80 °C a ponechají po dobu 60 min magneticky míchat (400 rpm) v proudu dusíku proudícím přímo do reakční nádoby, poté se do roztoku naráz přidá 10 ml látky (E) NH4OH, načež se výsledná suspenze ponechá v reakční nádobě při teplotě 80 °C po dobu 60 min za stálého magnetického míchání (1000 rpm) a poté se ochladí na pokojovou teplotu, přičemž výsledné pH roztoku leží v intervalu 10.0 < pH < 11.0 a takto vytvořené Černé magnetické nanočástice se magneticky stáhnou a nejméně čtyřikrát promyjí ve směsi deionizované vody a etanolu (10 ml, objem 1:1).