CN104069516B - 一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法和用途，该超顺磁性纳米颗粒由位于核心的四氧化三铁粒子及包覆在其表面的两性离子聚电解质高分子组成，所述两性离子聚电解质高分子与所述氧化铁颗粒表面结合位点的密度高于2个位点/平方纳米。通过两性离子聚电解质高分子的高密度修饰，使超顺磁性纳米颗粒在抗蛋白吸附能力上表现优越，大幅度延长了超顺磁性纳米颗粒在生理环境中的稳定存在的时间，进而延长了该材料在体内循环的时间。本发明解决了现有商品化造影剂抗蛋白吸附效果差，体内循环时间短的问题，可被开发用于核磁共振成像的造影剂。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和生物医学工程技术领域，尤其涉及一种超顺磁性纳米颗粒。
背景技术
磁共振成像(MRI)是利用生物体内不同组织的氢质子表现出不同的核磁共振信号这一特性，利用计算机处理信号并重建图像的一种技术。当正常组织与病变组织的磁共振信号差异不明显时，会造成MRI诊断困难，这时就需要引入磁共振成像造影剂，提高组织对比度。磁共振造影剂可以有效的缩短组织氢质子的横向弛豫时间(T2增强)或纵向弛豫时间(T1增强)，增强图像对比度。通常用纵向弛豫率r1和横向弛豫率r2来表示对比增强的效率。造影剂又可分为正性造影剂(T1造影剂，图像变亮)和负性造影剂(T2造影剂，图像变暗)。
MRI造影剂主要有顺磁性造影剂和超顺磁性造影剂两大类。目前常用的顺磁性造影剂是钆离子的配合物，如二乙二胺醋酸钆(Gd-DTPA)。但这种造影剂静脉注射后会迅速进入细胞间隙，导致成像时间缩短，为保持足够的对比度，需注射较大剂量。另外，由于顺磁性造影剂只适用于增强组织的T1信号，因而用途较为有限。超顺磁性造影剂主要由四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒构成，不仅可以用于T1信号成像，也可以用于T2信号成像，比顺磁性造影剂具有更强的磁共振增强效果。
作为超顺磁性MRI造影剂的Fe3O4纳米颗粒，其在血液中的分散稳定及循环时间与纳米颗粒的表面结构和性质有关。为了延长纳米颗粒的循环时间，对颗粒表面进行修饰，阻止蛋白吸附是常用的策略，目前通常的技术是采用多糖、聚乙二醇(PEG)和PEG衍生物等高分子来对Fe3O4纳米颗粒表面进行修饰，来延长纳米颗粒的循环时间。中国发明专利CN101474414B公开了一种葡聚糖包裹纳米粒子的制备和应用技术，但是由于葡聚糖的聚合物链上的功能基团是羟基，配位能力差，仅能对纳米颗粒实施物理的包裹作用，难以实现和纳米颗粒表面高密度的化学结合。中国发明专利CN102380109B公开了一种两亲性多糖包裹纳米粒子造影剂的方法，该方法依靠与葡聚糖链段连接的疏水链段对纳米颗粒进行包裹，只能适用于疏水性的纳米颗粒，限制了其应用。中国发明专利CN102218150B公开了一种乳糖化或PEG化葡聚糖修饰纳米Fe3O4造影剂的方法，由于PEG的配位能力差，需要进行羧基化处理，变成其衍生物后才能再包覆到Fe3O4纳米颗粒表面，使得制备过程复杂。目前的技术都不能对修饰的位点进行精确的控制，获得表面致密的结合，往往会造成Fe3O4纳米颗粒水力学尺寸增大或血液循环时间的缩短。因此，有必要发展新的技术解决Fe3O4纳米颗粒表面修饰的问题。
两性离子聚电解质高分子是近年发展起来的一种新型抗吸附材料，按照两性离子在聚合物链上的分布情况，又可以分为聚两性电解质型(polyampholyte)和甜菜碱型两性聚电解质(polybetaine)。Polyampholyte是指聚合物重复单元上带有一个正电荷或一个负电荷，正负电荷重复单元随机或有规分布在主链上。而Polybetaine是指聚合物重复单元上同时具有正电荷和负电荷，正电荷的总量和负电荷的总量总是相等的。美国华盛顿大学的江绍毅课题组报道了采用聚羧酸甜菜碱高分子(pCB)对人血清/血浆中蛋白的抗吸附性能，见参考文献(Langmuir2009,25(19),11911–11916.)，发现具有优异的抗蛋白吸附的性能，但是由于修饰的表面是平板固体表面，尚不能解决纳米颗粒的表面修饰问题。近来研究人员进一步发现，采用高分子修饰纳米颗粒时，高分子修饰的结合位点的密度对修饰的效果有重要的影响，通常结合位点的密度越高，稳定分散及抗蛋白吸附的效果越好，但是由于技术的限制目前很难得到纳米颗粒表面高分子的结合位点高于0.4个位点的修饰，见参考文献(Biomaterials2006,27(6),847–855.)，因而寻找新的表面修饰结构和表面修饰方法，具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种超顺磁性纳米颗粒及其制备方法与应用，能对Fe3O4纳米颗粒表面修饰的位点进行精确的控制，获得表面致密的结合，制备所得的两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒水力学尺寸一致性好、稳定分散性和抗蛋白吸附的效果优越，作为造影剂使用能延长成像时间，具有良好的成像效果。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种超顺磁性纳米颗粒，包括位于核心的氧化铁纳米颗粒和修饰在氧化铁纳米颗粒表面的两性离子聚电解质高分子，所述两性离子聚电解质高分子与所述氧化铁颗粒表面结合位点的密度高于2个位点/平方纳米。
进一步地，其中所述的两性离子聚电解质高分子含有正电荷和负电荷，正电荷基团为叔氨基或季氨基中的任一种，负电荷基团为羧基或磷酸基中的任一种。
进一步地，其中所述两性离子聚电解质高分子的数均分子量为1000-10000之间；
进一步地，其中所述的超顺磁性纳米颗粒的粒径为1-80纳米。
本发明还提供了一种超顺磁性纳米颗粒的制备方法，是通过以下技术方案实现的：将铁盐中的铁离子在多元醇溶剂中和两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团结合，以氢氧化钠为沉淀剂还原沉淀与所述两性离子聚电解质高分子结合的所述铁离子，得到表面结合位点密度高于2个位点/平方纳米的两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
进一步地，包括如下步骤：
将铁盐和两性离子聚电解质高分子溶解于多元醇中，所述铁盐中所含的铁离子与两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团摩尔比为1:1.5-1:3.0之间，充分混合使铁离子和两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团结合，得到溶液a；
将氢氧化钠溶解于多元醇中得到溶液b；
将所述溶液a加热到180-250℃，回流，得到溶液c；
将所述溶液b加入到所述溶液c之中，继续加热到180-250℃，回流，得到溶液d；
将所述溶液d冷却到室温后，加入乙酸乙酯絮凝沉淀，然后加入无水乙醇分离沉淀物，得到两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
进一步地，其中所述的两性离子聚电解质高分子包括pPCMA(聚甲基乙撑碳酸酯马来酸酐)或pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)中的任一种；
进一步地，其中所述的铁盐为无水氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种。
进一步地，其中所述的多元醇为沸点高于180℃。
进一步地，其中所述的多元醇为乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇或四甘醇中的任一种。
本发明还另外提供了一种超顺磁性纳米颗粒的制备方法，是通过如下技术方案实现的：将来自铁盐中的铁离子在多元醇溶剂中和负电性聚电解质高分子中的负电荷基团结合，以氢氧化钠为沉淀剂还原沉淀与所述负电性聚电解质高分子结合的所述铁离子，再用正电性基团部分替代负电性聚电解质高分子中负电荷基团，得到表面结合位点密度高于2个位点/平方纳米的两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
进一步地，包括如下步骤：
将铁盐和负电性聚电解质溶解于多元醇中，所述铁盐中所含的铁离子与所述负电性聚电解质中的羧基基团摩尔比为1:2.0-1:4.0之间，充分混合使铁离子和PAA中的羧基基团结合，得到溶液a；
将氢氧化钠溶解于多元醇中得到溶液b；
将所述溶液a加热到180-250℃，回流，得到溶液c；
将所述溶液b加入到所述溶液c之中，继续加热到180-250℃，回流，得到溶液d；
将所述溶液d冷却到室温后，加入乙酸乙酯絮凝沉淀，然后加入无水乙醇分离沉淀物，然后将所述沉淀物分散到去离子水中，得到溶液e；
将所述溶液e中加入EDC、NHS和DEAPA反应3-5小时，超滤，得到两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
进一步地，其中所述负电性聚电解质为PAA。
进一步地，其中所述的铁盐为无水氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种。
进一步地，其中所述的多元醇为沸点高于180℃。
进一步地，其中所述的多元醇为乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇或四甘醇中的任一种。
本发明还提供了一种超顺磁性磁共振造影剂，其中所述造影剂包含所述两性离子聚电解质修饰的超顺磁性纳米颗粒。
本发明还提供了一种制备造影剂的方法，其中所述制备方法包括如下步骤：将所述两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒分散于水溶液中形成稳定的分散体系，得到两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性磁共振造影剂，分散体系的浓度为0.05-2mol铁/升，优选0.1-0.5mol铁/升。
本发明有效克服了已有的超顺磁造影剂的缺陷，提供了一种表面具有两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，表面结合位点的密度大于2个位点/平方纳米，这种两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒在抗蛋白吸附能力上表现优越，大幅度延长了超顺磁性纳米颗粒在生理环境中的稳定存在的时间，进而延长了该材料在体内循环的时间，从而在造影剂的应用方面有更广的用途。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一种超顺磁性纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片；
图2是图1对应的粒径分布图；
图3是图1所示的超顺磁性纳米颗粒的热重分析曲线图；
图4是图1所示的超顺磁性纳米颗粒的电导滴定曲线；
图5是两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒的弛豫率测试曲线；
图6是两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒的磁共振成像图；
图7是本发明的一种超顺磁性纳米颗粒的磁共振血管成像信号图。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
合成步骤
首先，称取数均分子量为8000的pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)(50％)16.950g于烧杯中，再称量360.0ml DEG于烧杯中，搅拌、超声使二者溶解；快速称量无水FeCl33.900g，通过加热、超声、搅拌使其溶解在DEG和PAA中，充分混合使铁离子预先和pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)中的负电荷基团结合，得到A液；
其次，用量筒量取DEG80.0m1，再用精密天平称量6.000gNaOH，通过超声、加热、搅拌使其溶解在DEG中，配成B液，B液放入72℃烘箱中恒温；
最后，A液装于1L的三口烧瓶中油浴加热到180℃恒温5min，然后快速加入热的B液，反应瞬间进行，混合液瞬间变黑，温度有所下降，后加热升温到180℃，恒温10min。之后进行冷却，得到纳米Fe3O4胶体，倒入存储瓶中留待处理，整个加热过程、反应过程和冷却过程中采用机械搅拌，搅拌速度维持在300士20rpm。
样品处理
首先将要处理的样品平均分装在几个聚丙烯(PP)材质的离心杯中，倒入相同体积的无水乙醇，超声5min，溶解样品中的DEG、PAA等杂质。随后倒入与样品体积相同的乙酸乙酯沉淀颗粒，超声分散5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。其次倒去上层清液，将颗粒均匀分散在2倍初始样品体积的无水乙醇中，超声5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。如此反复进行3次，完成对Fe3O4纳米颗粒的清洗。最后将样品分散在超纯水中，采用旋蒸(0.1MPa真空度、50℃、适宜的转速)将样品中的无水乙醇和乙酸乙酯去除，样品浓缩至400m1左右，得到两性离子聚电解质pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
上述实施例的操作步骤中，也可采用数均分子量为1000-10000之间的任一pCBMA；可用硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种替代FeCl3；可用乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、三甘醇或四甘醇中的任一种替代将DEG(二甘醇)；其他条件保持不变，同样可以制备出两性离子聚电解质pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)修饰的两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
实施例2
合成步骤
首先，称取数均分子量为8000的pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)(50％)16.950g于烧杯中，再称量360.0ml DEG于烧杯中，搅拌、超声使二者溶解；快速称量无水FeCl33.900g，通过加热、超声、搅拌使其溶解在DEG和PAA中，充分混合使铁离子预先和pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)中的负电荷基团结合，得到A液；
其次，用量筒量取DEG80.0m1，再用精密天平称量6.000gNaOH，通过超声、加热、搅拌使其溶解在DEG中，配成B液，B液放入72℃烘箱中恒温；
最后，A液装于1L的三口烧瓶中油浴加热到250℃恒温5min，然后快速加入热的B液，反应瞬间进行，混合液瞬间变黑，温度有所下降，后加热升温到250℃，恒温10min。之后进行冷却，得到纳米Fe3O4胶体，倒入存储瓶中留待处理，整个加热过程、反应过程和冷却过程中采用机械搅拌，搅拌速度维持在300士20rpm。
样品处理
首先将要处理的样品平均分装在几个聚丙烯(PP)材质的离心杯中，倒入相同体积的无水乙醇，超声5min，溶解样品中的DEG、PAA等杂质。随后倒入与样品体积相同的乙酸乙酯沉淀颗粒，超声分散5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。其次倒去上层清液，将颗粒均匀分散在2倍初始样品体积的无水乙醇中，超声5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。如此反复进行3次，完成对Fe3O4纳米颗粒的清洗。最后将样品分散在超纯水中，采用旋蒸(0.1MPa真空度、50℃、适宜的转速)将样品中的无水乙醇和乙酸乙酯去除，样品浓缩至400m1左右，得到两性离子聚电解质pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
上述实施例的操作步骤中，可用硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种替代FeCl3；可用乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、三甘醇或四甘醇中的任一种替代将DEG(二甘醇)；其他条件保持不变，同样可以制备出两性离子聚电解质pCBMA(聚羧基甜菜碱丙烯酸甲酯)修饰的两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
实施例3
合成步骤
首先，称取数均分子量为9000的pPCMA(聚甲基乙撑碳酸酯马来酸酐)(50％)12.700g于烧杯中，再称量360.0ml DEG于烧杯中，搅拌、超声使二者溶解；快速称量无水FeCl34.200g，通过加热、超声、搅拌使其溶解在DEG和PAA中，充分混合使铁离子预先和pPCMA(聚甲基乙撑碳酸酯马来酸酐)中的负电荷基团结合，得到A液；
其次，用量筒量取DEG80.0m1，再用精密天平称量6.000gNaOH，通过超声、加热、搅拌使其溶解在DEG中，配成B液，B液放入72℃烘箱中恒温(样品溶解过程中，溶液由无色变为黄色最终变为橙红色，且样品的粘稠度显著增大)；
最后，A液装于1L的三口烧瓶中油浴加热到220℃恒温5min，然后快速加入热的B液，反应瞬间进行，混合液瞬间变黑，温度有所下降，后加热升温到220℃，恒温10min。之后进行冷却，得到纳米Fe3O4胶体，倒入存储瓶中留待处理，整个加热过程、反应过程和冷却过程中采用机械搅拌，搅拌速度维持在300士20rpm。
样品处理
首先将要处理的样品平均分装在几个聚丙烯(PP)材质的离心杯中，倒入相同体积的无水乙醇，超声5min，溶解样品中的DEG、PAA等杂质。随后倒入与样品体积相同的乙酸乙酯沉淀颗粒，超声分散5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。其次倒去上层清液，将颗粒均匀分散在2倍初始样品体积的无水乙醇中，超声5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。如此反复进行3次，完成对Fe3O4纳米颗粒的清洗。最后将样品分散在超纯水中，采用旋蒸(0.1MPa真空度、50℃、适宜的转速)将样品中的无水乙醇和乙酸乙酯去除，样品浓缩至400m1左右，得到两性离子聚电解质pPCMA(聚甲基乙撑碳酸酯马来酸酐)修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
上述实施例的操作步骤中，可用硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种替代FeCl3；可用乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、三甘醇或四甘醇中的任一种替代将DEG(二甘醇)；其他条件保持不变，同样可以制备出两性离子聚电解质pPCMA(聚甲基乙撑碳酸酯马来酸酐)修饰的两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。。
实施例4
合成步骤
首先，称取数均分子量为5000的PAA(50％)13.840g于烧杯中，再称量360.0m1DEG于烧杯中(PAA在DEG中呈絮状)，搅拌、超声使二者溶解；快速称量无水FeCl37.800g，通过加热、超声、搅拌使其溶解在DEG和PAA中，充分混合使铁离子预先和PAA中的负电荷基团结合，得到A液；
其次，用量筒量取DEG80.0m1，再用精密天平称量8.000gNaOH，通过超声、加热、搅拌使其溶解在DEG中，配成B液，B液放入72℃烘箱中恒温(样品溶解过程中，溶液由无色变为黄色最终变为橙红色，且样品的粘稠度显著增大)；
最后，A液装于1L的三口烧瓶中油浴加热到180℃恒温5min，然后快速加入热的B液，反应瞬间进行(混合液瞬间变黑，温度有所下降，后加热升温到180℃，恒温10min。之后进行冷却，得到纳米Fe3O4胶体，倒入存储瓶中留待处理，整个加热过程、反应过程和冷却过程中采用机械搅拌，搅拌速度维持在300士20rpm。
样品处理
首先将要处理的样品平均分装在几个聚丙烯(PP)材质的离心杯中，倒入相同体积的无水乙醇，超声5min，溶解样品中的DEG、PAA等杂质。随后倒入与样品体积相同的乙酸乙酯沉淀颗粒，超声分散5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。其次倒去上层清液，将颗粒均匀分散在2倍初始样品体积的无水乙醇中，超声5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。如此反复进行3次，完成对Fe3O4纳米颗粒的清洗。最后将样品分散在超纯水中，采用旋蒸(0.1MPa真空度、50℃、适宜的转速)将样品中的无水乙醇和乙酸乙酯去除，样品浓缩至400m1左右，得到PAA修饰的Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
后修饰步骤
(采用自动电位滴定仪滴定上述PAA修饰的Fe3O4纳米颗粒表面的羧基含量，按照磁颗粒羧基含量:EDC:NHS:DEAPA摩尔比为1:4:4:1计算出各组分的含量。)
首先称取EDC,NHS溶解在50mL超纯水中(先称EDC)。其次取50mL前述Fe3O4纳米颗粒的水分散液，倒入三口烧瓶中，开始机械搅拌，转速控制在250rpm左右。随后将EDC,NHS混合液倒入三口烧瓶中，200m1超纯水分两次洗加磁颗粒的量筒，200m1超纯水分两次洗加EDC,NHS的烧杯。最后用移液枪向三口烧瓶中加入DEAPA，除机械搅拌的口，另外两个口用塞子塞住。反应进行4h结束。
修饰后样品处理
将反应结束后的样品采用超滤处理，去除里面没有反应的EDC、NHS、DEAPA，即得到两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。制备所得的样品透射电镜(TEM)照片及其对应的粒径分布图见附图1和附图2，该样品的弛豫测试曲线见附图5，计算可得其R1为7.04(单位1/mM/s)，R2为34.71(单位1/mM/s)。
上述实施例的操作步骤中，可用硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种替代FeCl3；可用乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、三甘醇或四甘醇中的任一种替代将DEG(二甘醇)；其他条件保持不变，同样可以制备出两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
实施例5
合成步骤
首先，称取数均分子量为5000的PAA(50％)13.840g于烧杯中，再称量360.0m1DEG于烧杯中(PAA在DEG中呈絮状)，搅拌、超声使二者溶解；快速称量无水FeCl37.800g，通过加热、超声、搅拌使其溶解在DEG和PAA中，充分混合使铁离子预先和PAA中的负电荷基团结合，得到A液；
其次，用量筒量取DEG80.0m1，再用精密天平称量8.000gNaOH，通过超声、加热、搅拌使其溶解在DEG中，配成B液，B液放入72℃烘箱中恒温(样品溶解过程中，溶液由无色变为黄色最终变为橙红色，且样品的粘稠度显著增大)；
最后，A液装于1L的三口烧瓶中油浴加热到250℃恒温5min，然后快速加入热的B液，反应瞬间进行(混合液瞬间变黑，温度有所下降，后加热升温到250℃，恒温10min。之后进行冷却，得到纳米Fe3O4胶体，倒入存储瓶中留待处理，整个加热过程、反应过程和冷却过程中采用机械搅拌，搅拌速度维持在300士20rpm。
样品处理
首先将要处理的样品平均分装在几个聚丙烯(PP)材质的离心杯中，倒入相同体积的无水乙醇，超声5min，溶解样品中的DEG、PAA等杂质。随后倒入与样品体积相同的乙酸乙酯沉淀颗粒，超声分散5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。其次倒去上层清液，将颗粒均匀分散在2倍初始样品体积的无水乙醇中，超声5min，以10000rpm的转速、25℃室温下离心5min。如此反复进行3次，完成对Fe3O4纳米颗粒的清洗。最后将样品分散在超纯水中，采用旋蒸(0.1MPa真空度、50℃、适宜的转速)将样品中的无水乙醇和乙酸乙酯去除，样品浓缩至400m1左右，得到PAA修饰的Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
后修饰步骤
(采用自动电位滴定仪滴定上述PAA修饰的Fe3O4纳米颗粒表面的羧基含量，按照磁颗粒羧基含量:EDC:NHS:DEAPA摩尔比为1:4:4:1计算出各组分的含量。)
首先称取EDC,NHS溶解在50mL超纯水中(先称EDC)。其次取50mL前述Fe3O4纳米颗粒的水分散液，倒入三口烧瓶中，开始机械搅拌，转速控制在250rpm左右。随后将EDC,NHS混合液倒入三口烧瓶中，200m1超纯水分两次洗加磁颗粒的量筒，200m1超纯水分两次洗加EDC,NHS的烧杯。最后用移液枪向三口烧瓶中加入DEAPA，除机械搅拌的口，另外两个口用塞子塞住。反应进行4h结束。
修饰后样品处理
将反应结束后的样品采用超滤处理，去除里面没有反应的EDC、NHS、DEAPA，即得到两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。制备所得的样品透射电镜(TEM)照片及其对应的粒径分布图见附图1和附图2，该样品的弛豫测试曲线见附图5，计算可得其R1为7.04(单位1/mM/s)，R2为34.71(单位1/mM/s)。
上述实施例的操作步骤中，可用硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种替代FeCl3；可用乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、三甘醇或四甘醇中的任一种替代将DEG(二甘醇)；其他条件保持不变，同样可以制备出两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的水分散液。
实施例6
表面结合位点大于2个/平方纳米的证明过程：
对于实施例3制备的数均分子量为5000的PAA修饰的Fe3O4纳米颗粒，在透射电子显微镜下观察颗粒的形貌和粒径大小，如图1，通过软件测量颗粒的粒径得到颗粒的粒径分布，如图2，相关统计数据总结在表1中，测得Fe3O4纳米颗粒的平均粒径为4.5纳米左右。
表1粒径统计数据
将上述PAA修饰的Fe3O4纳米颗粒水分散液冷冻干燥后，取5mg左右的冻干粉样品进行热失重分析，热失重曲线如图3所示。多次测试的数据汇总于表2中，测得1g Fe3O4含有1.611gPAA，折算成羧基基团含量为22.37mmol/g Fe3O4。进一步计算如下：
表2热失重数据
(1)颗粒中高分子的含量为：58.261/36.172＝1.611(w/w)，即1g Fe3O4含有1.611g的PAA高分子。
(2)颗粒修饰的PAA中羧基含量为(1.611/72)×1000＝22.37(mmol),即1gFe3O4含有22.37mmol的羧基基团。
再通过电导滴定法测得自由羧基的含量为18.68mmol/g Fe3O4，样品的典型电导滴定曲线见图4，多次测试结果汇总于表3。
表3自动酸碱滴定等当点汇总
表4羧基含量与Fe含量平均值汇总
以表4中样品数据，根据Fe含量可得出Fe3O4含量为：(6.28/56/3)×232＝8.672g/L。进而可得出自由羧基含量为：(0.162/8.672)×1000＝18.68mmol/g Fe3O4。
最后可以得出Fe3O4纳米颗粒表面结合的羧基基团结合位点的密度为22.37-18.68＝3.69mmol/g Fe3O4。根据Fe3O4颗粒的密度为5200kg/m3，Fe3O4纳米颗粒的平均粒径为4.5纳米，可以推算出Fe3O4纳米颗粒的表面积为2.56×1020nm2/gFe3O4。结合的羧基基团结合位点的密度为3.69×6.02×1023×10-3/2.56×1020＝8.7个/平方纳米，表面结合位点远大于2个/平方纳米。
实施例7
造影剂的制备
将实施例1-5中任一实施例所制备的两性离子修饰的超顺磁性磁Fe3O4纳米颗粒的水分散液，经冷冻干燥后得到两性离子聚电解质高分子修饰的Fe3O4固体颗粒，通过热失重分析精确测量固体颗粒的Fe3O4的含量，进一步折算成铁元素(Fe)的含量。根据上述测量所得的铁元素含量，按照铁元素的最终浓度(mol铁/升)，加入相应体积的高纯水。所述的铁元素的最终浓度为0.05-2mol铁/升，优选地，为0.1-0.5mol铁/升。对上述已经按照铁元素的最终浓度要求配置的两性离子聚电解质高分子修饰的Fe3O4固体颗粒与水的混合物进行超声分散，即制备出稳定分散的两性离子修饰的超顺磁性磁共振造影剂。
实施例8
磁共振血管成像
我们选用雄性新西兰白兔作为试验对象(2-3月龄，体重2.1～3.1kg)进行。检查时动物均接受腹腔麻醉。兔子仰卧位固定于兔板上，使用腹部表面线圈覆盖整个腹部，扫描范围包括腹主动脉全径。造影剂采用手工注入动物体内，剂量选择为40μmol/kg。扫描时，在完成常规定位扫描后，需在未注入造影剂时进行一次扫描，以提供靶血管区信号的基线水平，然后手工在2-3s内注入造影剂和2mL生理盐水，并同时启动扫描序列在0、19s和37s扫描3个回合，然后再在5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60min分时分别进行扫描。用1.5T(Magnetom avanto,Siemens AG,Erlangen,German)小角度激发梯度回波序列，并采用相同的FOV(162.5×200mm2)及矩阵(192×192)，以达到一致的空间分辨率(1×1×1mm3)。即可得到如图6是注射本发明制备的超顺磁性纳米颗粒后所得的磁共振成像图。如图7是超顺磁性纳米颗粒所做的磁共振血管成像信号图，SNR表示信噪比。曲线1是两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒的SNR随时间变化的曲线，曲线2是PAA修饰的超顺磁性纳米颗粒的SNR随时间变化的曲线，曲线3是临床上常用的磁共振造影剂马根维显的SNR随时间变化的曲线，从图中可以看出两性聚电解质修饰磁颗粒的血液循环时间显著延长。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种超顺磁性纳米颗粒，包括位于核心的氧化铁颗粒和修饰在所述氧化铁颗粒表面的两性离子聚电解质高分子，其特征在于，所述两性离子聚电解质高分子与所述氧化铁颗粒表面结合位点的密度高于2个位点/平方纳米；所述两性离子聚电解质高分子带有正电荷基团和负电荷基团，所述正电荷基团为季氨基，所述负电荷基团为羧基或磷酸基中的任一种；通过将铁盐中的铁离子在多元醇中和所述两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团结合，以氢氧化钠为沉淀剂还原沉淀与所述两性离子聚电解质高分子结合的所述铁离子，得到所述超顺磁性纳米颗粒，具体包括：如下步骤：
a)将所述铁盐和所述两性离子聚电解质高分子溶解于所述多元醇中，充分混合使所述铁盐中的铁离子与所述两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团结合，得到溶液a；
b)将所述氢氧化钠溶解于所述多元醇中得到溶液b；
c)将所述溶液a加热到180-250℃，回流，得到溶液c；
d)将所述溶液b加入到所述溶液c之中，加热到180-250℃，回流，得到溶液d；
e)将所述溶液d冷却到室温后，加入乙酸乙酯絮凝沉淀，然后加入无水乙醇分离沉淀物，得到所述两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒；所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为1-80纳米；所述两性离子聚电解质高分子为pCBMA或pPCMA。
2.如权利要求1所述的超顺磁性纳米颗粒，其特征在于，所述两性离子聚电解质高分子的数均分子量在1000-10000之间。
3.一种制备如权利要求1或2所述的超顺磁性纳米颗粒的方法，其特征在于，将铁盐中的铁离子在多元醇中和两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团结合，以氢氧化钠为沉淀剂还原沉淀与所述两性离子聚电解质高分子结合的所述铁离子，得到表面结合位点密度高于2个位点/平方纳米的所述两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒；
具体包括如下步骤：
a)将所述铁盐和所述两性离子聚电解质高分子溶解于所述多元醇中，充分混合使所述铁盐中的铁离子与所述两性离子聚电解质高分子中的负电荷基团结合，得到溶液a；
b)将所述氢氧化钠溶解于所述多元醇中得到溶液b；
c)将所述溶液a加热到180-250℃，回流，得到溶液c；
d)将所述溶液b加入到所述溶液c之中，加热到180-250℃，回流，得到溶液d；
e)将所述溶液d冷却到室温后，加入乙酸乙酯絮凝沉淀，然后加入无水乙醇分离沉淀物，得到所述两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性纳米颗粒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述两性离子聚电解质高分子包括pPCMA或pCBMA中的任一种。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述铁盐为无水氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的任一种。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多元醇为乙二醇、一缩二乙二醇、丙二醇、异丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇或四甘醇中的任一种。
7.一种超顺磁性磁共振造影剂，其特征在于，所述造影剂包含如权利要求1所述的超顺磁性纳米颗粒。
8.一种制备如权利要求7所述的造影剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述超顺磁性纳米颗粒分散于水溶液中形成稳定的分散体系，得到两性离子聚电解质高分子修饰的超顺磁性磁共振造影剂。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述分散体系中所述超顺磁性纳米颗粒的浓度为0.05-2mol铁/升。
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