CN101612541B - 聚丙烯酸包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

聚丙烯酸(PAA)包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的制备及其应用，属于纳米材料和生物工程技术领域。本发明包括PAA四氧化三铁磁性纳米粒子的制备方法以及PAA四氧化三铁磁性纳米粒子用于细胞DNA的提取纯化。本发明提供了一种高温分解法制备PAA四氧化三铁磁性纳米粒子的方法，制备的磁性纳米粒子用于细胞DNA高效提取纯化，大大提高提取率，且操作更加简便。建立在磁性纳米粒子基础上的DNA纯化方法无论是分离效率还是DNA收率都不逊于传统方法。

Description

聚丙烯酸包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的制备及其应用

技术领域

一种聚丙烯酸(PAA)包覆的四氧化三铁磁性纳米粒子的制备方法及其应用，属于纳米材料和生物工程技术领域。

背景技术

四氧化三铁磁性纳米粒子毒性低，具有磁响应性，当粒径足够小时，具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁性，撤离磁场时，磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化。

经PAA包覆的四氧化三铁磁性纳米粒子，可以使其既具有磁性和水溶性，又具有表面活性基团，能进一步和细胞、酶、蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶联。在外加磁场的作用下，磁性纳米粒子能够很方便地和底液分离，具有操作简便和分离效率高的优点。此外，PAA四氧化三铁磁性纳米粒子具有大的比表面积，为修饰多种高密度分子探针提供了基础，在细胞分离、蛋白质纯化及DNA分离检测等领域显示出广阔的应用前景。

总的来说，磁性纳米粒子的制备方法可以分为物理法、生物法和化学法。其中物理法以机械球磨法为主要代表，球磨法是将微米或亚微米的粒子进行长时间研磨，然后分散到油基介质中而得，这种制备方法得到的粒子的粒径分布比较宽，同时这种制备方法所消耗的时间也比较长。磁性纳米粒子的生物制备法主要是指磁性纳米粒子广泛地存在于各种生物体如细菌，鸽子等体内，利用生物法制备的粒子粒径比较均一且形貌规则，缺点在于细菌培养较为困难，粒子提取的过程也较为繁琐。所以目前来说，对于研究磁性纳米粒子的合成主要还限于化学法制备的磁性纳米粒子，磁性纳米材料的化学合成法又可以分为均相制备法和非均相制备法，其中均相制备法包括共沉淀法和高温分解法，非均相制备方法有微乳液法、溶胶-凝胶法、超声化学法、激光分解法和电化学沉积法等。

本发明采用高温分解法研制粒径均一、磁响应性强的生物相容性PAA四氧化三铁磁性纳米粒子，应用于细胞DNA的提取纯化。

传统的DNA分离纯化方法不仅需接触多种有机溶剂和有毒试剂，而且步骤繁杂难以控制。PAA四氧化三铁磁性纳米粒子可以通过其表面羧基与DNA分子结合，再用缓冲液洗脱即可得到纯化率较高的DNA分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PAA四氧化三铁磁性纳米粒子的制备方法，制备的粒子粒径均一、磁响应性强，具有良好的生物相容性，可用于细胞DNA的提取纯化，操作方法简便易行。

本发明的技术方案：一种聚丙烯酸PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的制备方法，采用高温分解法合成，化学反应流程为：

FeCl₃→Fe(OH)₃→Fe(OH)₂→Fe₃O₄

步骤如下：

(1)称量100mmol的NaOH溶于20mL二甘醇(DEG)中，在氮气保护下油浴120℃加热1h，搅拌使NaOH全部溶解，得到淡黄色胶状NaOH的DEG液体，70℃密封保存；

(2)称量10mmol的PAA和4mmol FeCl₃粉末，溶于20mL DEG中，氮气保护下油浴220℃加热回流2h后，加入15mL NaOH的DEG液体，继续220℃加热回流反应2h，得到黑色粘稠的胶体液，终止反应，静置冷却，得反应液；

(3)取反应液于离心管中，加入5倍反应液体积的无水乙醇，8000rpm离心5min，重复洗涤3次，沉淀用去离子水洗涤2次，分散于反应液相等体积的去离子水中；

(4)用0.22μm膜过滤，制得聚丙烯酸包覆四氧化三铁磁性纳米粒子。

本方法制备的PAA四氧化三铁磁性纳米粒子为球形，平均粒径在10nm左右，磁响应性强，分散性好，在水和生理盐水中较稳定。

制备得到的PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的应用，用于细胞DNA的分离纯化，步骤如下：

(1)2mL细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加生理盐水5mL，离心2次；

(2)离心后的细胞加5μL细胞裂解液(3M NaCl、5M尿素Urea、40g/L TritonX-100、10mM乙二胺四乙酸EDTA、pH6.5的25mM Tris-HCl)混匀，加25μg/μL的蛋白酶K 10μL及40μg/μL的RNA酶5μL，37℃孵育30min，加入18mg/mL的PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子10μL，静置2min，加异丙醇静置2min，磁分离，加质量浓度70％乙醇，磁分离，弃上清，加Tris-EDTA缓冲液，孵育5min，磁分离，取上清，即为DNA洗脱液；

(3)紫外测得OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，并取2μL琼脂糖凝胶电泳。

PAA四氧化三铁磁性纳米粒子用于细胞DNA的提取纯化，减少有机溶剂的使用，与传统的DNA分离方法相比克服了接触有毒试剂、步骤复杂、费时、费力等缺点。

本发明的有益效果：本发明提供了一种高温分解法制备PAA四氧化三铁磁性纳米粒子，制备的磁性纳米粒子用于细胞DNA高效提取纯化，大大提高了提取率，操作更加简便。建立在磁性纳米粒子基础上的DNA纯化方法无论是分离效率还是DNA收率都不逊于传统方法。

附图说明

图1PAA四氧化三铁磁性纳米粒子的透射电镜图。

具体实施方式

实施例1 PAA四氧化三铁磁性纳米粒子的制备

采用高温分解法合成，其化学反应为：

FeCl₃→Fe(OH)₃→Fe(OH)₂→Fe₃O₄

步骤如下：

(1)称量4g NaOH(100mmol)溶于20mL二甘醇(DEG)中，在氮气保护下油浴120℃加热1h，搅拌使NaOH全部溶解，得到淡黄色胶状液，水浴70℃密封保存。

(2)称量720mg PAA(10mmol)和648.84mg FeCl₃(4mmol)粉末，溶于20mLDEG中，氮气保护下油浴220℃加热回流2h后，加入已制备保存的15mL NaOH的DEG液体，继续加热回流反应2h，得到黑色粘稠的胶体液，终止反应，静置冷却。

(3)取2mL反应液于离心管中，加入10mL无水乙醇，8000rpm离心5min，洗涤3次，沉淀用去离子水洗涤2次，分散于2mL去离子水中。

(4)0.22μm膜过滤。

上述方法制备的PAA四氧化三铁磁性纳米粒子为球形，平均粒径在10nm左右，磁响应性强，分散性好，在水和生理盐水中较稳定。可用于细胞DNA的分离纯化。

实施例2细胞DNA的提取纯化

步骤如下：

(1)2mL细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加5mL生理盐水，离心2次；

(2)离心后的细胞加5μL细胞裂解液(3M NaCl、5M Urea、40g/L TritonX-100、10mM EDTA、pH6.5的25mM Tris-HCl)混匀，加10μL蛋白酶K(25μg/μL)及5μL RNA酶(40μg/μL)，37℃孵育30min，加入10μL磁性粒子(18mg/mL)静置2min，加异丙醇20μL静置2min，磁分离，加70％乙醇20μL，磁分离，弃上清，加Tris-EDTA缓冲液20μL，37℃孵育5min，磁分离，取上清，即为DNA洗脱液。

(3)紫外测得OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，并取2μL琼脂糖凝胶电泳。

Claims (1)

1.聚丙烯酸PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的应用，其特征在于用于细胞DNA的分离纯化，步骤如下：

(1)2mL细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加生理盐水5mL，离心2次；

(2)离心后的细胞加5μL细胞裂解液混匀，细胞裂解液组成为：含3M NaCl、5M尿素、40g/L Triton X-100、10mM乙二胺四乙酸、pH 6.5的25mM Tris-HCl缓冲液，加25μg/μL的蛋白酶K 10μL及40μg/μL的RNA酶5μL，37℃孵育30min，加入18mg/mL的PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子10μL，静置2min，加异丙醇20μL静置2min，磁分离，加质量浓度70％的乙醇20μL，磁分离，弃上清，加Tris-EDTA缓冲液20μL，37℃孵育5min，磁分离，取上清，即为DNA洗脱液；

所述PAA包覆四氧化三铁磁性纳米粒子的制备步骤为：

(a)称量100mmol的NaOH溶于20mL二甘醇DEG中，在氮气保护下油浴120℃加热1h，搅拌使NaOH全部溶解，得到淡黄色胶状NaOH的DEG液体，70℃密封保存；

(b)称量10mmol的PAA和4mmol FeCl₃粉末，溶于20mL DEG中，氮气保护下油浴220℃加热回流2h后，加入15mL NaOH的DEG液体，继续220℃加热回流反应2h，得到黑色粘稠的胶体液，终止反应，静置冷却，得反应液；

(c)取反应液于离心管中，加入5倍反应液体积的无水乙醇，8000rpm离心5min，重复洗涤3次，沉淀用去离子水洗涤2次，分散于反应液相等体积的去离子水中；

(d)用0.22μm膜过滤，制得聚丙烯酸包覆四氧化三铁磁性纳米粒子；

(3)紫外测得OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，并取2μL琼脂糖凝胶电泳。

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