CN1421455A - 采用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒快速抽提纯化dna的方法 - Google Patents
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Abstract
采用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒快速抽提纯化DNA的方法，以带正电荷且具磁性的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒为载体，直接与组织裂解液或细胞裂解液相互作用，带正电荷的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒与组织裂解液或细胞裂解液中带负电荷的DNA通过静电作用形成纳米颗粒－DNA复合物，在外磁场作用下实现纳米颗粒－DNA复合物与组织裂解液或细胞裂解液的分离，再通过解离液将结合在纳米颗粒表面的DNA解离下来，从而实现DNA的快速抽提纯化。该方法不需用酚/氯仿抽提法除去核酸溶液中的蛋白质，简化了步骤，提高了效率，同时免去酚/氯仿对环境的污染和对人体的毒害作用；该方法为基因转导、突变检测、基因诊断和治疗等研究和应用中DNA的纯化提供了一种新手段。
Description
技术领域：本发明涉及纳米材料的应用领域和纳米生物学领域，尤其涉及到纳米颗粒在分子生物学中对DNA的快速抽提纯化的应用开发。
背景技术：随着人类基因组计划的完成，当代生物学、医学等已深入到分子水平，对所利用的进行高效分离、富集、提取、转载的DNA生物大分子的需求也日益提高。然而目前常用的DNA提取纯化方法都因存在自身缺陷而无法满足人们进行深入实验的要求。酚/氯仿抽提法曾经是分子生物学中经典的提取DNA方法，但由于酚/氯仿对人体的巨大毒害作用和对环境的强烈污染，在提倡绿色环保的今天将会大大局限其的应用范围。现时市场上的DNA抽提试剂盒由于操作步骤比较复杂、原料需要预处理、且原料自身理化性能不强造成产率不高等而无法满足人们的要求。
发明内容：针对现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种采用价廉易制、在中性溶液中呈正值动电位、具理化稳定性的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒快速简洁抽提纯化DNA的方法。
本发明的技术方案是以带正电荷的具有磁性的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒为载体，直接与组织裂解液或细胞裂解液相互作用，带正电荷的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒与组织裂解液或细胞裂解液中带负电荷的DNA通过静电作用形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物，在外磁场的作用下实现氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物与组织裂解液或细胞裂解液的分离，再通过解离液将结合在氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒表面的DNA解离下来，从而实现对DNA的快速纯化，建立一种新的基于二氧化硅壳磁性纳米颗粒的DNA快速提取纯化方法。
该方法不需要采用酚/氯仿抽提法除去核酸溶液中的蛋白质，简化了实验步骤，缩短了时间、提高了效率，同时免去了酚/氯仿对环境的污染和对人体的毒害作用；与现时市场上的DNA抽提试剂盒抽提纯化DNA相比，它不需要对氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒进行预处理；与羟基磷灰石柱层析纯化DNA相比，氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒具有巨大的比表面积，可提高纯化DNA的效率。该方法的建立为基因转导、突变检测、基因诊断和基因治疗等研究和应用中DNA的纯化提供了一种新的手段和快迅简洁的抽提纯化DNA方法。
附图说明：现结合附图对本发明做出说明。
图1为本发明所用的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒的动电位ζ与Ph值的曲线图。
图中：
二氧化硅纳米颗粒
二氧化硅磁纳米颗粒
四氧化三铁胶体纳米颗粒
氨基化二氧化硅磁纳米颗粒
该方法所采用的磁性纳米颗粒的等电点都在9.6左右，在pH中性的常温介质中，纳米颗粒表面的氨基质子化可有效地产生净正电，且电动电位高达35mv，可直接与组织或细胞裂解液相互作用，带正电荷的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒与组织或细胞裂解液中带负电荷的DNA通过静电作用以离子对形式形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物，通过利用内核的磁性作用，在外磁场的作用下即可实现氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物与组织或细胞裂解液快迅、简洁、高效地分离。
图2为小鼠的肝组织DNA的凝胶电泳图，是本发明的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒提取的DNA与常规法(酚/氯仿抽提法)提取DNA之间的比较。
图中(1)用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒抽提的DNA
(2)用二氧化硅纳米颗粒提取DNA(由于不具有正电荷，因此不能提取出来)
(3)用常规方法提取的DNA
显然，普通的二氧化硅纳米颗粒在中性环境下不带正电，不能提取DNA，而在中性环境下带正电荷的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒法可成功地提取DNA，与常规方法提取DNA相比，简化了抽提步骤，缩短了抽提时间、提高了抽提效率，同时免去了酚/氯仿对环境的污染和对人体的毒害作用。
具体实施方式：
1.裂解组织或细胞：取适量组织或细胞，加入适量抽提裂解液于冰上快速磨碎成组织液或细胞液后裂解3-5小时。
2.形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA的复合物：利用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒在pH中性的常温介质中，其表面的氨基质子化可有效地产生净正电，且电动电位高达35mv这一特性，在裂解后的组织或细胞液中加入适量经高温灭菌的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒，振荡混匀，于室温(15-25℃)充分结合5-30分钟，形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA的复合物。
3.分离收集氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物：利用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒的内核具有磁性的特点，在外加磁场作用下进行分离，收集氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物。
4.解离氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物上的DNA：在氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物中加入解离液(2-3mol/L的氯化纳溶液或pH10-12的缓冲溶液)，室温下放置5-30分钟，让DNA充分洗脱下来。在外磁场下静置5-20分钟，使氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒充分沉淀，DNA分布在上层澄清溶液中，收集上层澄清溶液，重复此步骤2-3次，确保氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒表面的DNA全部解离下来。
5.浓缩DNA产物：利用DNA在异丙醇中能够沉降析出的特性，往收集到的内含DNA的上层澄清溶液中加入适量的异丙醇，让其充分混合，于0℃到-20℃下放置10-15分钟，然后于4℃下12000g-15000g离心15-30分钟，使DNA从溶液中沉淀出来。
6.收集DNA：倒掉上层澄清溶液，用乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心，倒掉上层乙醇溶液，让残留的乙醇自然挥发干净，加入50微升pH为8.0的TE缓冲液溶解DNA沉淀，得到适合浓度的DNA溶液，于4℃下保存。
实施例(以提取小白鼠的肝组织为例)：采用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒从小白鼠的肝组织中快速抽提纯化DNA的方法
1.取1.302克小白鼠肝组织，加入18ml抽提裂解液，于冰上快速磨碎成匀浆液后于60℃下裂解4个小时成组织裂解液。
2.取500ul组织裂解液，加入1毫升20mg/mL经高温灭菌的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒，振荡，在室温下充分结合10-15分钟，形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物。
3.将氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物在外磁场下静置5分钟，使氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物充分沉淀，将上层澄清溶液倒掉，用超纯水洗涤1次，再次将氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物在外磁场下静置5分钟，将上层澄清溶液倒掉，收集氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物。
4.往氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物中加入500uL 2mol/L的氯化纳溶液重新悬浮氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物，振荡，于室温下放置5分钟，让DNA充分洗脱下来。在外磁场下充分沉淀氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒，收集上层澄清溶液。重复此步骤3次，确保氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒表面的DNA全部解离下来。
5.收集到的上层澄清溶液中加入1mL的异丙醇，让其充分混合，于0℃到-20℃下放置10分钟，然后离心15分钟，使DNA与溶液分层。
6.倒掉上层澄清溶液，得到DNA产物，用乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心，倒掉上层乙醇溶液，让残留的乙醇自然挥发干净，加入50微升pH为8.0的TE缓冲液溶解DNA沉淀，得到DNA溶液，于4℃下保存。
本发明中，所述氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒可用如下方法制得：
第一步首先制备纳米四氧化三铁胶体，即将20mL 1mol/L三氧化铁水溶液(现配)与5mL 2mol/L的二氯化铁溶液(用2mol/L盐酸配制)混合，加入250mL0.7mol/L的氨水，室温下搅拌半小时后，用磁铁分离，倒掉上清液。所得沉淀用30mL1mol/L四甲基氢氧化铵(TMA)溶解，然后加入二次蒸馏水至250mL。用孔径为40-80μm的砂芯漏斗过滤，除去聚集的大颗粒。
第二步，将环己烷(7.5ml)、表面活性剂曲拉通X-100(TritonX-100)(1.8ml)和正己醇(1.8ml)(体积比约为4.2/1/1)，混合均匀，加入适量的水(360μL)作为分散相，搅拌5min后形成油包水的微胶囊，加入200μL纳米四氧化三铁胶体，搅拌均匀。再将100μL正硅酸乙酯(TEOS)和100μL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS)混合均匀(1/1，体积比)后加入到微胶囊体系中，搅拌均匀后，加入100μL的氨水催化它们在微胶囊中的同步水解，整个反应时间为24小时，反应完备后用丙酮破乳，在外磁场下收集颗粒。即可制备氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒。
本发明具有如下优点：
其一：该方法所采用的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒的等电点在9.6左右，在pH中性的常温介质中，氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒表面的氨基质子化可有效地产生净正电，且电动电位高达35mv，不需要对氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒再进行修饰。
其二：氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒直接与组织裂解液或细胞裂解液相互作用，通过静电作用以离子对形式形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物，在外磁场的作用下即可实现氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物与组织或细胞裂解液快速、简洁、高效地分离。
其三：该方法缩短了抽提时间、提高了抽提效率，同时免去了酚/氯仿对环境的污染和对人体的毒害作用。
其四：与基因组DNA抽提试剂盒抽提纯化DNA法和羟基磷灰石柱层析纯化DNA法相比，它不需要再对氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒进行预处理，且氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒具有巨大的比表面积，可提高抽提产物的产率。该方法的建立为基因转导、突变检测、基因诊断和基因治疗等研究和应用中DNA的纯化提供了一种新的手段和方法。
Claims (3)
1、一种采用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒快速抽提纯化DNA的方法，其特征在于：以带正电荷且具磁性的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒为载体，直接与组织裂解液或细胞裂解液相互作用，带正电荷的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒与组织裂解液或细胞裂解液中带负电荷的DNA通过静电作用形成纳米颗粒-DNA复合物，在外磁场的作用下实现纳米颗粒-DNA复合物与组织裂解液或细胞裂解液的分离，再通过解离液将结合在纳米颗粒表面的DNA解离下来，从而实现对DNA的快速抽提纯化。
2、根据权利要求1所述的采用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒快速抽提纯化DNA的方法，其特征在于其具体步骤为：
(1)裂解组织或细胞：取适量组织或细胞，加入适量抽提裂解液于冰上快速磨碎成组织液或细胞液后裂解3-5小时；
(2)形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物：利用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒在pH中性的常温介质中，其表面的氨基质子化可有效地产生净正电，且电动电位高达35mv这一特性，在裂解后的组织或细胞液中加入适量经高温灭菌的氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒，振荡混匀，于室温(15-25℃)充分结合5-30分钟，形成氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA的复合物；
(3)收集氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物：利用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒的内核具有磁性的特点，在外加磁场作用下进行分离，收集氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物；
(4)解离氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物上的DNA：在氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒-DNA复合物中加入解离液(2-3mol/L的氯化纳溶液或pH10-12的缓冲溶液)，室温下放置5-30分钟，让DNA充分洗脱下来，在外磁场下静置5-20分钟，使氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒充分沉淀，DNA分布在上层澄清溶液中，收集上层澄清溶液，重复此步骤2-3次，确保氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒表面的DNA全部解离下来；
(5)浓缩DNA产物：利用DNA在异丙醇中能够沉降析出的特性，往收集到的内含DNA的上层澄清溶液中加入适量的异丙醇，让其充分混合，于0℃到-20℃下放置10-15分钟，然后于4℃下12000g-15000g离心15-30分钟，使DNA从溶液中沉淀出来；
(6)收集DNA：倒掉上层澄清溶液，用乙醇洗涤DNA沉淀，再次离心，倒掉上层乙醇溶液，让残留的乙醇自然挥发干净，加入50微升pH为8.0的TE缓冲液溶解DNA沉淀，得到适合浓度的DNA溶液，于4℃下保存。
3、根据权利要求1或2所述的采用氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒快速抽提纯化DNA的方法，其特征在于所述氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒可用如下方法制得：
第一步首先制备纳米四氧化三铁胶体，即将20mL 1mol/L三氧化铁水溶液(现配)与5mL 2mol/L的二氯化铁溶液(用2mol/L盐酸配制)混合，加入250mL0.7mol/L的氨水，室温下搅拌半小时后，用磁铁分离，倒掉上清液，所得沉淀用30mL1mol/L四甲基氢氧化铵(TMA)溶解，然后加入二次蒸馏水至250mL，用孔径为40-80μm的砂芯漏斗过滤，除去聚集的大颗粒；
第二步，将环己烷(7.5ml)、表面活性剂曲拉通X-100(TritonX-100)(1.8ml)和正己醇(1.8ml)(体积比约为4.2/1/1)，混合均匀，加入适量的水(360μL)作为分散相，搅拌5min后形成油包水的微胶囊，加入200μL纳米四氧化三铁胶体，搅拌均匀；再将100μL正硅酸乙酯(TEOS)和100μL N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS)混合均匀(1/1，体积比)后加入到微胶囊体系中，搅拌均匀后，加入100μL的氨水催化它们在微胶囊中的同步水解，整个反应时间为24小时，反应完备后用丙酮破乳，在外磁场下收集颗粒，即可制备氨基化二氧化硅壳磁性纳米颗粒。
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